3.3.1 Quy trình thí nghiệm
Hình 3.2 Quy trình thí nghiệm
Các thí nghiệm đƣợc bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên. Mỗi thí nghiệm đƣợc lặp lại 3 lần. Thông số tối ƣu của thí nghiệm đƣợc chọn làm cơ sở để khảo sát cho thí nghiệm tiếp theo.
Thuyết minh quy trình:
Hai giống nếp than và nếp trắng đƣợc chọn để tiến hành thí nghiệm này. Gạo lứt thu đƣợc sau quá trình xay xát đƣợc rửa sạch trong nƣớc để loại bỏ tạp chất và một số vi sinh vật bám trên bề mặt hạt. Sau đó, ngâm hạt trong nƣớc cất và các dung dịch có pH khác nhau cho đến khi đạt trạng thái cân bằng ẩm thì vớt ra để ráo nƣớc. Sau đó tiến hành ủ hạt trong điều kiện hàm lƣợng CO2 khác nhau ở nhiệt độ 370C cho đến khi hạt nảy mầm trong các khoảng thời gian khác nhau.
Gạo lứt (2 giống khác nhau) Rửa sạch tạp chất Ngâm trong nƣớc Làm ráo nƣớc Ủ Sấy khô Bảo quản
Sau khi kết thúc quá trình nảy mầm, hạt đƣợc sấy khô ở các chế độ nhiệt độ khác nhau đến độ ẩm an toàn < 13% và cho vào bao bì để bảo quản.
3.3.2 Phƣơng pháp bố trí thí nghiệm
Các thí nghiệm đƣợc bố trí ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại. Kết quả tối ƣu của thí nghiệm trƣớc sẽ đƣợc chọn để thực hiện cho các thí nghiệm sau. Các thí nghiệm đều đƣợc thực hiện tƣơng tự trên cả hai giống nếp với cùng các điều kiện thí nghiệm nhằm đƣa ra sự so sánh chọn lựa giống điều kiện tốt nhất.
3.4 TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM
3.4.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ và pH tối ƣu đến hoạt tính enzyme phytase trong nguyên liệu gạo lứt tính enzyme phytase trong nguyên liệu gạo lứt
a) Mục đích
Xác định nhiệt độ và pH tối ƣu của enzyme phytase.
b) Cách tiến hành
Trích dịch chiết enzyme trong nguyên liệu bằng các mức pH và nhiệt độ khác nhau. Tiến hành đo quang phổ với bƣớc sóng 700 nm.
c) Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm đƣợc bố trí 2 nhân tố với 2 lần lặp lại. Nhân tố A: nhiệt độ (0C) A1 = 30 A2 = 35 A3 = 40 A4 = 45 Nhân tố B: pH B1 = 4,5 B2 = 5,0 B3 = 5,5 Số đơn vị thí nghiệm: 3*4*2 = 24 (đvtn). Bảng bố trí thí nghiệm A1 A2 A3 A4 B1 A1 B1 A2 B1 A3 B1 A4 B1 B2 A1 B2 A2 B2 A3 B2 A4 B2 B3 A1 B3 A2 B3 A3 B3 A4 B3
d) Chỉ tiêu phân tích
Phân tích hoạt tính phytase, chọn pH và nhiệt độ tối ƣu của enzyme phytase sử dụng cho các thí nghiệm sau.
3.4.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát pH dung dịch ngâm ở điều kiện nhiệt độ phòng trong 6 giờ đến hàm lƣợng hợp chất chức năng sinh ra. trong 6 giờ đến hàm lƣợng hợp chất chức năng sinh ra.
a) Mục đích
Xác định pH dung dịch ngâm thích hợp để hàm lƣợng hợp chất chức năng sinh ra tối đa.
b) Cách tiến hành
Cân 100 g gạo lứt thu đƣợc sau quá trình tách vỏ, rửa sạch với nƣớc, tiến hành ngâm ngập tràn trong nƣớc cất và các dung dịch có pH khác nhau: 2, 3, 4, 5, 6, 7. Thể tích dịch ngâm là 300 ml, tiến hành ngâm trong thời gian 6 giờ.
c) Bối trí thí nghiệm
Thí nghiệm đƣợc tiến hành theo nhân tố pH dung dịch ngâm trên cả hai giống nếp.
