2.2.1. Nguyên tắc cần lưu ý.
Trong nghiên cứu v s v thì các nguyên tắc vô trùng, các biện pháp khử trùng, tiệt trùng và phương pháp đánh dấu là rất quan trọng.
- Các nguyên tắc vô trùng khi nuôi cấy v s v
+ Không mở nút bông chỗ gió lùa, không nói chuyện. + Tiến hành cạnh ngọn lửa đèn cồn.
+ Động tác nhanh, dứt khoát.
+ Không chạm vào phần dưói của nút bông, không để nút bông xuống bàn. + Hơ miệng trên ngọn lửa đèn cồn trước và sau khi nuôi cấy.
- Các biện pháp tiệt trùng:
+ Định nghĩa: Tiệt trùng (Sterilization) là tiêu diệt tất cả các v s v và bất hoạt các virus.
+ Biện pháp: được dùng nhiều nhất để tiệt trùng là nhiệt độ, các tia bức xạ giàu năng lượng,hoá chất.. .Tiêu biểu là dùng nồi hấp (autoclave)
* Nguyên tắc: Tác dụng diệt v s v là nhờ hơi nước bão hoà ở t° >100°c thông thường để tiệt trùng cần duy trì ở 118°c (0,9 atm) trong 30 p h ú t.
* Áp dụng: dụng cụ kim loại, thuỷ tinh, bông, dung dịch chất lỏng. - Sử dụng tủ cấy vô trùng: Bật đèn tử ngoại 15 phút trước và sau nuôi cấy
- Nguyên tắc đánh dấu: Mục đích dễ nhận biết, dễ theo dõi, không bị mất dấu theo thời gian.
2.2.2. Phương pháp giữ giống
Giống có thể được giữ bằng nhiều phương pháp. Nhưng giữ giống trên môi trường thạch nghiêng là phương pháp được dùng phổ biến vì đơn giản. Tuy nhiên dễ bị giảm hoạt tính do đó ta cần cấy truyền theo lịch trình cách nhau khoảng 3-6 tháng và sàng lọc khi cần thiết.
Streptomyces 6.25 được cấy trên môi trường thạch nghiêng dùng để phân lập Streptomyces 6.25 (MT3), để trong tủ 30°c. Trong 5-7 ngày xuất hiện khuẩn lạc cho
các ống giống vào tủ lạnh bảo quản ở 2°c giữ giống, đem tiến hành các nghiên cứu tiếp theo.
2.2.3. Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương phápkhuyếch tán khuyếch tán
- Nguyên tắc: Mẫu khử được đặt trên hộp Petri có chứa vi sinh vật kiểm định. Kháng sinh từ mẫu khử khuếch tán vào môi trường thạch sẽ ức chế sự phát triển của v s v kiểm định tạo thành các vòng vô khuẩn (vô nấm).
- Tiến hành.
+ lấy một vòng que cấy v s v kiểm định cấy vào môi trường canh thang (ủ ở 37°c trong 18-24h đối với vi khuẩn) và môi trường Sabouraud lỏng (ủ ở 30°c trong 18-24h đối vói vi nấm) để tạo thành nhũ dịch v s v có nồng độ 10'6-10'7 tế bào/ ml.
+ Nhũ dịch v s v được cấy vào môi trường thạch thường (đối với vi khuẩn) và môi trường Sabouraud đặc (đối với vi nấm) với tỉ lệ 2,5:100 (105 tế bào/ml) lắc đều đổ vào các đĩa Petri với thể tích 20ml/lđĩa).
+ Đưa mẫu thử vào môi trường kiểm định: Có 3 cách;
□ Đặt khoanh giấy lọc: khoanh giấy lọc vô trùng (đường kính 6mm) đã tẩm mẫu thử được đặt theo sơ đồ định sẵn, trên môi trường kiểm định.
Áp dụng: thử hoạt tính của các dịch chiết kháng sinh dễ bay hơi.
□ Đục giếng thạch đường kính 6mm, nhỏ mẫu thử vào các giếng thạch . Áp dụng: Thử hoạt tính kháng sinh của dịch lên men.
□ Đặt khối thạch: Mẫu khử là khối thạch đường kính 6mm có chứa xạ khuẩn sinh kháng sinh được đặt lên bề mặt môi trường kiểm định.
