2.6.1. Trong nước
Công tác nghiên cứu và ứng dụng nấm men trong chăn nuôi ở nước ta có thể xem như được bắt đầu từ 1960 trở lại đây. Bao gồm các lĩnh vực sản xuất sinh khối tế bào, lên men thức ăn bột đường và sản xuất chế phẩm sinh học.
Năm 1975, sinh khối nấm men được sản xuất từ rỉ đường của nhà máy đường Vạn Điểm đã được sử dụng để chăn nuôi heo với tỷ lệ bổ sung 3 – 4% trong khẩu phần của heo từ 2 – 5 tháng tuổi đạt kết quả tốt (Nguyễn Khắc Tuấn, 1996).
Để tạo ra giống nấm men vừa có khả năng đường hóa cao vừa có khả năng tạo sinh khối lớn, Viện Kỹ thuật Sinh học thuộc Trung tâm Khoa học và Công nghệ Quốc Gia Việt Nam đã nghiên cứu cấy chuyển gen amylase được tách từ chủng
Endomycopsis fibuligera và gây biến nạp cho Saccharomyces cerevisiae làm cho nó có hai đặc tính đường hóa cao và sinh tổng hợp protein cao dùng trong chế biến thức ăn (Nguyễn Khắc Tuấn, 1996).
Hiện nay, các nhà chăn nuôi khá quan tâm tới việc sử dụng chế phẩm sinh học bổ sung vào khẩu phần thức ăn cho gia súc, gia cầm. Đặc trưng của các chế
Chuyên ngành Công nghệ sinh học 15 Viện NC&PT Công nghệ sinh học
phẩm sinh học này là sự kết hợp giữa nhiều chủng loại vi sinh vật có ích như
Bacillus. spp, Sacchromyces. spp và các enzyme amylase, protease,…
2.6.2. Nước ngoài
Đã có nhiều công trình nghiên cứu về bản chất sinh học, khả năng sinh hóa, phân loại của một số giống nấm men được sử dụng phổ biến trong sản xuất sinh khối tế bào như Saccharomyces, Torulopsis và Candida (Nguyễn Khắc Tuấn, 1996).
Các nhà khoa học trên thế giới đang hướng đến nghiên cứu chọn giống cho quá trình nâng cao công nghệ lên men truyền thống trên môi trường xốp để làm giàu protein cho các sản phẩm giàu tinh bột như sắn và các phụ phẩm nông nghiệp như bã mía, bã dừa, vỏ chuối,… (Nguyễn Khắc Tuấn, 1996). Trước đây người ta sử dụng nấm sợi để lên men nhưng do vấn đề sinh độc tố mycotoxin làm các nhà chăn nuôi e ngại. Do đó, họ chú ý đến nấm men và một số vi khuẩn lên men lactic (Nguyễn Khắc Tuấn, 1996).
Chế phẩm enzyme vi sinh vật ngày nay được sản xuất ở qui mô công nghiệp. Các chế phẩm này ngày càng được sử dụng rộng rãi. Gần đây, hãng dược Biocodex- Montronge (Pháp) cho ra sản phẩm men tiêu hóa Bioflor 250 có chứa 250mg tế bào nấm men Saccharomyces Boulardii dùng để phòng trị các bệnh về đường tiêu hóa.
Chuyên ngành Công nghệ sinh học 16 Viện NC&PT Công nghệ sinh học
CHƯƠNG 3. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Phương tiện nghiên cứu
3.1.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
Địa điểm: Phòng thí nghiệm Công nghệ Enzyme, Viện nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ.
Thời gian: từ tháng 8.2014 đến tháng 12.2014
3.2. Thiết bị, dụng cụ, hóa chất, địa điểm 3.2.1. Thiết bị 3.2.1. Thiết bị
Tủ cấy vi sinh vật, tủ ủ vi sinh vật Incubell 111 (Đức), kính hiển vi Olympus CHT (Nhật), nồi khử trùng nhiệt ướt Pbi-international (Ý), tủ sấy EHRET (Đức), máy khuấy từ (Hoa Kỳ), pH kế Orion 420A (Hoa Kỳ), cân điện tử Satorius (Đức), tủ lạnh -40C Akira (Việt Nam), máy chụp ảnh kỹ thuật số, máy vi tính phân tích và lưu trữ số liệu.