Nhân tố C: pH dung dịch ngâm
C1 = nƣớc cất C2 = 2 C3 = 3 C4 = 4
C5 = 5 C6 = 6 C7 = 7
Sơ đồ bố trí thí nghiệm:
d) Chỉ tiêu phân tích
Xác định hàm lƣợng phytate, hoạt tính enzyme phytase.
3.4.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát điều kiện ủ CO2 ở nhiệt độ 370C đến hoạt tính enzyme phytase và hàm lƣợng phytate. enzyme phytase và hàm lƣợng phytate.
a) Mục đích
Xác định thành phần CO2 của môi trƣờng ủ đến sự nảy mầm và sự thay đổi hàm lƣợng phytate và hoạt tính enzyme phytase dựa trên sự hình thành các hợp chất chức năng mong muốn.
b) Cách tiến hành
Cân 100 g gạo lứt đƣợc rửa sạch bằng nƣớc. Tiến hành ngâm trong dung dịch có pH tối thích từ thí nghiệm 2 trong thời gian 6 giờ. Sau đó tiến hành ủ trong điều kiện CO2 trong 16, 20, 24, 28, 32 giờ ở nhiệt độ 370C.
c) Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm thực hiện với sự kết hợp với hai nhân tố: nồng độ CO2, thời gian ủ trên 2 giống nếp.
Gạo lứt
Rửa sạch tạp chất
Ngâm
Nhân tố D: nồng độ CO2
D1 = 0% D2 = 3% D3 = 5% D4 = 7% D5 = 9% Nhân tố E: thời gian ủ (giờ)
E1 = 16 E2 = 20 E3 = 24 E4 = 28 E5 = 32 Số đơn vị thí nghiệm: 5*5*3 = 75 (đvtn) Bảng bố trí thí nghiệm D1 D2 D3 D4 D5 E1 D1 E1 D2 E1 D3 E1 D4 E1 D5 E1 E2 D1 E2 D2 E2 D3 E2 D4 E2 D5 E2 E3 D1 E3 D2 E3 D3 E3 D4 E3 D5 E3 E4 D1 E4 D2 E4 D3 E4 D4 E4 D5 E4 E5 D1 E5 D2 E5 D3 E5 D4 E5 D5 E5 d) Chỉ tiêu phân tích
CHƢƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1 ẢNH HƢỞNG CỦA pH VÀ NHIỆT ĐỘ LÊN HOẠT TÍNH CỦA ENZYME PHYTASE TRONG GẠO LỨT NGUYÊN LIỆU ENZYME PHYTASE TRONG GẠO LỨT NGUYÊN LIỆU
Theo Lê Ngọc Tú (2004), pH và nhiệt độ có ảnh hƣởng rất lớn đến hoạt tính cũng nhƣ tốc độ phản ứng của enzyme, mỗi loại enzyme đều có pH và nhiệt độ tối ƣu khác nhau, tại pH và nhiệt độ tối ƣu đó enzyme sẽ thể hiện hoạt tính cao nhất. Nếu nhƣ nhiệt độ quá cao cùng với pH không thích hợp thì enzyme sẽ bị mất hoạt tính, không phục hồi đƣợc. Chính vì vậy, mục đích của thí nghiệm này là xác định đƣợc pH và nhiệt độ tối ƣu của enzyme phytase trong gạo mầm của hai giống nếp than và nếp trắng.
Enzyme phytase là loại enzyme đƣợc hoạt hóa trong quá trình nảy mầm của gạo lứt nên tồn tại sẵn trong hạt gạo mầm, vì thế cần phải tách dịch chiết chứa enzyme phytase (lấy 1,5 g gạo lứt hòa với 20 ml dung dịch pH (4,5; 5,0; 5,5), lắc đều trong 1 giờ và lọc) và tiến hành thủy phân ở các nhiệt độ (30, 35, 40, 450
C) trong 30 phút, ngừng phản ứng, phản ứng màu và để yên trong 10 phút rồi đo quang phổ với bƣớc sóng 700 nm và xác định hoạt tính của enzyme phytase (U/kg). Thí nhiệm tiến hành với 2 nhân tố và 2 lần lặp lại, kết quả thí nghiệm đƣợc thể hiện trong Bảng 4.1, 4.2.
