Ngâm bột dƣợc liệu đã xay thô với dung môi ethanol 96% ở nhiệt độ phòng trong 72 giờ. Lặp lại 3 lần.
Dịch chiết sau 3 lần ngâm đƣợc cất thu hồi dung môi dƣới áp suất giảm. Loại bỏ chất béo bằng cách lắc với ether dầu hỏa. Sản phẩm thu đƣợc đƣợc sấy trong tủ sấy chân không đến khi trở thành cao khô.
Hình 2.1. Quy trình chiết xuất cao toàn phần hạt cần tây 2.2. PHƢƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU
2.2.1. Động vật thí nghiệm
- Chuột nhắt trắng chủng Swiss, giống đực, cân nặng từ 18-22g, khỏe mạnh
do Viện Vệ sinh dịch tễ trung ƣơng cung cấp.
- Chuột cống trắng chủng Wistar, giống đực, 8 tuần tuổi, cân nặng từ 130- 150g, khỏe mạnh do Học viện Quân y cung cấp.
Động vật đƣợc nuôi ổn định với điều kiện phòng thí nghiệm ít nhất 5 ngày trƣớc khi thực hiện nghiên cứu, đƣợc nuôi dƣỡng bằng thức ăn tiêu chuẩn do Viện Vệ sinh dịch tễ trung ƣơng cung cấp, uống nƣớc tự do.
2.2.2. Hóa chất, thuốc thử
- cid uric, ≥ 99%, dạng tinh thể, dùng cho nghiên cứu và phát triển (Sigma Aldrich).
- Bộ hóa chất định lƣợng acid uric huyết thanh gồm hóa chất phản ứng và acid uric chuẩn (Teco Diagnostics).
- Carrageenan (Sigma Aldrich).
- Indomethacin, tiêu chuẩn phân tích (Viện Kiểm nghiệm thuốc trung ƣơng - Bộ Y tế).
- Hóa chất để pha mẫu dƣợc liệu: dimethyl sulfoxid (Merck).
- Kali oxonat, 97%, dùng cho nghiên cứu và phát triển (Sigma Aldrich). - Xanthin, ≥ 99% Sigma ldrich .
- Xanthine oxidase từ sữa bò (0,8 U/mg protein, 9 mg protein/ml, Sigma Aldrich).
- Các dung môi cho chiết xuất: ethanol, ether dầu hỏa đạt tiêu chuẩn công nghiệp.
- Các dung môi, hệ đệm dùng cho phản ứng enzym đạt tiêu chuẩn phân tích. - Các hóa chất, dung môi khác đạt tiêu chuẩn dƣợc dụng.
2.2.3. Thiết bị
- Máy sinh hóa TC 84 plus (Teco Diagnostics). - Máy đo độ phù chân chuột LE 7500.
- Máy ly tâm HERMLE Z300.
- Máy ly tâm lạnh Sigma 3-18K (Sartorius). - Thiết bị nghiền đồng thể.
- Hệ thống ELISA gồm máy đọc khay vi tinh thể Biotek, Hoa Kì và máy ủ lắc khay (Awareness, Hoa Kì).
- Máy đo pH EUTECH).
- Máy cất quay Buchi Rotavapor R210. - Cân phân tích AY 220 (SHIMADZU).
- Tủ ấm điều nhiệt Memmert.
- Các dụng cụ sử dụng lấy mẫu và xét nghiệm: micropipet và đầu côn tƣơng ứng, dụng cụ thủy tinh, bơm kim tiêm các loại, mao quản, ống nghiệm các loại.
2.3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
Để đạt đƣợc các mục tiêu nghiên cứu đã đặt ra, đề tài đƣợc thiết kế với các nội dung tiến hành nhƣ sau:
- Đánh giá tác dụng hạ acid uric của cây cần tây trên thực nghiệm. - Đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro và in vivo. - Đánh giá tác dụng chống viêm của cây cần tây trên thực nghiệm. Thiết kế nội dung nghiên cứu đƣợc mô tả ở hình 2.2.