3.2.2. Dụng cụ
Eppendoft centrifure 5417 (Đức), bộ micropipette (Bio-Rad) P10, P20, P200, P1000 (Đức), buồng đếm hồng cầu, đĩa petri, ống nghiệm, bình Erlenmeyer 500ml, đĩa petri đường kính 10cm (Đức), ống nghiệm 10ml (Đức) và một số dụng cụ khác như: que cấy, que thủy tinh, bình tam giác, cốc đựng dung dịch, chai lọ thủy tinh, bọc nylon, ống đong, đèn cồn,…
3.2.3. Hóa chất
Ethanol 96%, agar, D-Glucose, calcium sulfate (CaSO4, Trung Quốc), sodium cloride (NaCl, Merck), dipotassium hydrogen phosphate (K2HPO4, Merck), potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4, Merck), ammonium sulfate ((NH4)2SO4, Trung Quốc), magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4.7H2O, Trung Quốc), n- octanol (C8H18O, Trung Quốc) octilic alcohol, sodium hydroxide (NaOH, Trung Quốc), acid sulfuric (H2SO4, Trung Quốc), acid boric (H3BO3, Trung Quốc),
Chuyên ngành Công nghệ sinh học 17 Viện NC&PT Công nghệ sinh học
magnesium hydroxide (Mg(OH)2, Trung Quốc), bromoresol green (Trung Quốc), methyl red (Trung Quốc).
3.3. Nguyên vật liệu
Bã mía được thu từ nhà máy đường Vị Thanh, tỉnh Hậu Giang sẽ được sấy ở 700C trong 30 – 45 phút, sau đó nghiền thành bột bằng máy nghiền mẫu RetschMiihle với kích thước lỗ lưới là 0,1mm. Bột bã mía sau khi nghiền không rửa hoặc được rửa với nước lọc nhiều lần để loại đường trước khi sử dụng cho thí nghiệm.
Nguồn nấm men: Dòng nấm men H13 tương đồng với Saccharomyces cerevisiae ở mức 94% được cung cấp từ phòng thí nghiệm Công nghệ Enzyme, Bộ môn CN SHPT, Viện NC và PT Công nghệ sinh học, Trường Đại học Cần Thơ.
3.4. Môi trường nuôi cấy nấm men
Bảng 3: Thành phần môi trường Potatose Glucose Agar (PGA) (M1) Tên hóa chất Khối lượng (g)/Thể tích (ml)
Khoai tây 20 (ml)
D-glucose 20 (g)
Agar 20 (g)
Nước cất 1000 (ml)
(*Nguồn: Nguyễn Lân Dũng, 2003)
Bảng 4: Thành phần môi trường Potatose Glucose (PG) (M2) Tên hóa chất Khối lượng (g)/ Thể tích (ml)
Khoai tây 20 (ml)
D-glucose 20 (g)
Nước cất 1000 (ml)
Chuyên ngành Công nghệ sinh học 18 Viện NC&PT Công nghệ sinh học
Bảng 5: Thành phần môi trường lỏng Ryckeboer (2003) cải tiến (M3) Tên hóa chất Khối lượng (g)/Thể tích (ml)
Bột bã mía 10 (g) (NH4)2SO4 1 (g) K2HPO4 1 (g) MgSO4.7H2O 0,5 (g) NaCl 0,001 (g) Nước 1000 (ml)
(*Nguồn: Ryckeboer (2003) cải tiến bởi Bùi Thị Thiên Thanh (2010))
Bảng 6: Thành phần môi trường đặc Ryckeboer (2003) cải tiến (M4) Tên hóa chất Khối lượng (g)/Thể tích (ml)
Bột bã mía 10 (g) (NH4)2SO4 1 (g) K2HPO4 1 (g) MgSO4.7H2O 0,5 (g) NaCl 0,001 (g) Agar 20 (g) Nước 1000 (ml)
Chuyên ngành Công nghệ sinh học 19 Viện NC&PT Công nghệ sinh học
Bảng 7: Thành phần môi trường đặc Ryckeboer (2003) cải tiến (M5) Tên hóa chất Khối lượng (g)/Thể tích (ml)
CMC 10 (g) (NH4)2SO4 1 (g) K2HPO4 1 (g) MgSO4.7H2O 0,5 (g) NaCl 0,001 (g) Agar 20 (g) Nước 1000 (ml)
(*Nguồn: Ryckeboer (2003) cải tiến bởi Bùi Thị Thiên Thanh (2010))
3.5. Phương pháp nghiên cứu
3.5.1. Khảo sát thành phần hóa học của bã mía
Bã mía sau khi thu về sẽ được sấy ở 70oC trong 30 – 45 phút, sau đó nghiền mịn. Bột bã mía sau khi nghiền chia làm 2 loại: loại 1 rửa sạch với nước lọc nhiều lần và loại 2 không rửa với nước. Sau đó đem sấy ở 70oC trong 2 – 3 tiếng rồi đem khảo sát một số chỉ tiêu:
Hàm lượng vật chất khô (dry matter - DM).
