Khi nhỏ H2O2 3% lên bề mặt khuẩn lạc thấy có hiện tượng sủi bọt khí, có khí O2 giải phóng ra, chứng tỏ vi khuẩn G.BHN2 có khả năng sinh enzyme catalase.
3.1.5. Kiểm tra khả năng chuyển hóa glucose thành acid gluconic.
Kết quả thu được như hình 3.6, vòng sáng xuất hiện xung quanh khuẩn lạc trên môi trường CaCO3, điều này chứng tỏ có sự xuất hiện của axit gliconic:
H+ + CaCO3 →Ca2+
+ H2O + CO2
Hình 3.6 vòng phân giải CaCO3
3.1.6. Khảo sát khả năng lên men tạo màng BC từ chủng vi khuẩn Gluconacetobacter Gluconacetobacter
Dựa theo kết quả nghiên cứu của nhóm tác giả Đinh Thị Kim Nhung, Dương Minh Lam và cs, quá trình lên men tạo màng BC từ chủng
Gluconacetobacer được tiến hành theo 4 bước cơ bản như sau:
Vòng phân giải CaCO3
23
Bước 1: Nhân giống
↓
Bước 2: Hoạt hóa
↓
Bước 3: Lên màng ↓
Bước 4: Thu màng
Cụ thể tôi thực hiện các bước lên màng như sau: Bước 1: Nhân giống
Quy trình nhân giống được tiến hành cấy truyền liên tục chủng G.BHN2
trên môi trường thạch nghiêng. Bước 2: Hoạt hóa
Tiến hành hoạt hóa bằng cách thu sinh khối vi khuẩn từ các ống giống G.BHN2 nuôi trong bình chứa dịch nhân giống cấp 1 theo tỷ lệ 1 ống giống
/250ml dung dịch.
Sau đó lắc các bình nhân giống cấp 1 trong khoảng thời gian 24h để thu sinh khối vi khuẩn Gluconacetobacter.
24
Sau thời gian 24 giờ lắc, các bình giống vi khuẩn G.BHN2 có màu trắng đục có hệ sợi trắng lơ lửng trong dung dịch, đó là các sơi cellulose mà vi khuẩn sinh ra trong quá trình sinh trưởng.
Bước 3 tạo màng
Dùng micropipet cấy dịch nhân giống cấp 1 vào môi trường lên men theo tỷ lệ 10ml dịch giống/100ml môi trường lên men.
Tiến hành lên men tĩnh trong 4 – 7 ngày.
Sau khoảng thời gian 4 ngày, thấy xuất hiện lớp màng màu trắng đục trên bề mặt dịch lên men, lớp màng này dai, có độ dày mỏng khác nhau ở các hộp khác nhau.
Hình 3.8. Màng BC sau 5 ngày lên men
(adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Bước 4: thu màng
Dùng cồn 900 bảo quản màng, dùng găng tay cao su vớt màng trong hộp lên men, tiến hành kiểm tra đặc tính của màng.
3.1.7. Kểm tra khả năng tổng hợp cellulose
Nhỏ dung dịch lugol và H2SO4 60% lên mặt lớp màng BC thấy xuất hiện màu lam.
25
Hình 3.9. Kết quả nhuộm màng BC
Qua hình 3.9 có thể kết luận vi khuẩn G.BHN2 có khả năng hình thành màng cellulose.
Như vậy đã lên men tạo màng BC ổn định cho chủng Gluconacetobacter sau thời gian 5 ngày.
Một vấn đề tôi đặt ra trong nghiên cứu của mình, chất lượng màng BC của vi khuẩn G.BHN2 thay đổi như thế nào khi thay đổi nguồn đường trong thành phần dinh dưỡng của môi trường lên men, từ đó cho phép tìm ra hàm lượng đường và nguồn đường thích hợp cho môi trường lên men của vi khuẩn.
3.2. Ảnh hƣởng của của nguồn cacbon đến quá trình lên men tạo màng BC của chủng vi khuẩn Gluconacetobacter
Quá trình lên men tạo màng BC từ vi khuẩn Gluconacetobacter chịu ảnh hưởng trực tiếp của thành phần môi trường dinh dưỡng đặc biệt là nguồn cacbon. Trong phạm vi nghiên cứu của mình tôi nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn cacbon là nước dừa, đường saccarose và đường glucose tới quá trình tổng hợp cellulose của chủng Gluconacetobacter.