Bảng 4.1. Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của pH và nhiệt độ tối ƣu đến hoạt tính của enzyme phytase (U/kg) trong nếp than.
Nhiệt độ (0C) pH 4,5 5,0 5,5 Trung bình 30 203,86 209,46 203,57 205,63c 35 213,21 216,50 214,18 214,63a 40 209,38 210,98 208,83 209,73b 45 201,21 204,49 199,96 201,88d Trung bình 206,91b 210,36a 206,64b
Số liệu trong bảng là giá trị trung bình của 2 lần lặp lại
Các giá trị trung bình có cùng chữ cái đi kèm a, b, c,…trong cùng một cột, cùng một hàng thì không khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5%.
Bảng 4.2 Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của pH và nhiệt độ tối ƣu đến hoạt tính của enzyme phytase (U/kg) trong nếp trắng.
Nhiệt độ (0C) pH 4,5 5,0 5,5 Trung bình 30 205,10 207,30 205,15 205,85c 35 210,51 211,03 209,19 210,24a 40 208,65 210,12 207,05 208,61b 45 200,89 205,78 202,33 203,00d Trung bình 206,29b 208,56a 205,93b
Số liệu trong bảng là giá trị trung bình của 2 lần lặp lại
Các giá trị trung bình có cùng chữ cái đi kèm a, b, c,…trong cùng một cột, cùng một hàng thì không khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5%.
Thay đổi pH và nhiệt độ có ảnh hƣởng rất lớn đến khả năng thủy phân của enzyme phytase. Với nhiều nghiên cứu cho thấy rằng nếu tăng hoặc giảm giá trị pH đến một điểm xác định nào đó, vận tốc phản ứng của enzyme sẽ tăng dần và đạt đến điểm cực đại. Giá trị pH mà ở đó vận tốc phản ứng của enzyme đạt giá trị cực đại gọi là pH tối ƣu của hoạt động enzyme, vƣợt quá giới hạn pH này hoạt tính enzyme sẽ giảm (Nguyễn Đức Lƣợng và ctv, 2004).
Khi giá trị pH tăng dần từ 4,5 đến 5,5 thì hoạt tính enzyme phytase sẽ thay đổi cho dù ở bất kỳ một nhiệt độ nào. Kết quả thống kê ở Bảng 4.1, 4.2 cho thấy ở các mức pH khác nhau từ 4,5 đến 5,5 thì hoạt tính của enzyme phytase có sự khác biệt ý nghĩa 5%. Từ Bảng 4.1 và 4.2 cũng thấy rõ ở pH 4,5 không có sự khác biệt ý nghĩa với pH 5,5 ở cả hai giống nếp. Bên cạnh đó, pH 5,0 có sự khác biệt ý nghĩa ở mức 5% đối với pH 4,5; pH 5,5 và ở pH 5,0 enzyme phytase thể hiện hoạt tính mạnh hơn so với ở pH 4,5 và pH 5,5 nên pH tối ƣu cho hoạt động của enzyme phytase ở cả hai giống nếp là pH 5,5.
Ở pH cao hơn hoặc thấp hơn pH tối ƣu, hoạt tính của enzyme phytase đều giảm. Do đó, có thể nói rằng pH có ảnh hƣởng rất mạnh đến hoạt tính của enzyme phytase. Khi thay đổi pH môi trƣờng sẽ làm thay đổi khả năng ion hóa của enzyme và cơ chất do đó sẽ ảnh hƣởng đến khả năng tạo phức hợp ES làm giảm vận tốc phản ứng enzyme (Nguyễn Đức Lƣợng và ctv, 2004). Vì thế phải chọn pH tối ƣu cho enzyme hoạt động để đạt đƣợc hiểu quả cao nhất.