Hàm lượng xơ thô (crude fiber - CF).
Hàm lượng đường khử.
3.5.2. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của việc xử lý cơ chất lên sự phân giải bã mía của H13 giải bã mía của H13
Mục đích: Xác định cách xử lý cơ chất phù hợp cho sự phát triển của H13
Bố trí thí nghiệm: Hoàn toàn ngẫu nhiên, 3 lần lặp lại, nghiệm thức đối chứng không chủng nấm men.
Chuyên ngành Công nghệ sinh học 20 Viện NC&PT Công nghệ sinh học
Nấm men được nuôi tăng sinh trong môi trường M2 với điều kiện ủ lắc ngang 40 vòng/phút ở 38oC trong 2 ngày.
Chủng dịch nấm men mật số 106 tế bào/ml vào 2 bình tam giác môi trường M3 chứa 2 loại cơ chất khác nhau (bã mía loại 1 và bã mía loại 2). Đem ủ lắc ngang 40 vòng/phút ở 38oC trong 3 ngày.
Chỉ tiêu theo dõi:
Mật số tế bào nấm men sau nuôi cấy
Hàm lượng đạm ammoniac sinh ra trong dịch nuôi cấy.
Hàm lượng vật chất khô.
Phần trăm xơ thô được phân giải.
3.5.3. Thí nghiệm 2: Khảo sát hoạt tính exoglucanase và endoglucanase của H13 H13
Mục đích: Đánh giá khả năng sinh tổng hợp exoglucanase và endoglucanase của H13.
Bố trí thí nghiệm: Hoàn toàn ngẫu nhiên, 3 lần lặp lại, 1 nghiệm thức, nghiệm thức đối chứng không chủng nấm men.
Tiến hành:
Nấm men được nuôi tăng sinh trong môi trường M2 với điều kiện ủ lắc ngang, 40 vòng/phút ở 38oC trong 2 ngày.
Bơm 15 µl dịch nấm men có mật số 106 tế bào/ml vào mỗi giếng có đường kính lỗ đục 5 mm của môi trường M4 và M5. Ủ ở 38°C trong 24 giờ.
Khảo sát đường kính vòng tròn phân giải bã mía bằng cách nhuộm màu với Congo red.
Chỉ tiêu theo dõi: Đường kính vòng tròn phân giải bã mía (CMC) Đường kính vòng tròn phân giải = đường kính vòng halo – đường kính lỗ đục.
Chuyên ngành Công nghệ sinh học 21 Viện NC&PT Công nghệ sinh học
3.5.4. Thí nghiệm 3: Đánh giá ảnh hưởng của tỷ lệ dịch tế bào nấm men đến sự phân giải bã mía của H13 sự phân giải bã mía của H13
Mục đích: Xác định tỷ lệ nấm men thích hợp cho sự phát triển của nấm men trên cơ chất bã mía.
Bố trí thí nghiệm: Hoàn toàn ngẫu nhiên, 3 lần lặp lại, 5 mức độ tương ứng với 5 tỷ lệ dịch tế bào nấm men (1%, 2,5%, 5%, 7,5%, 10%), nghiệm thức đối chứng không chủng nấm men.
Tiến hành:
Nấm men được nuôi tăng sinh trong môi trường M2 với điều kiện ủ lắc ngang 40 vòng/phút ở 38oC trong 2 ngày.
Chủng dịch nấm men mật số 106 tế bào/ml của các tỷ lệ tương ứng với từng nghiệm thức vào các bình tam giác chứa môi trường M3. Đem ủ lắc ngang 40 vòng/phút ở 38oC trong 3 ngày.
Chỉ tiêu theo dõi:
Mật số tế bào nấm men sau nuôi cấy.
Hàm lượng đạm ammoniac sinh ra trong dịch nuôi cấy.
Hàm lượng vật chất khô.
Phần trăm xơ thô được phân giải.
3.5.5. Thí nghiệm 4: Đánh giá ảnh hưởng của pH đến sự phân giải bã mía của H13 của H13
Mục đích: Xác định pH thích hợp cho nấm men H13 phát triển.