- Nuôi cấy: Các đĩa petri trên được nuôi cấy ở t° 37°c (đối với vi khuẩn) hoặc 30°c (đối với vi nấm) trong 18-24h.
Mỗi mẫu được thử trên 3 đĩa đối vófi một loại v s v . Sau khi nuôi cấy đo đường kính vòng vô khuẩn bằng thước kẹp Pamer có độ chính xác 0,02mm. Kết quả được đánh giá dựa trên đường kính vòng vô khuẩn xử lý theo công thức:
D = i=i
n
n
Với: Dị là các đường kính vòng vô khuẩn (vô nấm) đo được. B: là đường kính vòng vô khuẩn (vô nấm) trung bình,
n: số thí nghiệm song song, s: độ lệch chuẩn có hiệu chỉnh.
2.2.4. Phương pháp cải tạo giống v s v
- Phương pháp chọn lọc ngẫu nhiên.
+ Pha hỗn dịch bão tử: lấy 1 vòng que cấy bào tử Streptomyces 6.25 cho vào ống nghiệm chứa 10ml nước vô trùng, lắc cho bào tử phân tán đều, thu được hỗn dịch bào tử có độ pha loãng 10'1, lấy lm l hỗn hợp bào tử này cho vào 9ml nước vô trùng thu được nồng độ 10'2, tiếp tục pha loãng thành nồng độ 10~6 .
+ Cấy bào tử:
Dùng Pipet vô trùng hút 0,lm l các mẫu hỗn dịch bào tử ở các độ pha loãng 10 4 đến 10'6, nhỏ lên bề mặt thạch của MT3 trong đĩa Petri.
Dùng que trang vô trùng dàn đều giọt hỗn dịch bào tử. Tiến hành làm 3 Petri cho mỗi độ pha loãng ủ các đĩa ở 30°c trong 6 ngày rồi lấy ra đem cấy vạch để thử hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khối thạch, 3 giống tốt nhất được nhân giống và giữ lại để chuẩn bị cho đột biến.
- Phương pháp đột biến bằng ánh sáng UV:
+ Pha hỗn dịch bào tử tương tự như phương pháp chọn lọc ngẫu nhiên 1 ml hỗn dịch bào tử này pha loãng đến nồng độ 10'6 làm mầu chứng, 9ml còn lại được đưa vào điã Petri vô trùng.
+ Chiếu ánh sáng u v với khoảng cách và thời gian thích hợp vào đĩa Petri để độ sống sót khoảng 1% sau đó để chỗ tối 2-3h rồi dùng Pipet lm l vô trùng pha loãng đến nồng độ 10'5
+ Cấy bào tử sau đột biến:
Tương tự như cấy bào tử ở chọn lọc ngẫu nhiên với mẫu thử là các bào tử sau đột biến ở độ pha loãng 10'4, 10'5, mẫu chứng ở nồng độ 10~6
Đếm khuẩn lạc, xác định % độ sống sót theo công thức.
% độ sống sót = ^ ỉ-x io o No
V ớ i:
No : Là số khuẩn lạc trong mẫu chứng.
Tiến hành sàng lọc vói các khuẩn lạc sau đột biến tương tự như phương pháp chọn lọc ngẫu nhiên.
Làm song song mẫu chứng.
% biến đổi hoạt tính được xác định theo công thức:
% biến đổi hoạt tính = = * 100
Do
Với:
Di Là đường kính vòng vô khuẩn trung bình của biến chủng thứ i, Do Là đường kính vòng vô khuẩn trung bình của mẫu chứng.
Dựa vào kết quả thu được lựa chọn ra các biến chủng có % biến đổi hoạt tính dương cao nhất để tiến hành các nghiên cứu tiếp theo.
2.2.5. Phương pháp xác định các môi trường nuôi cấy thích hợp
Streptomyces 6.25 được cấy theo nguyên tắc vô trùng trong tủ cấy vô trùng
trên 7 môi trường đặc MT1, MT2, MT3, MT4, MT5, MT6, MT7, ủ ở 30°c trong 6
ngày. Thử hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khối thạch. Mỗi môi trường làm 3 mẫu song song.
2.2.6. Phương pháp lên men gián đoạn.
Sau khi có kết quả xác định được các môi trường nuôi cấy bề mặt tối ưu cho việc sản xuất kháng sinh, ta dùng giống cấp 1 để lên men gián đoạn trong các môi trường dung dịch tương ứng.
