2.4.2.1. Phương pháp đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro
Nguyên tắc
XO xúc tác cho quá trình oxy hóa xanthin thành acid uric:
Xanthin + O2 + H2O uric acid + H2O2
Hoạt độ XO tỷ lệ với lƣợng acid uric định lƣợng đƣợc bằng phƣơng pháp đo quang ở bƣớc sóng 290nm.
Thiết kế thí nghiệm
Thí nghiệm đƣợc thực hiện trên đĩa 96 giếng. Bố trí trong một đĩa gồm: mẫu chứng và mẫu thử.
Thành phần trong mẫu chứng và mẫu thử đƣợc thể hiện ở bảng 2.1.
Bảng 2.1. Thành phần mẫu chứng và mẫu thử Mẫu chứng Mẫu thử Dung dịch thử 0 50μl Dung dịch đệm phosphate pH 7,5 85 μl 35μl Xanthin 150μM 60μl 60μl XO 0,01U/ml 30μl 30μl HCl 1M 25μl 25μl Tổng thể tích 200μl 200μl XO
Quy trình thí nghiệm đƣợc mô tả ở hình 2.4
Hình 2.4. Quy trình thí nghiệm đánh giá tác dụng ức chế XO in vitro
Thông số đánh giá - ∆OD: ∆ODchứng = ODchứng - ODtrắng chứng. ∆ODthử = ODthử - ODtrắng thử - I (%) ức chế tính theo công thức:
- IC50 ƣớc tính: là nồng độ lý thuyết mà tại đó ức chế 50% hoạt độ xanthin oxidase.
2.4.2.2. Phương pháp đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase in vivo
Thiết kế thí nghiệm
Áp dụng mô hình đánh giá ảnh hƣởng lên hoạt độ XO gan chuột thực nghiệm [6]. Chuột nhắt trắng, đực, trƣởng thành đƣợc chia ngẫu nhiên vào các lô:
- Lô chứng: uống dung môi.
- Lô đối chiếu: uống thuốc đối chiếu allopurinol.
Phương pháp chiết enzym
Kết thúc thực nghiệm, giết chuột bằng cách kéo dãn đốt sống cổ, lấy ngay gan từng chuột. Cân ngay 1g gan, cắt thành các mảnh nhỏ, cho vào ống nghiền đồng thể đã để lạnh và có sẵn 1ml dung dịch đệm phosphate lạnh (pH = 7,5). Nghiền gan trong điều kiện lạnh đến khi thu đƣợc dịch đồng thể, sau đó thêm dần đệm lạnh để thu đƣợc dịch đồng thể với tỷ lệ gan : đệm tƣơng ứng là 1:10. Dịch nghiền thu đƣợc đem ly tâm lạnh ở 00
C với tốc độ 3000 vòng trong 10 phút. Lấy phần dịch nổi tiếp tục đem ly tâm lạnh ở 00C với tốc độ 10000 vòng trong 60 phút. Phần dịch trong thu đƣợc sau khi ly tâm dùng để xác định hoạt độ enzym. Toàn bộ các bƣớc của thí nghiệm đƣợc thực hiện trong điều kiện lạnh (môi trƣờng nƣớc đá đang tan .
Phản ứng enzym
Phản ứng đƣợc thực hiện trong ống nghiệm gồm 2,90ml đệm phosphate (0,05M, pH 7,5); 2,50ml dung dịch đệm cơ chất gồm xanthin 0,12mM, EDTA 0,192mM, kali oxonat 2,2mM. Trƣớc khi phản ứng, dịch enzym và cơ chất đƣợc ủ ở 370C trong 15 phút. Thời gian phản ứng đƣợc tính từ lúc thêm 0,1ml dịch enzym vào dung dịch cơ chất. Tiếp tục ủ trong 30 phút. Hút 200μl dịch sau phản ứng ra đĩa Costar 96 giếng để tiến hành đo quang ở bƣớc sóng 290nm.
Song song tiến hành với mẫu trắng: 5,40ml đệm phosphate pH 7,5 + 0,1ml enzym.
Thông số đánh giá
Ảnh hƣởng của cao toàn phần hạt cần tây lên hoạt độ XO trên gan chuột thực nghiệm sẽ đƣợc đánh giá thông qua sự biến thiên mật độ quang ∆OD của acid uric – sản phẩm đƣợc tạo ra trong phản ứng giữa cơ chất xanthin với enzym XO đƣợc chiết ra từ gan chuột của lô thử so với lô chứng.
- Mật độ quang đo đƣợc của từng mẫu:
∆ODmẫu = ODthử - ODtrắng của thử Trong đó:
ODthử: mật độ quang của mẫu thử.
- Tỷ lệ giảm mật độ quang của lô thử so với lô chứng trắng. I(%) =
Trong đó:
∆ODc, ∆ODt: mật độ quang của các mẫu ở lô chứng, lô thử. I (%):tỷ lệ giảm mật độ quang acid uric của lô thử so với lô chứng.