Bố trí thí nghiệm: Hoàn toàn ngẫu nhiên, 3 lần lặp lại, 6 mức độ tương ứng với 6 môi trường có trị số pH lần lượt là 3, 4, 5, 6, 7 và 8, nghiệm thức đối chứng không chủng nấm men.
Chuyên ngành Công nghệ sinh học 22 Viện NC&PT Công nghệ sinh học
Nấm men được nuôi tăng sinh trong môi trường M2 với điều kiện ủ lắc ngang 40 vòng/phút ở 38oC trong 2 ngày.
Chủng dịch nấm men mật số 106 tế bào/ml với tỷ lệ thích hợp đã xác định vào các bình tam giác chứa môi trường M3 có pH tương ứng với các nghiệm thức. Đem ủ lắc ngang 40 vòng/phút ở 38oC trong 3 ngày.
Chỉ tiêu theo dõi:
Mật số tế bào nấm men sau nuôi cấy
Hàm lượng đạm ammoniac sinh ra trong dịch nuôi cấy.
Hàm lượng vật chất khô.
Phần trăm xơ thô được phân giải.
3.5.6. Thí nghiệm 5: Đánh giá ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phân giải bã mía của H13 mía của H13
Mục đích: Xác định nhiệt độ thích hợp cho nấm men H13 phát triển.
Bố trí thí nghiệm: Hoàn toàn ngẫu nhiên, 3 lần lặp lại, 5 mức độ tương ứng với 5 mức nhiệt độ khác nhau (30, 35, 38, 40, 45), nghiệm thức đối chứng không chủng nấm men.
Tiến hành:
Nấm men được nuôi tăng sinh trong môi trường M2 với điều kiện ủ lắc ngang 40 vòng/phút ở 38oC trong 2 ngày.
Chủng dịch nấm men mật số 106 tế bào/ml với tỷ lệ thích hợp đã xác định vào các bình tam giác chứa môi trường M3 đã được chuẩn pH thích hợp. Đem ủ lắc ngang 40 vòng/phút trong 3 ngày ở 6 nhiệt độ khác nhau của 6 nghiệm thức.
Chỉ tiêu theo dõi:
Mật số tế bào nấm men sau nuôi cấy
Chuyên ngành Công nghệ sinh học 23 Viện NC&PT Công nghệ sinh học
Hàm lượng vật chất khô.
Phần trăm xơ thô được phân giải.
3.5.7. Thí nghiệm 6: Đánh giá ảnh hưởng của thời gian ủ đến sự phân giải bã mía của H13
Mục đích: Xác định thời gian ủ thích hợp cho nấm men H13 phát triển
Bố trí thí nghiệm: Hoàn toàn ngẫu nhiên, 3 lần lặp lại, 5 mức độ tương ứng với 5 khoảng thời gian ủ (1 ngày, 2 ngày, 3 ngày, 4 ngày, 5 ngày), nghiệm thức đối chứng không chủng nấm men.
Tiến hành:
Nấm men được nuôi tăng sinh trong môi trường M2 với điều kiện ủ lắc ngang 40 vòng/phút ở 38oC trong 2 ngày.
Chủng dịch nấm men mật số 106 tế bào/ml với tỷ lệ thích hợp đã xác định vào các bình tam giác chứa môi trường M3 đã được chuẩn pH thích hợp. Đem ủ lắc ngang 40 vòng/phút ở nhiệt độ thích hợp đã khảo sát trong thí nghiệm 4. Lần lượt tiến hành thu mẫu theo thời gian ủ của từng nghiệm thức.
Chỉ tiêu theo dõi:
Mật số tế bào nấm men sau nuôi cấy
Hàm lượng đạm ammoniac sinh ra trong dịch nuôi cấy.
Hàm lượng vật chất khô.