3.2.1. Ảnh hưởng của hàm lượng đường glucose tới quá trình lên men tạo màng BC từ chủng Gluconacetobacter
Vấn đề ảnh hưởng của hàm lượng đường glucose đến quá trình lên men tạo màng BC đã được nhiều tác giả nghiên cứu Đinh Thị Kim Nhung, Nguyễn
26
Thị Thùy Vân, Trần Như Quỳnh (2009), gần đây nhất là nghiên cứu của nhóm tác giả Sara M. Santos, Jose M. Carbajo, Juan C. Villar (2013) [24]. Theo kết quả nghiên cứu của các tác giả trên tôi nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng glucose tới khả năng tạo màng BC của chủng vi khuẩn
Gluconacetobacter BHN2 như sau:
Sử dụng môt trường MT3 để lên màng với sự thay đổi hàm lượng glucose từ 17g/l tới 23g/l, còn các thành phần còn lại tôi giữ nguyên, sau 7 ngày nuôi cấy tôi cấy, ở ngày thứ 4 màng bắt đầu hình thành. Tiến hành thu màng sau 6 ngày nuôi cấy. Kết quả được trình bày ở bảng 3.1:
Bảng 3.1. Ảnh hƣởng của hàm lƣợng glucose đến màng BC
Hàm lượng đường(g/l) Đặc điểm màng BC M±m(g) 17 Màng mỏng, nhẵn, dễ rách 6,57 ± 0,02 18 6,7 ± 0,01 19 Màng dày, dai, nhẵn 7,99 ± 0,03 20 7,36± 0,04 22 Màng mỏng, dai, nhẵn 6,15 ± 0,03 23 5,37 ± 0,02
Hình 3.10. Biểu đồ biểu diễn mối tƣơng quan giữa hàm lƣợng đƣờng glucose và khối lƣợng màng BC 0 1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 khối lượng màng BC tươi Khối lƣợng màng BC (g) STT mẫu 0 5 10 15 20 25 30 1 2 3 4 5 6 hàm lượng đường Hàm lƣợng đƣờng(g/l) STT mẫu mẫu
27
Dựavào kết quả bảng 3.1 và hình 3.10 và đồ thị 3.11, tôi nhận thấy tỷ lệ màng BC hình thành phụ thuộc rất nhiều vào hàm lượng đường glucose. Nếu hàm lượng đường nhỏ hơn 20g/l khối lượng màng BC đạt 6,57g/l, thấp hơn so khối lượng màng BC thu được ở hàm lượng glucose 20g/l.
Theo kết quả nghiên cứu của Nguyễn Trung Kiên(2013) [14]. Do trong quá trình lên men 50% hàm lượng glucose tham ra vào quá trình hình thành màng BC, phần còn lại cung cấp hoạt động sống cho tế bào. Do đó hàm lượng đường glucose quá thâp (<19) không đủ cung cấp cho dịch nuôi cấy, nên cellulose được sản sinh ra it. Ngược lại hàm lượng glucose quá nhiều, vi khuẩn không sử dụng hết(>22g), lượng glucose sẽ được chuyển hóa thành axit gluconic làm cho pH môi trường giảm, pH quá thấp sẽ làm ức chế sự phát triển của vi khuẩn, ức chế quá trình tạo màng BC, chất lượng màng không đảm bảo. Kết quả nghiên cứu này phù hợp với nhiều kết quả đã đưa ra như tác giả Nguyễn Trung Kiên xác định hàm lượng glucose thích hợp cho vi khuẩn
Gluconacetobacter 20g/l [11].
Như vậy, hàm lượng glucose thích hợp cho môi trường lên men tạo màng BC từ chủng Gluconacetobacter là 19g/l, 20g/l/.