2.4. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.4.1. Phương pháp đánh giá tác dụng hạ acid uric huyết thanh trên mô hình gây tăng acid uric cấp thực nghiệm. tăng acid uric cấp thực nghiệm.
Thiết kế thí nghiệm
Đánh giá tác dụng hạ acid uric huyết thanh trên mô hình gây tăng acid uric cấp bằng kali oxonat [6], [48], [26].
Chuột nhắt trắng, đực, trƣởng thành đƣợc chia ngẫu nhiên thành các lô: - Lô chứng: uống dung môi.
- Lô đối chiếu: uống thuốc đối chiếu allopurinol.
- Các lô thử: uống cao toàn phần hạt cần tây ở các mức liều thử nghiệm Quy trình thí nghiệm đƣợc mô tả ở hình 2.3
4 ngày Ngày thứ năm
Tiêm kali oxonat
Nhịn ăn Uống thuốc Lấy máu
Uống thuốc
hàng ngày 30 phút 60 phút 120 phút
Hình 2.3. Quy trình thí nghiệm đánh giá tác dụng hạ acid uric máu trên mô hình gây tăng cấp bằng kali oxonat
Thông số đánh giá
- Nồng độ acid uric trong huyết thanh chuột thí nghiệm.
- Tỷ lệ giảm nồng độ acid huyết thanh của lô thử so với lô chứng. I (%)=
Trong đó :
Cc, Ct: nồng độ acid uric huyết thanh của lô chứng, lô thử.
2.4.2. Phương pháp đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro và in vivo
2.4.2.1. Phương pháp đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro
Nguyên tắc
XO xúc tác cho quá trình oxy hóa xanthin thành acid uric:
Xanthin + O2 + H2O uric acid + H2O2
Hoạt độ XO tỷ lệ với lƣợng acid uric định lƣợng đƣợc bằng phƣơng pháp đo quang ở bƣớc sóng 290nm.
Thiết kế thí nghiệm
Thí nghiệm đƣợc thực hiện trên đĩa 96 giếng. Bố trí trong một đĩa gồm: mẫu chứng và mẫu thử.
Thành phần trong mẫu chứng và mẫu thử đƣợc thể hiện ở bảng 2.1.
Bảng 2.1. Thành phần mẫu chứng và mẫu thử Mẫu chứng Mẫu thử Dung dịch thử 0 50μl Dung dịch đệm phosphate pH 7,5 85 μl 35μl Xanthin 150μM 60μl 60μl XO 0,01U/ml 30μl 30μl HCl 1M 25μl 25μl Tổng thể tích 200μl 200μl XO
Quy trình thí nghiệm đƣợc mô tả ở hình 2.4
Hình 2.4. Quy trình thí nghiệm đánh giá tác dụng ức chế XO in vitro
Thông số đánh giá - ∆OD: ∆ODchứng = ODchứng - ODtrắng chứng. ∆ODthử = ODthử - ODtrắng thử - I (%) ức chế tính theo công thức:
- IC50 ƣớc tính: là nồng độ lý thuyết mà tại đó ức chế 50% hoạt độ xanthin oxidase.
2.4.2.2. Phương pháp đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase in vivo
Thiết kế thí nghiệm
Áp dụng mô hình đánh giá ảnh hƣởng lên hoạt độ XO gan chuột thực nghiệm [6]. Chuột nhắt trắng, đực, trƣởng thành đƣợc chia ngẫu nhiên vào các lô:
- Lô chứng: uống dung môi.
- Lô đối chiếu: uống thuốc đối chiếu allopurinol.
Phương pháp chiết enzym
Kết thúc thực nghiệm, giết chuột bằng cách kéo dãn đốt sống cổ, lấy ngay gan từng chuột. Cân ngay 1g gan, cắt thành các mảnh nhỏ, cho vào ống nghiền đồng thể đã để lạnh và có sẵn 1ml dung dịch đệm phosphate lạnh (pH = 7,5). Nghiền gan trong điều kiện lạnh đến khi thu đƣợc dịch đồng thể, sau đó thêm dần đệm lạnh để thu đƣợc dịch đồng thể với tỷ lệ gan : đệm tƣơng ứng là 1:10. Dịch nghiền thu đƣợc đem ly tâm lạnh ở 00
C với tốc độ 3000 vòng trong 10 phút. Lấy phần dịch nổi tiếp tục đem ly tâm lạnh ở 00C với tốc độ 10000 vòng trong 60 phút. Phần dịch trong thu đƣợc sau khi ly tâm dùng để xác định hoạt độ enzym. Toàn bộ các bƣớc của thí nghiệm đƣợc thực hiện trong điều kiện lạnh (môi trƣờng nƣớc đá đang tan .
Phản ứng enzym
Phản ứng đƣợc thực hiện trong ống nghiệm gồm 2,90ml đệm phosphate (0,05M, pH 7,5); 2,50ml dung dịch đệm cơ chất gồm xanthin 0,12mM, EDTA 0,192mM, kali oxonat 2,2mM. Trƣớc khi phản ứng, dịch enzym và cơ chất đƣợc ủ ở 370C trong 15 phút. Thời gian phản ứng đƣợc tính từ lúc thêm 0,1ml dịch enzym vào dung dịch cơ chất. Tiếp tục ủ trong 30 phút. Hút 200μl dịch sau phản ứng ra đĩa Costar 96 giếng để tiến hành đo quang ở bƣớc sóng 290nm.
Song song tiến hành với mẫu trắng: 5,40ml đệm phosphate pH 7,5 + 0,1ml enzym.
Thông số đánh giá
Ảnh hƣởng của cao toàn phần hạt cần tây lên hoạt độ XO trên gan chuột thực nghiệm sẽ đƣợc đánh giá thông qua sự biến thiên mật độ quang ∆OD của acid uric – sản phẩm đƣợc tạo ra trong phản ứng giữa cơ chất xanthin với enzym XO đƣợc chiết ra từ gan chuột của lô thử so với lô chứng.
- Mật độ quang đo đƣợc của từng mẫu:
∆ODmẫu = ODthử - ODtrắng của thử Trong đó:
ODthử: mật độ quang của mẫu thử.
- Tỷ lệ giảm mật độ quang của lô thử so với lô chứng trắng. I(%) =
Trong đó:
∆ODc, ∆ODt: mật độ quang của các mẫu ở lô chứng, lô thử. I (%):tỷ lệ giảm mật độ quang acid uric của lô thử so với lô chứng.
2.4.3. Phương pháp đánh giá tác dụng chống viêm thực nghiệm
2.4.3.1. Đánh giá tác dụng chống viêm cấp trên mô hình gây phù bàn chân chuột bằng carrageenan bằng carrageenan
Thiết kế thí nghiệm
Sử dụng mô hình gây phù bằng carrageenan theo Winter [42]. Chuột cống trắng đực đƣợc chia ngẫu nhiên thành các lô: - Lô chứng: uống dung môi.
- Lô đối chiếu: uống indomethacin.
- Các lô thử: uống cao toàn phần hạt cần tây ở các mức liều thử nghiệm. Quy trình thí nghiệm đƣợc mô tả ở hình 2.5.
4 ngày Ngày thứ năm
- Uống thuốc - Gây viêm Nhịn ăn Uống thuốc hàng ngày 1,5 giờ V0 V1 V3 V5 V7
Đo thể tích bàn chân gây viêm
Hình 2.5. Quy trình đánh giá tác dụng chống viêm cấp trên mô hình gây phù bàn chân chuột bằng carrageenan
Thông số đánh giá
- Thể tích bàn chân sau phải của từng chuột.
- Mức độ phù bàn chân sau phải của từng chuột đƣợc tính theo công thức: ∆V (%) = [(Vt-V0)/Vo] ×100
∆V: Mức độ phù bàn chân chuột tại thời điểm t giờ sau khi gây viêm. V0, Vt: Thể tích bàn chân chuột trƣớc và sau khi gây viêm t giờ. - % ức chế phù của các lô thử so với lô chứng đƣợc tính theo công thức:
I (%) =
I (%): Phần trăm ức chế phù của lô thử so với lô chứng.