Chuyên ngành Công nghệ sinh học 24 Viện NC&PT Công nghệ sinh học
CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Kết quả phân tích thành phần bã mía
Bảng 8: Hàm lượng các thành phần trong hai loại bã mía Bã mía Hàm lượng vật chất khô (DM) (%) Hàm lượng xơ thô (CF) (%) Đường khử (µg/ml) Rửa 91,17 ± 0,21 57,11 ± 1,15 0,558 ± 0,013 Không rửa 90,34 ± 0,55 42,55 ± 1,32 0,976 ± 0,048
Hàm lượng vật chất khô của bã mía rửa và bã mía không rửa khi được sấy ở 70oC trong 48 giờ lần lượt là: 91,17% và 90,34%. Cả hai kết quả này đều thấp hơn so với khảo sát hàm lượng vật chất khô bột bã mía của Đỗ Thị Cẩm Hường (2012) – 93,69%; Võ Thị Mỹ Nhiên (2012) – 98,41%; Trần Hồ Diễm Đoan (2013) – 98,41%; Ilindra và Dhake (2008) – 93,3%; Shakweer (2003) – 94,57% và Glauber et al., (2003) – 94,8%. Trái lại, cả hai kết quả trên lại cao hơn kết quả của Marcele và Jorge (2013) khi sấy bã mía đến khối lượng không đổi thu được 85% khối lượng vật chất khô. Hàm lượng vật chất khô khác nhau tùy thuộc vào lượng nước chứa trong mẫu và đặc biệt là các đặc tính khác nhau của nguyên liệu như nguồn thu nguyên liệu cùng với cách xử lý nguyên liệu. Theo kết quả trên thì hàm lượng vật chất khô trong bã mía rửa cao hơn bã mía không rửa do trong quá trình rửa đã loại bỏ được thành phần tan (đường).
Hàm lượng xơ thô được khảo sát trong thí nghiệm sau khi được xử lý với H2SO4 1,25% và NaOH 1,25% để loại bỏ các thành phần khác ngoài xơ thô. Kết quả thu được là hàm lượng xơ thô của bã mía rửa là 57,11%, cao hơn so với bã mía không rửa là 42,55%. Cả hai kết quả trên đều thấp hơn so với kết quả khảo sát của Đỗ Thị Cẩm Hường (2012) – 69,83% và Nguyễn Thanh Son (2013) – 79,75%. Trái lại hàm lượng xơ thô của bã mía rửa lại cao hơn khảo sát của Fornasiero và Graziani (2006) với hàm lượng xơ thô là 42,6%. Thành phần xơ thô của bã mía phụ thuộc trực tiếp vào bản chất nguyên liệu và quá trình xử lý nguyên liệu. Bã mía rửa có
Chuyên ngành Công nghệ sinh học 25 Viện NC&PT Công nghệ sinh học b a 0 1 2 3 4 5 6
Rửa Không rửa
Mậ t số t ế b ào (x10 7 tế b ào /m l) Loại bã mía
thành phần xơ thô cao hơn do trong quá trình rửa đã loại bỏ sạch các chất tan không phải xơ thô.
Theo kết quả trên, hàm lượng đường khử có trong bã mía không rửa là 0,976 (µg/ml) cao hơn so với bã mía rửa (0,558 µg/ml), dựa vào điều này có thể dự đoán nấm men phát triển tốt hơn với cơ chất bã mía không rửa do nấm men sử dụng nguồn dinh dưỡng chủ yếu từ đường.
4.2. Ảnh hưởng của việc xử lý cơ chất lên sự phân giải bã mía của H13
Kết quả đếm mật số tế bào nấm men sau khi nuôi cấy:
*Các giá trị là trung bình của 3 lần lặp lại, các già trị có cùng ký tự thể hiện sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở mức 5%, CV = 0,45%.
Mật số tế bào nấm men sau nuôi cấy của hai 2 loại bã mía rửa và không rửa lần lượt là 5,34x107 tế bào/ml và 4,24 x107 tế bào/ml đều cao hơn so với mật số ban đầu (106 tế bào/ml), cơ chất bã mía không rửa có mật số tế bào cao hơn so với bã mía rửa và có khác biệt ý nghĩa thống kê ở mức 5%. Kết quả trên cho thấy nấm men sinh trưởng và phát triển tốt hơn trong môi trường cơ chất bã mía sau khi xay không
Hình 6: Ảnh hưởng của bã mía rửa và bã mía không rửa tới mật số tế bào nấm men
Chuyên ngành Công nghệ sinh học 26 Viện NC&PT Công nghệ sinh học c b c a -4.00 -2.00 0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00
ĐCR Rửa ĐCKR Không rửa
DM t h ay đổ i (% ) Loại bã mía
rửa qua nước. Do trong quá trình xử lý nguyên liệu đối với bã mía rửa đã loại bỏ một số thành phần hòa tan như đường và các tạp chất khác có lợi cho sinh trưởng của nấm men khiến cho mật số của cơ chất bã mía rửa thấp hơn.
Kết quả phân tích hàm lượng vật chất khô (DM) sau nuôi cấy: