Mục đích:
Thí nghiệm nhằm phân lập và định danh sơ bộ các dòng nấm men trong men cơm rượu trên thị trường cho hiệu suất lên men cơm rượu cao.
Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên với 1 nhân tố và 2 lần lặp lại
Sơ đồ thí nghiệm
Hình 4. Quy trình phân lập các dòng nấm men từ 10 loại men cơm rượu trên thị trường Giải thích quy trình
Thí nghiệm được tiến hành với 10 mẫu men cơm rượu trên thị trường. Men cơm rượu sau khi mua về, được nghiền mịn, lấy 1 gam tăng sinh trong 100ml môi trường PG có bổ sung khoáng trong bình tam giác 250ml, để trên máy lắc 150 vòng/phút trong 48 giờ. Sau đó pha
Nghiền mịn Men cơm rượu
Môi trường PG
(có bổ sung khoáng) Tăng sinh
Cấy lên bề mặt đĩa Petri
Cấy chuyền và làm thuần
Kiểm tra độ thuần chủng (quan sát bằng kính hiển vi)
loãng mẫu 10-1,10-2, 10-3, 10-4, 10-5. Lấy 0,1 ml mẫu pha loãng 10-4, 10-5. Cấy trên bề mặt đĩa Petri có môi trường PGA bổ sung khoáng.
Sau 24 giờ nấm men phát triển thành khuẩn lạc, chọn những khuẩn lạc rời để cấy chuyền. Quan sát bằng mắt thường, chọn những khuẩn lạc riêng lẻ, khác nhau về hình dạng, kích thước hoặc màu sắc. Tiếp tục cấy chuyền vào từng đĩa môi trường, cuối cùng quan sát dưới kính hiển vi để xác định độ ròng và trữ giống trong ống nghiệm môi trường thạch nghiêng PGA bảo quản ở 4oC.
Kết quả thu nhận:
Mỗi mẫu men cơm rượu phân lập tối thiểu 2 dòng (khoảng 20 dòng)
3.3.2. Thí nghiệm 2: Tuyển chọn nấm men phân lập có hoạt tính lên men cao
Mục đích:
Chọn ra các dòng nấm men có hoạt lực lên men rượu cao từ các dòng nấm men được phân lập ở thí nghiệm 1.
- So sánh khả năng lên men của dòng nấm men phân lập bằng phương pháp chuông Durham Bố trí thí nghiệm:
Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên với 1 nhân tố khoảng 20 dòng nấm men phân lập được, lặp lại 3 lần. Thí nghiệm có 20 nghiệm thức và 20 x 3= 60 đơn vị thí nghiệm.
Hình 5. Quy trình thí nghiệm đo chiều cao cột khí sinh ra trong ống Durham
Tăng sinh mẫu Môi trường PG
(có bổ sung khoáng)
Lên men Nấm men
Cách tiến hành
Chuẩn bị giống chủng: giống chủng được nuôi trong môi trường PG trong bình tam giác loại 250 ml với thể tích môi trường nuôi cấylà 100ml, được đậy bằng nút gòn và nắp giấy, tiệt trùng ở 121oC trong 15 phút và để nguội 30 – 40oC, dùng que cấy chủng nấm men (lấy khoảng 1 đầu kim cấy) từ ống men giống đã được nuôi cấy trên môi trường PGA sau 2 ngày ủ ở 30oC. Bình môi trường sau khi chủng giống được đậy bằng nút gòn, nắp giấy và lắc qua đêm trên máy lắc trong 36 giờ, thu hoạch sử dụng ngay hoặc trữ trong tủ lạnh ở 4oC.
Sử dụng chai Durham (cấu tạo gồm: chai thủy tinh có nắp đậy và ống thủy tinh úp ngược) để khảo sát sự lên men của các dòng nấm men. Lấy 1 ml dịch huyền phù nấm men (với mật số 106 tế bào/ml) cho vào ống nghiệm có chứa 9ml dung dịch glucose 2% đã được khử trùng ở 1150C trong 10 phút. Vặn chặt nắp chai và lắc ngang cho nấm men phân tán đều. Đặt chai đứng sao cho bọt khí không còn trong ống thủy tinh úp ngược, ủ ở 30oC.
Kết quả thu nhận
Đo chiều cao cột khí CO2 sinh ra trong ống thủy tinh úp ngược tại các thời điểm: 6, 8, 10, 12, 14, 20 giờ ủ. Dòng nấm men có hoạt tính cao là dòng làm đầy cột khí CO2 nhanh nhất.
- So sánh khả năng khả năng lên men rượu của dòng nấm men trên môi trường MF7 (so sánh độ Brix, pH, độ cồn sau quá trình lên men)
Mục đích:
Thí nghiệm này nhằm xác định khả năng lên men rượu cao để tuyển chọn dòng nấm men làm nguồn giống chủng.
Bố trí thí nghiệm:
Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 1 nhân tố khoảng 20 dòng nấm men phân lập được, 3 lần lặp lại. Thí nghiệm có 20 nghiệm thức và 20 x 3= 60 đơn vị thí nghiệm.
Tăng sinh mẫu
Lên men (5 ngày)
Phân tích mẫu Lắc và ủ 36 giờ ở 30oC Môi trường PG (có bổ sung khoáng) Nấm men Môi trường MF7 Sơ đồ thí nghiệm:
Hình 6. Quy trình thí nghiệm so sánh độ Brix, pH, độ rượu các dòng nấm men đã phân lập
Cách tiến hành
Chủng men giống: sử dụng môi trường MF7 gồm dung dịch đường glucose 18,5%, (NH4)2SO4 0,65%; KH2PO4 0,3%, MgSO4 0,06%, CaCl2.2H2O 0,01%, yeast extract 0,4%, pepton 0,4%. Lấy 100 ml dịch môi trường MF7 cho vào bình tam giác loại 250 ml, được đậy bằng nút gòn và nắp giấy, tiệt trùng ở 115oC trong 10 phút. Dịch đường sau khi tiệt trùng được để nguội đến 30 – 40oC, chủng 1 ml dịch huyền phù nấm men (với mật số 107 tế bào/ml), lắc đều, thay nút gòn bằng nút waterlock và ủ 5 ngày ở 300oC trong điều kiện kỵ khí.
Kết quả thu nhận
- pH sau khi lên men - Độ Brix sau khi lên men
- Xác định hàm lượng rượu ethylic bằng phương pháp chưng cất (phương pháp chưng cất phụ lục).