∆Vc, ∆Vt: Mức độ phù chân chuột trung bình ở lô chứng và lô thử.
2.4.3.2.Phương pháp đánh giá tác dụng chống viêm trên mô hình gây viêm màng hoạt dịch khớp gối
Sử dụng mô hình gây viêm màng hoạt dịch khớp gối bằng tinh thể natri urat của McCarty và Faires [42].
Chuẩn bị hỗn dịch tinh thể natri urat
Hòa tan 0,4g 0,01 mol natri hydroxid trong 400ml nƣớc cất. Thêm 1,68g (0,01 mol acid uric. Để qua đêm ở nhiệt độ phòng. Lọc hút chân không thu đƣợc tinh thể, rửa 3 lần bằng nƣớc muối sinh lý lạnh. Tạo lại hỗn dịch bằng nƣớc muối sinh lý và tiệt trùng trong nồi hấp. Hỗn dịch natri urat thu đƣợc cuối cùng có nồng độ 48 mg/ml.
Thiết kế thí nghiệm
Chuột cống trắng đực đƣợc chia ngẫu nhiên thành các lô: - Lô chứng: uống dung môi.
- Lô đối chiếu: uống thuốc đối chiếu indomethacin.
- Các lô thử: uống cao toàn phần hạt cần tây ở các mức liều thử nghiệm. . Thông số đánh giá
Sử dụng bảng thang điểm để đánh giá mức độ viêm dựa trên triệu chứng nhƣ bảng 2.2 sau:
Bảng 2.2. Thang điểm đánh giá mức độ viêm dựa trên triệu chứng
Các quan sát viên đƣợc huấn luyện cách quan sát và thống nhất cách đánh giá trƣớc khi làm thực nghiệm chính thức. Kết quả cuối cùng đƣợc ghi nhận từ quan sát của 3 quan sát viên độc lập và áp dụng phƣơng pháp cho điểm mù.
2.4.4. Phương pháp xử lý số liệu
Kết quả đƣợc biểu diễn dƣới dạng M ± SE (M: giá trị trung bình của từng lô, SE: sai số chuẩn). So sánh giá trị trung bình giữa các lô bằng one-way ANOVA, dùng hậu kiểm để so sánh giá trị trung bình của các lô thử so với lô chứng.
Với các số liệu không thuộc phân phối chuẩn, kết quả đƣợc trình bày dƣới dạng trung vị và khoảng dao động (giá trị cực tiểu - giá trị cực đại). Dùng thuật toán Kruskal Wallis để so sánh giữa các lô, Mann-Whitney test để so sánh kết quả giữa lô thử và lô chứng.
IC50 và khoảng tin cậy 95% đƣợc xác định bằng phƣơng pháp hồi quy probit. Phân tích thống kê bằng phần mềm SPSS 20.0, sự khác biệt giữa các lô đƣợc coi là có ý nghĩa khi p < 0,05.
Triệu chứng Mô tả Điểm
Không thể hiện rõ triệu chứng
Chuột không có hoặc không thể hiện rõ biểu
hiện di chuyển bất thƣờng 1
Đi khập khiễng Chuột đi tập tễnh trong toàn bộ thời gian di chuyển, chân có khớp bị đau vẫn tham gia vào quá trình di chuyển
2
Đi bằng 3 chân không liên tục
Chuột đi tập tễnh nhƣng thỉnh thoảng chân có khớp bị đau không thể tham gia vào quá trình di chuyển, phải kéo lê hoặc co chân
3
Đi hoàn toàn bằng 3 chân
Chân có khớp bị đau không thể tham gia vào quá trình di chuyển, không thể cử động khớp bị viêm, phải kéo lê hoặc co chân
CHƢƠNG 3: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
3.1. KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG HẠ ACID URIC CỦA CAO TOÀN PHẦN HẠT CẦN TÂY PHẦN HẠT CẦN TÂY
Chuột nhắt đƣợc nuôi ổn định trong phòng thí nghiệm và đƣợc chia ngẫu nhiên thành 4 lô:
- Lô chứng: uống dung môi pha thuốc Na-CMC 0,5%. - Lô đối chiếu: uống allopurinol 10 mg/kg.
