2.4.1 Enzyme amylase
Amylase, một loại enzyme có ý nghĩa về mặt sinh lý, thƣơng mại và lịch sử còn đƣợc gạo là diastase. Enzyme này có ở cả thực vật và động vật.
Amylase thuộc nhóm enzyme thủy phân, xúc tác sự phân giải các liên kết glucoside nội phân tử trong các polysaccharide với sự tham gia của nƣớc. Amylase thủy phân tinh bột, glycogen và dextrin thành glucose, maltose và dextrin hạn chế. Amylase trong nƣớc bọt còn đƣợc gọi là ptyalin. Amylase phân bố rộng rãi trong tự nhiên và là một trong những loại enzyme đƣợc ứng dụng rỗng rãi nhất trong công nghiệp, y tế và nhiều lĩnh vực kinh tế khác, đặc biệt là
trong các ngành công nghiệp thực phẩm. Amylase đƣợc thu nhận từ hạt nảy mầm, nấm mốc, nấm men và vi khuẩn.
2.4.1.1 Phân loại enzyme
Hiện nay có sáu loại enzyme amylase và đƣợc xếp thành hai nhóm: endoamylase (enzyme nội bào) và exoamylase (enzyme ngoại bào).
Endoamylase: gồm có α-amylase và nhóm enzyme khử nhánh. Nhóm enzyme khử nhánh này đƣợc chia thành hai loại: khử trực tiếp là pullulanase (hay α- dextrin 6-glucanohydrolase); khử gián tiếp là transglucosylase (hay oligo-1,6- glucosidase) và amylo-1,6-glucosidase. Các enzyme này thủy phân các liên kết bên trong của chuỗi polysaccharide.
Exoamylase: gồm có β-amylase và γ-amylase. Đây là những enzyme thủy phân tinh bột từ đầu không khử của chuỗi polysaccharide.
Hình 2.7 Các loại enzyme endoamylase và exoamylase
(Nguồn: Nguyễn Đức Lượng và ctv, 2004)
Amylase
Exoamylase Endoamylase
β-Amylase γ-Amylase Enzyme khử nhánh α-Amylase
Khử trực tiếp α-dextrin 6- glucoside Khử gián tiếp oligo-1,6-glucoside (transglucoside) và amylo-1,6-glucoside
2.4.1.2 Cơ chất của enzyme amylase
Cơ chất tác dụng của amylase là tinh bột và glycogen
a. Tinh bột
Là nhóm carbohydrate ở thực vật có chủ yếu trong các loại củ nhƣ khoai lang, khoai tây, khoai mì,…trong các loại ngũ cốc, các loại hạt và có công thức tổng quát là (C6H12O6)n. Tinh bột từ mọi nguồn khác nhau đều cấu tạo từ amylose và amylopectin. Các loại tinh bột đều có 20-30% amylose và 70-80% amylopectin. Amylose có trọng lƣợng phân tử 50.000-160.000, đƣợc cấu tạo từ 200-1.000 phân tử D-glucose nối với nhau bởi liên kết α-1,4-glycoside tạo thành một mạch xoắn dài không phân nhánh.
Amylopectin có trọng lƣợng phân tử 400.000 đến hàng chục triệu, đƣợc cấu tạo từ 600-6.000 phân tử D-glucose, nối với nhau bởi liên kết α-1,4-glucoside và α- 1,6-glucoside tạo thành mạch có nhiều nhánh.
Tinh bột không tan trong nƣớc lạnh nhƣng khi hỗn hợp dịch tinh bột bị đun nóng (60-850C) thì tinh bột sẽ bị hồ hóa và đƣợc gọi là hồ tinh bột. Dƣới tác dụng của enzyme amylase, tinh bột bị thủy phân do các liên kết glucoside bị phân cắt. Sự thủy phân tinh bột bởi enzyme amylase xảy ra theo hai mức độ: dịch hóa và đƣờng hóa. Kết quả của sự dịch hóa là tạo ra sản phẩm trung gian dextrin và khi dextrin tiếp tục bị đƣờng hóa thì sản phẩm là maltose và glucose (Nguyễn Đức Lƣợng và ctv, 2004).