Ngoài pH thì nhiệt độ cũng ảnh hƣởng đến khả năng hoạt động cũng nhƣ hoạt tính của enzyme phytase. Sự gia tăng nhiệt độ sẽ làm tăng tốc độ phản ứng, vì các nguyên tử trong phân tử enzyme có năng lƣợng cao hơn và xu hƣớng lớn hơn để di chuyển. Tuy nhiên, nhiệt độ bị giới hạn trong một phạm vi sinh học bình thƣờng. Khi nhiệt độ tăng, sự biến tính nhiệt phá hủy các hoạt động của các phân tử enzyme. Điều này là do sự mở ra của chuỗi protein sau khi bị mất các liên kết yếu nhƣ liên kết hydro, vì thế vận tốc phản ứng bị giảm. Nhƣ vậy, về cơ bản tốc độ phản ứng xúc tác do enzyme tăng khi nhiệt độ tăng, tốc độ phản ứng tăng đến cực đại khi nhiệt độ tăng, sau đó bị giảm nếu tiếp tục tăng nhiệt độ (Nguyễn Công Hà và Lê Nguyễn Đoan Duy, 2011).
Kết quả thống kê cho thấy hoạt tính enzyme phytase ở hai giống nếp tăng khi nhiệt độ từ 300C đến 350
C và giảm nếu tiếp tục tăng nhiệt độ lên 450C. Vì bản chất của protein là không bền nhiệt, khi tăng nhiệt độ trong giai đoạn đầu của phản ứng enzyme sẽ làm tăng khả năng tạo cấu trúc không gian của enzyme sao cho phù hợp với cơ chất, khi vƣợt quá giới hạn về nhiệt độ thì cấu trúc không gian của trung tâm hoạt động trong enzyme không còn phù hợp với cấu trúc không gian của cơ chất nữa, khi đó hoạt tính của enzyme sẽ giảm dần và dẫn đến triệt tiêu (Nguyễn Đức Lƣợng và ctv., 2004). Tuy nhiên, khi xét về mặt thống kê thì ở nhiệt độ 350C có sự khác biệt với các nhiệt độ 300C, 400C, 450C và hoạt tính của enzyme cao nhất, nên 350C là nhiệt độ tối ƣu cho hoạt động của enzyme phytase trong gạo mầm.
Với thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng của pH và nhiệt độ lên hoạt tính enzyme phytase trong gạo mầm đến quá trình giải phóng phospho trong phytate đã xác định đƣợc pH và nhiệt độ tối ƣu cho hoạt động của enzyme phytase là pH 5 và nhiệt độ 350C.
4.2 ẢNH HƢỞNG CỦA pH DUNG DỊCH NGÂM GẠO LỨT ĐẾN HOẠT TÍNH ENZYME PHYTASE VÀ HÀM LƢỢNG PHYTATE. TÍNH ENZYME PHYTASE VÀ HÀM LƢỢNG PHYTATE.
Bảng 4.3 Thành phần nguyên liệu của nếp than và nếp trắng
Nguyên liệu Hàm lƣợng protein tổng (%) Hàm lƣợng lipid (%) Độ ẩm (%) Hàm lƣợng phytate (mg/100g) Hoạt tính enzyme phytase (U/kg) Nếp than 6,12 2,84 12,47 740,96 216,50 Nếp trắng 8,09 2,65 12,26 508,77 211,03
Thời gian ngâm hạt có ảnh hƣởng và quyết định đến chất lƣợng hạt cũng nhƣ thành phần chức năng sinh ra. Ở giai đoạn đầu của quá trình ngâm gạo lứt độ ẩm tăng rất nhanh, do lúc này chênh lệch giữa độ ẩm trong hạt và bên ngoài hạt cao nên độ ẩm đƣợc chuyển nhanh vào trong hạt, từ 3 – 6 giờ độ ẩm của hạt gạo bắt đầu tăng chậm dần và gần đạt đến trạng thái bão hòa do lúc này các phân tử tinh bột hút nƣớc trƣơng nở làm khoảng cách giữa các phân tử nhỏ lại nên hút nƣớc chậm lại. Từ 6 giờ trở đi độ ẩm của hạt tăng không đáng kể, hạt hút ẩm đạt trạng thái gần nhƣ bão hòa. Thời gian ngâm 6 giờ là thời gian hạt hút nƣớc bão hòa tốt nhất, vì nếu ngâm hạt càng lâu trong nƣớc sẽ làm mất nhiều các chất dinh dƣỡng tan trong nƣớc và tạo điều kiện cho sự phát triển của vi sinh vật.