- Lô cao toàn phần 1: uống cao toàn phần hạt cần tây liều 250 mg/kg pha trong Na-CMC 0,5%.
- Lô cao toàn phần 2: uống cao toàn phần hạt cần tây liều 500 mg/kg pha trong Na-CMC 0,5%.
Chuột đƣợc uống thuốc với cùng thể tích 0,1ml/10g vào một giờ nhất định hàng ngày trong vòng 5 ngày trƣớc khi làm thí nghiệm. Trƣớc khi dùng dung môi hoặc thuốc 1,5 giờ, chuột không đƣợc ăn nhƣng đƣợc uống nƣớc bình thƣờng. Ngày thứ 5, chuột ở các lô đƣợc tiêm màng bụng kali oxonat với liều 500 mg/kg 1 giờ trƣớc khi uống thuốc lần cuối. Sau khi uống thuốc 2 giờ, lấy máu từ xoang hốc mắt của chuột, để lắng tự nhiên ở nhiệt độ phòng 1 giờ trƣớc khi đem ly tâm với tốc độ 3500 vòng trong 10 phút để lấy huyết thanh. Xác định nồng độ acid uric trong huyết thanh chuột thí nghiệm.
Bảng 3.1. Kết quả đánh giá tác dụng hạ acid uric của cao toàn phần hạt cần tây trên mô hình gây tăng acid uric cấp
Lô Liều dùng ( mg/kg) n Nồng độ acid uric (μmol/l) Tỷ lệ giảm so với chứng bệnh (%) Chứng bệnh - 15 259,01 ± 22,87 Allopurinol 10 17 52,56 ± 4,75** 79,7 Cao toàn phần 1 250 17 105,41 ± 10,41** 59,3 Cao toàn phần 2 500 15 122,81 ± 12,87** 52,5
**, p < 0,01 khi so sánh với lô chứng bệnh
Hình 3.1. Kết quả đánh giá tác dụng hạ acid uric của cao toàn phần hạt cần tây trên mô hình gây tăng acid uric cấp, ** p < 0,01 khi so sánh với lô chứng bệnh
Nhận xét:
- Cao toàn phần cần tây với liều 250 mg/kg và 500 mg/kg có tác dụng giảm nồng độ acid uric huyết thanh chuột nhắt trắng thí nghiệm trên mô hình gây
tăng acid uric cấp bằng kali oxonat, tỷ lệ giảm so với lô chứng bệnh lần lƣợt là 59,3% và 52,5% (p < 0.01).
- Thuốc đối chiếu allopurinol liều 10 mg/kg có tác dụng hạ acid uric huyết thanh rõ rệt tỷ lệ giảm so với chứng bệnh là 79,7% (p < 0,01).
- Khi so sánh nồng độ acid uric huyết thanh giữa hai lô thử dùng liều 250 mg/kg và 500 mg/kg, sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê.
3.2. KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG ỨC CHẾ XO IN VITRO VÀ IN VIVO CỦA CAO TOÀN PHẦN HẠT CẦN TÂY VIVO CỦA CAO TOÀN PHẦN HẠT CẦN TÂY
3.2.1. Kết quả đánh giá tác dụng ức chế XO in vitro của cao toàn phần hạt cần tây
Khi một thuốc làm giảm nồng độ acid huyết thanh, cơ chế tác dụng thƣờng đƣợc dự đoán theo 2 hƣớng: làm giảm tổng hợp acid uric (thƣờng do ức chế XO) và/hoặc làm tăng thải trừ acid uric. Trong đó, hƣớng ức chế XO thƣờng đƣợc nghĩ đến nhiều hơn. Vì vậy, bƣớc đầu, chúng tôi tiến hành đánh giá tác dụng ức chế XO
in vitro của cao hạt cần tây.
Mẫu cao hạt cần tây sẽ đƣợc thử tác dụng ức chế XO in vitro tại 3 nồng độ 100 μg/ml, 50 μg/ml, 10 μg/ml. Mỗi nồng độ đƣợc tiến hành thử ba lần, mỗi lần thử ba