b. Glycogen
Glycogen là một loại carbohydrate dự trữ ở động vật đƣợc dự trữ trong cơ thể động vật và đƣợc cơ thể chuyển hóa để sử dụng từ từ. Amylase có vai trò quan trọng trong sự chuyển hóa glucid ở tế bào động vật và vi sinh vật. Glycogen đƣợc cấu tạo từ các glucose liên kết với nhau bởi liên kết α-1,4-glucoside. Ở các vị trí phân nhánh, glucose có số mạch nhánh nhiều hơn tinh bột. Phân tử lƣợng ở trong khoảng 2 triệu - 3 triệu. Glycogen dễ tan trong nƣớc, nếu nhƣ chúng ta ăn quá nhiều carbohydrate trong cơ thể thì cơ thể chúng ta sẽ chuyển hóa chúng thành chất béo dự trữ. Ở động vật và ngƣời, glycogen tập trung chủ yếu ở trong gan (Nguyễn Đức Lƣợng và ctv, 2004).
2.4.1.3 Các loại enzyme amylase
a. Enzyme α-amylase (1,4-α-glucan 4-glucanhydrolase) (EC 3.2.1.1)
α-amylase có khả năng phân cắt liên kết α-1,4-glucoside của cơ chất một cách ngẫu nhiên và là enzyme nội bào (endoamylase). α-amylase không chỉ có khả năng thủy phân hồ tinh bột mà còn có khả năng thủy phân tinh bột nguyên vẹn.
Cơ chế tác dụng của α-amylase:
Trƣớc tiên enzyme này phân cắt một số liên kết trong tinh bột tạo ra một lƣợng lớn dextrin phân tử thấp, sau đó các dextrin này thủy phân tiếp tục để tạo ra maltose và glucose.
Amylose bị phân cắt thành các oligosaccharide hay còn gọi là polyglucose (6 - 7 gốc glucose) dƣới tác dụng của α-amylase, sau đó các oligosaccharide tiếp tục bị phân cắt nên chuỗi ngắn dần và tạo thành maltotetrose, maltotriose, maltose. Sau thời gian tác dụng dài, sản phẩm của quá trình thủy phân amylose là 13% và 87% maltose.
Tác dụng của α-amylase trên amylopectin cũng xảy ra tƣơng tự và sản phẩm đƣợc tạo là 72% maltose, 19% glucose, ngoài ra còn có phân tử dextrin phân tử thấp và isomaltose (8%) do α-amylase không thể cắt đƣợc liên kết 1,6-glucoside ở mạch nhánh của phân tử amylopectin.
b. Enzyme β-amylose (1,4-glucan-maltohydrolase) (EC 3.2.1.2)
β-amylose hiện diện phổ biến ở thực vật, đặc biệt là ở hạt nảy mầm. Ở trong các hạt ngũ cốc nảy mầm, β-amylose xúc tác sự thủy phân các liên kết α-1,4-glucan trong tinh bột, glycogen và polysaccharide, phân cắt từng nhóm maltose từ đầu không khử của mạch.
Ở lúa, β-amylose đƣợc tổng hợp trong hạt suốt quá trình nảy mầm của hạt và hầu nhƣ không đƣợc tổng hợp ở hạt khô.
Cơ chế tác dụng của β-amylose: β-amylose là một enzyme ngoại bào (exoenzyme). Tiến trình phân giải bắt đầu từ đầu không khử của các nhánh ngoài cùng của cơ chất. β-amylose phân cắt liên kết α-1,4-glucoside đứng kế cận liên kết α-1,6-glucoside thì nó sẽ ngừng tác dụng. Phần polysaccharide còn lại là dextrin phân tử lớn có chứa rất nhiều liên kết α-1,6-glucoside và đƣợc gọi là β- dextrin.
c. γ-amylase (glucoamylase hay α-1,4-glucan-glucohydrolase) (EC 3.2.1.3)
Glucoamylase có khả năng thủy phân hoàn toàn tinh bột, glycogen, amylopectin, dextrin, pentose, isomaltose và maltose thành glucose mà không cần sự tham gia của các amylase khác. Glucoamylase thủy phân giải phóng polysaccharide có nhánh nhƣ amylopectin, glycogen, β-amylose bị glucoamylase thủy phân khá nhanh.
Glucoamylase có khả năng thủy phân liên kết α-1,4 lẫn α-1,6-glucoside. Khi thủy phân liên kết α-1,4-glucan trong chuỗi polysaccharide, glucoamylase tách lần lƣợt từng phân tử glucose ra khỏi đầu không khử của mạch để tạo ra glucose. Ngoài ra, gluamylase còn có khả năng thủy phân các liên kết α-1,2 lẫn α-1,3-glucoside.
d. Oligo-1,6-glucoside hay dextrinase tới hạn (dextrin-6-glucanhydrolase) (EC 3.2.1.10)
Enzyme này thủy phân liên kết α-1,6-glucoside trong isomaltose, pentose và các dextrin tới hạn thành đƣờng có thể lên men đƣợc. Enzyme này có ở vi sinh vật nhƣng đồng thời cũng có trong hạt nảy mầm.