- Tạo giống cấp 1:
Streptomyces 6.25 trên thạch nghiêng (MT3) đủ 6 ngày tuổi được cấy vô trùng
sang bình nón 500ml chứa 100ml MT3 dung dịch bằng 10ml nước cất vô trùng, lắc trên máy lắc tròn ở t° 30°c, tốc độ quay 180v/phút trong 48h.
Lên men tiến hành trên các môi trường dung dịch tương ứng với các môi trường bề mặt tạo kháng sinh tối ưu nhất.
Giống cấp 1 được cấy vào bình nón 500ml chứa 100ml môi trường lên men với tỷ lệ Vgiống: Vmôi trường =1:10
Các bình lên men được lắc ở 30°Cvói tốc độ 180v/phút trên máy lắc tròn trong 120h.
2.2.7. Phương pháp xác định kháng sinh ngoại bào, nội bào
Sau khi kết thúc dịch lên men ta lọc, tách riêng sinh khối và dịch lọc, ta phải xác định xem kháng sinh nằm trong dịch lọc hay sinh khối.
- Thử kháng sinh ngoại bào trong dịch lọc bằng phương pháp giếng thạch trên môi trường thạch thường có chứa v s v kiểm định.
- Thử kháng sinh nội bào: ta phải xác định được dung môi chiết kháng sinh thích hợp, ở pH chiết tối ưu để chiết được hết kháng sinh sang pha dung môi hữu cơ.
+ Dùng dung môi chiết thích hợp đã khảo sát ở trên để nghiền sinh khối (đã được rửa 3 lần bằng nước, và được sầy khô ở t°< 50°c để 24h) , xác định hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khoanh giấy lọc.
+ Phương pháp chiết bằng dung môi hữu cơ ở đây ta dùng phương pháp chiết một lần đối vói dịch lọc kháng sinh đã điều chỉnh ở pH 4,7,11 vói lần lượt với các dung môi hữu cơ ethylacetat, cloroform, n- butanol. Xác định xem dung môi chiết tối ưu và pH chiết tối ưu,
Dịch lọc và dung môi được cho vào bình gạn theo tỷ lệ Vdung môi: Vdịch lọc= 1/5. Lắc 1 phút, để phân lớp trong 1 h. Tách riêng dung môi và dịch lọc.
Hoạt tính, kháng sinh của dung môi và dịch lọc sau mỗi lần chiết được kiểm tra bằng phương pháp khoanh giấy lọc.
2.2.8. Phương pháp xác định tính bền của hoạt chất kháng sinh của dịch lên men.
* .Mục đích: Xác định pH bảo quản thích hợp.
Tiến hành: Dịch lọc được cho vào 11 ống nghiệm, mỗi ống 10ml, điều chỉnh pH trong các ống lân lượt từ 1 đến 11, bảo quản các ống ở điều kiện bình thường. Thử hoạt tính kháng khuẩn của các ống (sau khi điều chỉnh pH về trung tính) bằng phương pháp giếng thạch. Lần thứ nhất được tiến hành thử sau 1 ngày, lần thừ 2 được tiến hành sau 7 ngày.
* Thử thời gian bảo quản kháng sinh.
Dịch lọc và dịch chiết kháng sinh được bảo quản ở pH thích hợp trong tủ lạnh sau một thòi gian đựơc lấy ra thử hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp giếng thạch.
Mục đích: xác định độ bền vững của kháng sinh sau bảo quản, đây là tiêu chí quan trọng của kháng sinh.
2.2.9. Tách kháng sinh bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng.
Mục đích: Xác định thành phần các kháng sinh có trong dịch lọc.
Bản mỏng có kích thước thích hợp, được hoạt hoá ở 110°c trong 30 phút.
- Dung môi được pha theo đúng tỉ lệ và cho vào bình sắc ký (lớp dung môi không quá lcm).
- Dùng Micropipet đường kính 0,5mm chấm dung dịch sắc ký lên bản mỏng 15-20 lần để khô tự nhiên sau mỗi lần chấm hay cho vào tủ sấy ở nhiệt độ <50°c.
- Dùng Micropipet đường kính 0,5mm chấm dung dịch sắc ký lên bản mỏng 15-20 lần để khô tự nhiên sau mỗi lần chấm hay cho vào tủ sấy ở nhiệt độ <50°c.