Bảng 4.4. Hoạt tính enzyme phytase của hai giống nếp than và nếp trắng khi ngâm trong pH dung dịch khác nhau trong 6 giờ ở nhiệt độ phòng (30±20C).
pH
Hoạt tính enzyme phytase (U/kg)
Nếp than Nếp trắng 2 265,94a 265,95a 3 248,44b 226,66b 4 233,48d 212,93c 5 236,32cd 227,47b 6 136,06e 131,32d 7 132,25e 121,54e Nƣớc cất 238,61c 226,04b
Ghi chú: các chữ cái in thường a – e biểu thị cho sự khác biệt với mức ý nghĩa 5%.
Theo kết quả thống kê cho thấy, hoạt tính enzyme phytase cao nhất của hai giống lúa nếp, đối với nếp than đạt cao nhất là 265,94 (U/kg), nếp trắng là 265,95 (U/kg) khi ngâm trong dung dịch pH 2. Đối với nếp than tăng 1,23 lần so và với nếp trắng tăng 1,26 lần so với nguyên liệu ban đầu.
Hoạt tính enzyme phytase của hai giống nếp khi ngâm trong pH 6 và 7 giảm so với nguyên liệu và các mẫu ngâm trong dung dịch pH khác. Ở pH 6 thì enzyme phytase giảm 0,63 lần đối với nếp than và giảm 0,62 lần đối với nếp trắng. Ở pH 7 thì enzyme phytase giảm 0,61 lần đối với nếp than và giảm 0,58 lần đối với nếp trắng. Theo Keqin et al. (2010) thì trong quá trình ngâm thì hoạt tính enzyme phytase giảm nhiều nhất ở pH 7. Sự giảm hoạt tính của enzyme có thể do tính
chất của màng tế bào hoặc những ảnh hƣởng của các con đƣờng trao đổi chất của hạt.
Bên cạnh đó sự tăng giảm hoạt tính enzyme phytase thì hàm lƣợng phytate cũng thay đổi trong quá trình ngâm hạt. Ngoài pH, hoạt tính enzyme còn bị ảnh hƣởng bởi giống nếp, do đặc tính khác nhau nên sự thay đổi hoạt tính enzyme phytase ở hai giống là khác nhau với mức thống kê ý nghĩa 5%.
Bên cạnh sự thay đổi của enzyme phytase thì hàm lƣợng phytate trong gạo lứt sau quá trình ngâm ở các dung dịch pH ngâm khác nhau đƣợc thể hiện ở Bảng 4.5 nhƣ sau:
Bảng 4.5 Hàm lƣợng phytate của hai giống nếp than và nếp trắng khi ngâm trong pH dung dịch khác nhau trong 6 giờ ở nhiệt độ phòng (30±20C).
pH Hàm lƣợng phytate (mg/100g) Nếp than Nếp trắng 2 461,43a 412,23a 3 494,04a 464,61b 4 694,95c 520,62e 5 591,73b 495,72cd 6 706,65c 491,92cd 7 765,15d 483,12c Nƣớc cất 651,56c 505,12d
Ghi chú: các chữ cái in thường a – e biểu thị cho sự khác biệt với mức ý nghĩa 5%.
Sau quá trình ngâm hàm lƣợng phytate trong gạo lứt cả hai giống đều giảm so với nguyên liệu ban đầu, vì trong quá trình ngâm enzyme phytase đƣợc kích hoạt và phản ứng với phytate giải phóng phospho vô cơ và inositol. Cụ thể đối với nếp than hàm lƣợng phytate ban đầu là 740,96 mg/100g, sau quá trình ngâm giảm nhiều nhất ở pH 2 và 3 lần lƣợt là 461,43 và 494,04 mg/100g (giảm 0,38 và 0,33 lần) và tăng ít ở pH 7 là 756,15 mg/100g (tăng 1,03 lần). Đối với nếp trắng, hàm lƣợng phytate ban đầu là 508,77 mg/100g, sau quá trình ngâm thì hàm lƣợng phytate giảm nhiều nhất ở pH 2 là 412,23 mg/100g (giảm 0,19 lần) và ở dịch ngâm nƣớc cất thì hàm lƣợng phytate giảm không đáng kể, ở pH 4 thì tăng không đáng kể là 520,62 (tăng 1,02 lần). Ở pH 5, đối với nếp than thì hàm lƣợng phytate là 591,73 mg/100g (giảm 0,2 lần) và ở nếp trắng là 495,72 mg/100g (giảm 0,03