Ngoài oligo-1,6-glucosidase, hệ dextrinase của hạt ngũ cốc nảy mầm còn có amylopectin-1,6-glucosidase hay R-enzyme (EC 3.2.1.9) và dextrin-1,6- glucosidase hay amylo-1,6-glucosidase hay dextrin-1,6-glucanhydrolase (EC 3.2.1.33). Hai loại enzyme này đều thủy phân dextrin triệt để hơn α và β-amylase do đó trong dịch thủy phân có nhiều maltose hơn.
e. Pullunase (EC 3.2.1.4)
Pullunase thủy phân liên kết α-1,6-glucoside trong tinh bột hay glycogen. pH tối thích là 5,1 và nhiệt độ hoạt động tối thích là 45,70C. Enzyme này có khả năng thủy phân các dextrin phân tử thấp gồm 2 gốc maltose nối với nhau bằng liên kết α-1,6-glucoside.
f. Transglucoside (EC 3.2.1.68)
Transglucoside luôn tƣơng tác với glucoamylase. Nó có hoạt tính transferase lẫn hoạt tính thủy phân nên sự có mặt của nó trong dung dịch thƣờng gây sự nhầm lẫn với sự tồn tại của glucoamylase. Transglucoside không chỉ thủy phân maltose thành glucose mà còn tổng hợp isomaltose và panose, tức là nó có khả năng chuyển gốc glucose và chuyển nó vào phân tử maltose hoặc phân tử glucose bằng liên kết α-1,6-glucoside để tạo thành maltose hoặc isomaltose (Nguyễn Đức Lƣợng
2.4.2 Enzyme phytase
Phytase (myo-inositol hexakis photphat phosphohydrolase) là một enzyme đặc biệt của lớp enyme phosphatase xúc tác phản ứng thủy phân liên kết phosphomonoester của acid phytic giải phóng orthophosphate vô cơ và các dẫn xuất myo-inositol chứa ít nhóm photphate hơn, có thể thành myo-inositol tự do (Oh et al., 2004).
Dựa vào đặc điểm sinh hóa và trình tự acid amin, có thể phân phytase thành hai lớp: Histidine acid phytase (HAP; EC 3.1.3.2) (Van et al., 1952) và Alkaline phytase (chƣa có EC). Lớp enzyme HAP có sự đặc hiệu với cơ chất rộng và thủy phân các phytase không liên kết với kim loại ở pH acid tạo ra sản phẩm cuối là myo-inositol monophosphate. Trái lại, lớp Alkaline phytase chỉ đặc hiệu đối với phức hợp Canxi-phytate và tạo sản phẩm cuối là myo-inositol triphosphate (Oh et al., 2004).
Hình 2.8 Hoạt động của phytase
(Nguồn: http://nptel.ac.in/courses/102103016/module5/lec40/2.html)
Do hầu hết phytase có nguồn gốc vi khuẩn, nấm và thực vật đều thuộc lớp HAP nên các nghiên cứu về phytase đều đƣợc thực hiện trên HAP. Đặc điểm enzyme phytase chủ yếu đƣợc mô tả trên HAP vì hầu hết các phƣơng pháp xác định hoạt tính phytase điều đƣợc thiết kế để đo lƣợng hoạt tính phosphate vô cơ đƣợc giải phóng từ cơ chất phytate không liên kết với kim loại (sodium phytate) (Englen et al., 1994).
Theo Ủy Ban Thuật Ngữ thuộc Hiệp Hội Sinh Hóa và Sinh Học Phân Tử Quốc Tế (Nonmenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology – NC – IUBMB), Hiệp Hội Quốc Tế về Hóa Học và Ứng Dụng (The International Union of Biochemistry – IUB), phytase đƣợc phân thành hai nhóm dựa trên thứ tự ƣu tiên nhóm phosphate bị tấn công trong vòng carbon của Inositol: 3-phytase (EC 3.1.3.8) và 6-phytase (EC 3.1.3.26) (Oh et al., 2004). Phytase có nhiều trong các loại ngũ cốc nhƣ lúa mì, bắp, lúa mạch, gạo, và từ các loại đậu nành, đậu trắng…Phytase cũng đƣợc tìm thấy trong mù tạt, khoai tây, củ cải, rau diếp, rau bina, và phấn hoa huệ tây (Dvorakova, 1998). Trong hạt đang nảy mầm hoặc trong hạt phấn phytase có vai trò phân giải phytin (William and Taylor, 1985).