- Đặt bản mỏng vào bình sắc ký theo quy định cho dung môi chạy 3/4 bản mỏng, lấy ra đánh dấu vết dung môi chạy (Ddm), sấy khô bản mỏng xác định vết bằng các phương pháp tiếp theo.
+ Soi đèn tử ngoại: bản mỏng sắc ký tráng sẵn đã được trộn vófi 1 chất có huỳnh quang dưới ánh sáng tử ngoại, khi soi đèn tử ngoại vết chất thử sẽ sẫm màu trên đèn huỳnh quang.
+ Phương pháp hiện hình VSV: Đặt bản mỏng sắc ký vào đĩa petri vô trùng đổ môi trường thạch đã cấy v s v kiểm định phủ lên bề mặt của bản mỏng, ủ 18-24h ở
37°c. vòng vô khuẩn xuất hiện nếu có kháng sinh.
+ Phương pháp hiện màu hoá học: Bản mỏng được phun thuốc thử hiện màu, sấy ở t° 100°c trong 10 phút để phát hiện vết.
+ Tính Rf: Rf = \
a: Quãng đường vết hoạt chất di chuyển được. b: Quãng đường dung môi di chuyển được.
2.2.10. Phương pháp phân loại theo ISP
* Chuẩn bị giống gốc Streptomyces 6.25 được phân lập, nguyên gốc. * Xác định đặc điểm hình thái và sắc tố:
- Môi trường xác định: ISP1, ISP2, ISP3, ISP4 đã được hấp tiệt trùng đổ vào hộp Petri, môi trường làm 4 đĩa, cấy zigzac bào tử của Streptomyces 6.25 lên bề mặt thạch, ủ ở 30°c, tiến hành quan sát sau khi nuôi cấy 7, 14, 21ngày.
- Các đặc điểm cần chú ý:
+ Màu của bề mặt khuẩn lạc: Quan sát trực tiếp bề mặt khuẩn lạc. +Màu của khuẩn ty cơ chất: Quan sát mặt sau của bề mặt khuẩn lạc.
+ Chuỗi bào tử và bề mặt chuỗi bào tử được quan sát dưới kính hiển vi điện tử độ phóng đại cao.
* Dạng chuỗi bào tử: thẳng, uốn cong (RF), móc câu (RA), xoắn ốc lò so (S). Nếu chuỗi bào tử có nhiều đặc điểm thì ghi đầy đủ (ví dụ SRA). Nếu dạng chuỗi bào tử mọc thành vòng đơn không xoắn, vòng đơn có xoắn, vòng đôi không xoắn, vòng đôi có xoắn thì ký hiệu chung là (V).
* Bề mặt bào tử có dạng sau: Phẳng nhẵn (sm), gai (Sp), mụn cơm (wa), tóc (ha).
+ Sắc tố hoà tan: nằm trong môi trường có màu đen, màu đỏ, vàng, xanh lá cây, xanh da trời, màu nâu, tím.
* Xác định sắc tố melanoid: nuôi cấy trên môi trường ISP6 , ISP7 phát hiện sắc melanoid ở ngày thứ 2, ngày thứ 4. Nếu có ký hiệu là (1) nếu không ký hiệu là (0).
* Khả năng tiêu thụ nguồn carbon: Nuôi cấy chủng trên các môi trường ISP9, đánh giá ở ngày thứ 7, 14, 21, nếu mọc mạnh hơn đáng kể trên môi trường chứa đường glucose thì đánh dấu (++), nếu xạ khuẩn phát triển tương đương vói xạ khuẩn trên môi trường chứa đường glucose thì đánh dấu (+), nếu môi trường cấy xạ khuẩn phát triển yếu hơn đáng kể so vói xạ khuẩn phát triển trên môi trường chứa đường glucose nhưng phát triển mạnh hơn mẫu chứng thì đánh dấu (±), nếu môi trường có xạ khuẩn phát triển yếu hơn hoặc bằng xạ khuẩn phát triển trên mẫu chứng thì đánh dấu (-).