28
3.2.1. Ảnh hưởng của hàm lượng đường saccarose tới khả năng lên men tạo màng BC
Các nghiên cứu về ảnh hưởng của hàm lượng đường saccarose tới quá trình tạo màng BC còn rất khiêm tốn. Phần lớn các nghiên cứu về ảnh hưởng của hàm lượng đường saccarose tới khả năng sinh trưởng của vi khuẩn
Acetobacter trong quá trình lên men kombucha. Hàm lượng đượng đường tối đa sử dụng cho quá trình lên men của vi khuẩn là 10%, do đó để nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng đường saccarose tới quá trình lên men tạo màng BC tôi xây dựng mô hình thí nghiệm như sau:
Sử dụng môt trường MT3 để lên màng với sự thay đổi hàm lượng đường saccarose từ 5 g/l tới 13g/l, còn các thành phần còn lại tôi giữ nguyên, sau 7 ngày nuôi cấy tôi cấy, tôi nhận thấy ở ngày thứ 4 màng bắt đầu hình thành, tiến hành thu màng sau 7 - 10 ngày nuôi cấy, tôi tiến hành thu nhận màng. Kết quả được trình bày ở bảng 3.2: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Bảng 3.2. Ảnh hƣởng của hàm lƣợng saccarose đến màng BC
Hàm lượng
saccarose(g/l) Đặc điểm màng BC
Khối lượng tươi của màng BC (g) 5 Màng mỏng, không nhẵn và dễ bị rách 4,1 7 5,2 8 Màng mỏng, dai nhẵn 6,3 10 7,9 13 Màng mỏng, khá dai và không nhẵn 5,52
29
Hình 3.12. Biểu đồ biểu diễn mối tƣơng quan giữa hàm lƣợng đƣờng saccarose và khối lƣợng màng BC
Hình 3.13. màng BC thu đƣợc sau 7 ngày
Từ bảng 3.2, biểu đồ 3.2, hình 3.12, nhân thấy vi khuẩn
Gluconacetobacter có khả năng sinh trưởng trên môi trường có nguồn đường saccarose, tuy nhiên chất lượng màng BC không được dày và dai so với màng BC thu được từ nguồn đường glucose. Trong môi trường axit đường saccarose được thủy phân thành đường glucose và fructose, là hai dạng đường đơn mà vi khuẩn Gluconacetobacter dễ sử dụng. Hàm lượng đường saccarose tối ưu sử dụng cho môi trường lên men tạo màng 10g/l.
0 2 4 6 8 10 1 2 3 4 5 khối lượng màng BC(g) Khối lƣợng màng BC (g) STT mẫu 0 5 10 15 1 2 3 4 5 hàm lƣợng đƣờng saccharose (g/l) hàm lượng đường saccharose (g/l) STT mẫu
30
3.2.2. Ảnh hưởng của hàm lượng nước dừa tới quá trình lên men tạo màng BC từ chủng vi khuẩn Gluconacetobacter BHN2 màng BC từ chủng vi khuẩn Gluconacetobacter BHN2
Việc sử dụng nước dừa là môi trường thích hợp cho quá trình sinh trưởng của vi khuẩn cũng như quá trình tạo màng BC đã được nghiên cứu bởi Trân Như Quỳnh (2009) và Nguyễn Trung Kiên (2013). Dựa theo nghiên cứu của nhóm tác giả Đinh Thị Kim Nhung, Nguyễn Trung Kiên, Nguyễn Thị Mai[1 1], tôi tiến hành khảo sát ảnh hưởng của hàm lường nước dừa đến khả năng tạo màng BC như sau:
Tiến hành lên men tạo màng BC từ chủng vi khuẩn Gluconacetobacter
trên môi trường MT3, trong đó có sự thay đôi về tỷ lệ nước máy và nước dừa 0%- 100%
Sau 6 ngày tiến hành thu màng kết quả như bảng sau:
Bảng 3.3. Khối lƣợng tƣơi màng BC trên môi trƣờng nƣớc dừa
Hàm lượng nước dừa(%) Đặc điểm màng BC M±m(g) 0 Mỏng, dai, nhẵn, min 13.57 ± 0.02 25 15.77 ± 0.02 50 Màng dày, dai, nhẵn 26.47 ± 0.04 75 25.47 ± 0.03 100 19.08 ± 0.04
31
Hình 3.14. Biểu đồ biểu diễn mối tƣơng quan giữa hàm lƣợng nƣớc dừa và khối lƣợng màng BC tƣơi
Hình 3.15. Màng BC thu đƣợc sau 6 ngày trên môi trƣờng nƣớc dừa
Từ bảng 3.3, hình 3.11 và biểu đồ 3.3, tôi nhận thấy hàm lượng nước dừa 0% ta vẫn thu được màng BC, có đặc tính mỏng, min, dai. Ở môi trường có hàm lượng nước dừa đạt 50% khôi lượng tươi màng BC tăng lên, màng dày, min, trong, có các đặc tính ưu việt hơn.
0 5 10 15 20 25 30
hàm lượng nước dừa (%) khôi lượng màng BC tươi (g) 0 25 50 75 80 100 Khối lƣợng màng BC Hàm lƣợng nƣớc dừa
32
Theo kết quả nghiên cứu của tác giả Brown (1992), trong thành phần của nước dừa có nhiều carbohydrate, vitamin, axit amin, các chất khoáng. Do đó nước dừa nguồn cacbon hữu cơ lý tưởng trong thành phần của môi trường lên men thích hợp tạo màng dày, dai, min. Tuy nhiên ở ngoài thị trường nước dừa có giá thành cao, vì vậy chi phí cho quá trình tạo màng BC trên môi trường nước dừa cao.
Như vây nước dừa là nguồn nguyên liệu thích hợp sử dụng cho môi trường lên men tạo màng BC dày, dai, mịn, trắng. Hàm lượng nước dừa thích hợp để tạo màng BC dày, dai, mịn đạt từ 50 – 75%. Kết quả nghiên cứu này hoàn toàn phù hợp với kết quả của các tác giả nghiên cứu trước đó như tác giả Nguyễn Trung Kiên (2013) xác định nước dừa là nguồn nguyên liệu lên men tạo màng BC thích hợp cho chủng Gluconactobacter
33 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
1. Kết luận
1.1. Đã tạo được màng BC từ Chủng vi khuẩn Gluconacetobacter BHN2 sau thời gian 5 ngày.
1.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng đường glucose tới quá trình lên men tạo màng BC, xác định được hàm lượng glucose thích hợp tạo màng BC có chất lượng tốt 19g/l, 20g/l.
1.3. Nghiên cứu ảnh hưởng hàm lượng đường saccarose tới quá trình lên men tạo màng BC từ chủng vi khuẩn BHN2, xác định được hàm lượng đường saccarose lên men tốt là 10g/l
1.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng nước dừa tới quá trình lên men tạo màng BC từ chủng vi khuẩn BHN2, tôi xác định được nước dừa là nguồn nguyên liệu thích hợp sử dụng cho môi trường lên men tạo màng BC có chất lượng tốt và hàm lượng nước dừa thích hợp tạo màng BC dày, dai, mịn là 50 -75%.
2. Kiến nghị
Vì điều kiện và thời gian nghiên cứu có hạn, nhiều vấn đề chưa thực hiện được, do đó chúng tôi đề nghị:
Cần có những nghiên cứu sâu hơn về ảnh hưởng của nguồn cacbon đến quá trình lên men tạo màng BC của chủng vi khuẩn Gluconacetobacter BHN2,
34
TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1]. Nguyễn Lân Dũng (1976), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, tập 1- 2- 3, Nxb Khoa học kỹ thuật Hà Nội.
[2]. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (1998), Vi
[3]. Nguyễn Thành Đạt (1999), Cơ sở vi sinh vật học, Tập 1,tr. 52309, Nxb ĐHSP Hà Nội.
[4]. Nguyễn Thành Đạt, Nguyễn Duy Thảo, Vương Trọng Hào (1990), Thực hành vi sinh vật, tr. 17-92, Nxb giáo dục.
[5]. Vũ Thị Minh Đức (2001),Thực tập vi sinh vật, tr. 1-50, Nxb ĐHQG Hà Nội. [6]. Nguyễn Thúy Hương (2006), Chọn lọc dùng Gluconacetobacter BHN2
thích hợp cho các loại môi trường dùng trong sản xuất cellulose vi khuẩn với quy mô lớn, Luận án tiến sỹ khoa học sinh học, trường Đại học Bách khoa thành phố Hồ Chí Minh.
[7]. Nguyễn Đức Lượng (2000), Công nghệ Vi sinh vật, tập 1- 2- 3, tr. 84 – 90, tập 1,Nxb Đại học Quốc Gia TP HCM.
[8]. Nguyễn Thị Nguyệt (2008). Nghiên cứu vi khuẩn Gluconacetobacter BHN2 cho màng Bacterial cellulose làm mặt nạ dưỡng da, Luận văn Thạc sỹ khoa học sinh học ĐHSP Hà Nội.
[9]. Đinh Thị Kim Nhung (1996), Nghiên cứu một số đặc điểm của vi khuẩn Acetobacter và ứng dụng lên men acetic theo phương pháp chìm, Luận án PTS khoa học sinh học ĐHSP Hà Nội.
[10]. Đinh Thị Kim Nhung, Dương Minh Lam(2012), ” nghiên cứu định danh chủng vi khuẩn BHN2_21 có khả năng tạo màng Bacterial celluse ( BC) phân lập từ mẫu bia Hà Nội”, Kỷ yếu toàn văn Hội nghị Khoa học lần thứ 8, DHKHTN- ĐHQG thành phố Hồ Chí Minh, ngày 9 và 10 tháng 11, năm 2012.
35
[11]. Nguyễn Trung Kiên (2013),Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng tới quá trình lên men tạo màng Bacterial cellulose của vi khuẩn Gluconacetobacter,
Luận văn Thạc sĩ khoa Sinh -KTNN, trường ĐHSP Hà Nội 2.
[12]. Nguyễn Thị Thùy Vân (2009), Nghiên cứu đặc tính sinh học và khả năng tạo màng Bacterial cellulose của vi khuẩn Gluconacetobacter BHN2 phân lập từ một số nguồn nguyên liệu ở Việt Nam, Luận văn Thạc sỹ khoa học sinh học, trường ĐHSP Hà Nội.
[13]. Br Alaban C.A. (1967), Studies on the optimum conditions for „nata de coco‟ bacterium or „nata‟ formation in coconut water, The Philippnie Agriculturist, v.45. p. 490-515.
[14]. Alexander S.l, Sang K. R (2005). Polysaccharides and polyamides in the food industry, Volume 2. www.wiley..vch. De. p 31-85.
[15]. Alina K, Marianna T, Stanislaw B, Emilia K, Aleksander Ma, Andrzej P. (2005), “Molecular basis of cellulose biosynthesis disappearance in submerged culture of Acetobacter xylinum”, Acta biochimica polonica, Vol. 52, pp. 691-698. [16]. own R.M. (1999), Cellulose structure and biosynthesis, Pure Appl. Chem.
(5), p. 765-775.
[18]. Brown R.M., Cousins S.K., Krystyna Kudlicka (1992), “Gravity effects on cellulose assembly”, American journal of botany 70 (11), pp. 1247 - 1258. [19]. Brown R.M., Willison J.H., Richardson C.L. (1976), “Cellulose (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
biosynthesis in Acetobacter xylinum: Visualization of the site of synthesis and direct measurement of the in vivo process”, Proceedings of the National Academy of Science, Vol. 73, pp. 4565 – 4569.
[20]. Bworn. E. (2007). Bacterial cellulose Thermoplastic polymer nanocomposites. Master of science in chemical engineering, Washington state university.
[21]. Barbara S., Sebastian P, Dariusz D; (2008) Characteristics of Bacterial cellulose obtained from Acetobacter xylinum culture for application in
36
papermaking. FIBRES & TEXTILES in Eastern Europe 2008, Vol.16, No.4 (69) pp.108-111.
[22]. Bergey. H, John. G. Holt.( 1992) Bergey‟s manual of dererminativa bacteriology. Wolters kluwer health, p.71- 84.
[23]. Sherif M.A.S.Keshk, Kazuhiko Sameshima.(2005). Evaluation of different carbon sources for bacterial cellulose production. Vol. 4, No. 6, African Journal of Biotechnology, 2005, p. 478- 482.
[24].http://www.ncsu.edu/bioresources/BioRes_08/BioRes_08_3_3630_Santos_ CV_Bact_Cellluose_Restor_Degraded_Paper_3929.pdf