2.4.3 Các yếu tố ảnh hƣởng đến hoạt độ của enzyme
2.4.3.1 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất
Khảo sát trong trƣờng hợp đơn giản nhất, phản ứng chỉ có một cơ chất (S), enzyme (E) xúc tác cho sự chuyển hóa cơ chất [S] chỉ tạo thành một sản phẩm, phản ứng nhƣ sau:
E + S ES P + E
Ở giai đoạn đầu khi nồng độ cơ chất thấp thì tốc độ phản ứng phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ cơ chất. Khi toàn bộ lƣợng enzyme trong phản ứng điều tham gia vào phản ứng ES, tốc độ phản ứng sẽ đạt cực đại. Tuy nhiên, sự liên hệ này chỉ giới hạn đến nồng độ nhất định nào đó thôi. Nếu tiếp tục tăng nồng độ cơ chất sẽ ức chế ngƣợc lại hoạt động xúc tác của enzyme (Nguyễn Công Hà và Lê Nguyễn Đoan Duy, 2011).
2.4.3.2 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme
Trong trƣờng hợp thừa cơ chất nồng độ enzyme tăng sẽ làm tăng tốc độ phản ứng. Sự tăng tốc độ phản ứng trong tế bào sinh vật lại phụ thuộc rất nhiều vào khả năng điều hòa gen. Nhìn chung gốc độ phản ứng phụ thuộc tuyến tính với nồng độ enzyme.
Tốc độ phản ứng: V = K.[E] Trong đó:
V là vận tốc phản ứng [E] là nồng độ enzyme
Cũng có trƣờng hợp khi nồng độ enzyme quá lớn, vận tốc phản ứng tăng chậm (Lê Ngọc Tú và ctv., 2004).
2.4.3.3 Ảnh hưởng của các chất hoạt hóa
Các chất hoạt hóa làm tăng hoạt độ xúc tác của enzyme, thƣờng có bản chất hóa học khác nhau, có thể là các anion, các ion kim loại nằm ở ô thứ 11 đến ô thứ 55 của bản tuần hoàn hóa học Medelev hoặc các chất hữu cơ có cấu tạo phức tạp hơn làm nhiệm vụ chuyển nhóm, chuyển hydro hoặc các chất có khả năng phá vỡ một số liên kết trong phân tử tiền enzyme hoặc các chất có tác dụng phục hồi những nhóm chức trong trung tâm hoạt động của enzyme.
Ví dụ, tác dụng của anion Clo, Brom, Iod đến hoạt độ của α-amylase động vật. Tuy nhiên, tác dụng hoạt hóa chỉ giới hạn ở những nồng độ xác định, vƣợt quá giới hạn này có thể làm giảm hoạt độ của enzyme.
Glutation dạng khử (Glu-Cys-Gli) có tác dụng khử liên kết disulfur thành nhóm disulfi (-SH) nên cũng có tác dụng hoạt hóa nhiều enzyme. Các chất đã nêu trên thƣờng kết hợp trực tiếp với phân tử enzyme, làm thay đổi cấu tạo không gian của nó theo hƣớng có lợi cho hoạt độ xúc tác của enzyme. Một số chất có thể tác dụng theo cách gián tiếp, ví dụ, loại trừ các yếu tố kìm hãm khỏi môi trƣờng phản ứng (Lê Ngọc Tú và ctv., 2004).
2.4.3.4 Ảnh hưởng của chất kiềm hãm
Hoạt động của enzyme có thể bị thay đổi dƣới tác dụng của một số chất cơ bản chất hóa học khác nhau. Các chất làm giảm hoạt độ enzyme nhƣng không bị chuyển hóa thành enzyme đƣợc gọi là các chất kìm hãm hoặc các chất ức chế (inhibitor), thƣờng ký hiệu là I, các chất này có thể là những ion, các phân tử vô cơ, hữu cơ kể cả các protein. Các chất ức chế tham gia trong điều hòa, kiểm tra các quá trình trao đổi chất trong hệ thống sống.
Các chất này gây biến tính protein là những chất kìm hãm không đặc hiệu. Nhiều chất khác không làm biến tính protein nhƣng vẫn làm giảm hoạt độ xúc tác của enzyme theo cơ chế khác nhau.