2.3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN2.3.1 Kết quả phân loại 2.3.1 Kết quả phân loại
Sau khi nuôi cấy trên các môi trường ISP, so sánh đặc trưng của Streptomyces
6.25 và Streptomyces actuosus ta được kết quả như sau:
Bảng 3: Các đặc trưng của Streptomyces 6.25 và Streptomyces actuosus
Đặc điểm Streptomyces 6.25 Streptomyces actuosus
Màu khuẩn lạc Gy (w)- xám, trắng Gy- Xám
Melanoid 1 1
Màu khuẩn ty cơ chất 0 0
Sắc tố hoà tan 0 0
Chuỗi bào tử RF- uốn cong RF- uốn cong
Bề mặt bào tử Sm-nhẵn Sm-nhẩn Arabinose + + Xylose + + Inositol + + Manitol + + Frustose + + Rhamnose + + Saccarose ± + Rafinose + +
Từ kết quả trên về căn bản ta có thể kết luận Streptomyces 6.25 có tên khoa học là
2.3.2. Thử hoạt tính kháng sinh của Streptomyces 6.25 trên môi trường phân lập (MT3):
sau khi phân lập và thử hoạt tính kháng sinh của Streptomyces 6.25 thu được các kết quả được giới thiệu ở bảng 4
Bảng 4: Kết quả sơ bộ thử hoạt tính của Streptomyces 6.25
Vi khuẩn kiểm định Đường kính vòng vô khuẩn
Gram (+ ) Gram (-)
Be Bp Bs SI Sta Ec Pr Pseu Shi Typs
D (m m ) 13,82 19,84 17,02 21,52 16,52 13,64 16,46 14,14 16,62 14,04
2.3.3. Kết quả chọn môi trường nuôi cấy thích hợp
Để chọn mồi trường nuôi cấy cho kháng sinh tối ưu, và chọn 2 chủng Gram (-), Gram (+) đại diện cho các nghiên cứu tiếp theo.
Bảng 5: Kết quả chọn môi trường nuôi cấy thích hợp
Gram (+) Gram (-)
Vv\ V i khuẩn Môi tr ư ờ n £ \^
Be Bp Bs Sta SI Ec Pseu Pr Sal Shi
MT1 D(mm) 18,53 18,85 10,26 12,26 16,09 12,80 14,56 19,18 11,60 13,59 s 0,51 1,47 0,19 0,57 0,98 0,57 0,62 1,87 0,46 0,83 MT2 D(mm) 18,62 19,00 10,01 10,30 15,50 11,31 12,94 17,95 9,97 13,69 s 0,02 1,26 0,92 0,51 0,04 1,09 0,68 1,26 0,85 1,20 MT3 D(mm) 17,75 18,85 10,00 11,05 15,20 11,99 13,65 19,18 10,30 15,52 s 0,35 1,30 0,64 0,58 1,27 0,30 0,33 0,45 0,48 0,31 MT4 D(mm) 17,21 19,67 11,39 10,06 17,96 L4,22 13,62 >1,24 10,03 15,11 s 0,86 1,17 0,55 0,83 1,20 1,24 1,20 0,20 0,60 1,40 MT5 D(mm) 19,42 18,80 10,60 12,49 19,25 12,00 14,3 19,00 12,40 15,44 s 0,03 1,83 0,96 0,53 1,06 1,03 0,99 1,24 0,62 1,29 MT7 D(mm) 15,36 16,90 10,00 12,89 15,93 11,15 14,10 20,60 10,51 11,95 s 0,51 1,24 0,41 0,77 1,16 1,63 0,82 1,19 0,60 1,03
Dựa vào bảng trên ta thấy xạ khuẩn không phát triển được trên MT6. Sinh kháng sinh tốt nhất trên MT4 ,MT5, MT3.
- Ta thấy Proteus mirabilis là vi khuẩn gram (-) nhạy cảm nhất, và Bacillus
pumilus là vi khuẩn gram (+) nhạy cảm nhất với Kháng sinh tiết ra từ Streptomyces 625 nên chọn 2 chủng này là vi khuẩn kiểm định cho các
nghiên cứu tiếp theo.
2.3.4. Các kết quả chọn lọc ngẫu nhiên.
Các kết quả thể hiện ở bảng 6 (Hình 9,phần phụ lục 2).
Bảng 6: Các kết quả chọn lọc ngẫu nhiên
Ký hiệu chủng Kết quả Ký hiệu chủng Kết quả BP Pr Bp Pr