Các chất này có thể kìm hãm thuận nghịch hoặc không thuận nghịch enzyme. Nếu là kìm hãm thuận nghịch, phản ứng kết hợp với enzyme và chất kìm hãm (I) nhanh chóng đạt đến cân bằng.
E + I k1 EI k2
Trong trƣờng hợp chất kìm hãm không thuận nghịch, k-1 rất bé có thể xem nhƣ bằng 0, I kết hợp với E bằng liên kết đồng hoá trị hoặc kết hợp rất chặt chẽ đến mức khó tách khỏi enzyme, sự phân ly phức EI là rất chậm. Các chất kìm hãm cạnh tranh là các chất kìm hãm thuận nghịch enzyme có cấu trúc tƣơng tự nhƣ cấu trúc của cơ chất, do đó có khả năng kết hợp vào trung tâm hoạt động của E chiếm chỗ kết hợp của cơ chất.
Các chất kìm hãm không cạnh tranh: các chất này kết hợp với enzyme ở chỗ khác với trung tâm hoạt động, làm thay đổi dạng không gian của phân tử enzyme theo hƣớng không có lợi cho hoạt động cho xúc tác của nó, do đó làm giảm tốc độ phản ứng. Sau khi kết hợp với chất kìm hãm không cạnh tranh, enzyme vẫn có thể tiếp tục kết hợp với cơ chất tạo thành phức EIS (Lê Ngọc Tú và ctv., 2004).
2.4.3.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ
Vận tốc phản ứng do enzyme xúc tác chỉ tăng theo nhiệt độ trong giới hạn xác định mà ở đó phân tử enzyme vẫn bền và chƣa bị biến tính. Đại lƣợng đặc trƣng cho ảnh hƣởng nhiệt độ đến vận tốc phản ứng hóa học cũng nhƣ phản ứng enzyme là hệ số Q10.
Hệ số Q10 càng lớn, phản ứng càng khó xảy ra ở nhiệt độ bình thƣờng, hệ số Q10 của phản ứng enzyme là từ 1 đến 2 (của phản ứng hóa học từ 2 đến 3). Từ hệ số Q10 có thể tính năng lƣợng hoạt hóa của enzyme phản ứng, đánh giá quá trình xúc tác. Nhiệt độ phản ứng với hoạt độ enzyme cao nhất gọi là nhiệt độ tối ƣu của enzyme (Lê Ngọc Tú và ctv., 2004).
Nhiệt độ tối ƣu của những enzyme khác nhau hoàn toàn khác nhau. Nếu đƣa nhiệt độ cao hơn mức nhiệt độ tối ƣu, hoạt tính enzyme sẽ bị giảm. Khi đó enzyme không có khả năng phục hồi lại hoạt tính. Nhiệt độ tối ƣu của enzyme phụ thuộc rất nhiều vào sự có mặt của cơ chất, kim loại, pH, các chất bảo vệ. Khi nhiệt độ cao thƣờng làm mất hoạt tính của enzyme. Phản ứng vô hoạt của enzyme dƣới tác dụng của nhiệt thƣờng biểu diễn thứ bậc một.
Ngƣời ta thƣờng sử dụng yếu tố nhiệt độ để điều khiển hoạt động của enzyme và tốc độ phản ứng trong chế biến và bảo quản thực phẩm (Nguyễn Đức Lƣợng và ctv., 2004).
2.4.3.6 Ảnh hưởng của pH
pH của môi trƣờng thƣờng ảnh hƣởng đến mức độ ion hóa của cơ chất, enzyme và đặc biệt ảnh hƣởng đến độ bền enzyme. Chính vì thế pH có ảnh hƣởng rất mạnh đến enzyme (Nguyễn Đức Lƣợng và ctv., 2004).
Đa số các enzyme bền trong giới hạn pH = 5 – 9, độ bền của enzyme có thể tăng lên khi có các yếu tố làm bền nhƣ cơ chất, coenzyme, Ca2+,…(Lê Ngọc Tú và ctv., 2004).
2.5 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI
Banchuen et al. (2010) cũng đã nghiên cứu về tối ƣu hóa quá trình nảy mầm của 3 giống lúa khác nhau của Thái Lan để đạt đƣợc hàm lƣợng các chất có hoạt tính sinh học trong gạo mầm là cao nhất. Trong quá trình nảy mầm thì hàm lƣợng