Nguồn nấm Fusarium sp. và Rhizopus sp. được nhận từ Bộ môn Bảo Vệ Thực Vật, Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng, trường Đại Học Cần Thơ.
Nguồn dịch trích: lá neem (Azadirachta indica), lá lược vàng (Callisia fragrans). Hóa chất CaCl2.2H2O được cung cấp từ phòng thí nghiệm Nedo của Bộ môn.
Môi trường được sử dụng trong thí nghiệm
Môi trường Potato Dextrose Agar (PDA) (Atlas, 2004)
Khoai tây 200 g Đường dextrose 20 g Agar 20 g Nước cất 1000 ml pH 6,7 2.2 PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM
Thí nghiệm được thực hiện tại phòng thí nghiệm phòng trừ sinh học và khu nhà lưới thuộc Bộ môn Bảo vệ Thực vật, Khoa Nông nghiệp & Sinh học Ứng dụng, trường Đại học Cần Thơ từ tháng 03 năm 2013 đến tháng 12 năm 2013.
18
Phương pháp thực hiện gồm 3 thí nghiệm cho mỗi loại nấm.
2.2.1 Thí nghiệm 1 Khả át ảnh hư ng củ nồng đ và các thời gian xử lý của CaCl2 và dịch trích thực vật đến ự hát triển huẩn ty nấm Fusarium sp. và
Rhizopus . tr ng điều kiện in vitro
Mục đích thí nghiệm: đánh giá hiệu quả của hai loại dịch trích thực vật và CaCl2 đối với Fusarium sp. và Rhizopus sp. trong điều kiện in vitro.
Bảng 2.1: Nồng đ CaCl2 và dịch trích thực vật được sử dụng trong thí nghiệm 1
Số thứ tự Tên thuốc/dịch trích thực vật Nồng độ Nồng độ 1 Nồng độ 2 Nồng độ 3 1 CaCl2 20 mM 40 mM 60 mM 2 Lá neem 2% 4% 6% 3 Lá lược vàng 2% 4% 6% Thực hiện thí nghiệm:
Thí nghiệm được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên gồm 10 nghiệm thức (hai loại dịch trích, hóa chất CaCl2 và một nghiệm thức đối chứng) và 6 lần lặp lại. Loại dịch trích thực vật và nồng độ dịch trích được trình bày trong Bảng 2.1. Nghiệm thức đối chứng là môi trường PDA không có chứa dịch trích thực vật.
Chuẩn bị nguồn nấm: nấm được nuôi cấy trong đĩa petri khoảng 10-15 ngày trước khi tiến hành thí nghiệm.
Thực vật được sử dụng làm dịch trích sẽ được thu vào buổi sáng (khoảng 7h30), lá neem được chọn làm dịch trích là những lá có màu xanh đậm (lá tương đối già), đối với lược vàng chọn những lá xanh đậm, còn nguyên vẹn, không bị rách hoặc nhiễm nấm bệnh. Thực vật sau khi thu về sẽ được rửa sạch đất cát, sau đó để ráo nước và cân thực vật với khối lượng 30 g (trọng lượng tươi) rồi nghiền với 30 ml nước cất thanh trùng trong cối và chày thủy tinh đã thanh trùng khô. Sau đó, rót phần dịch trích thu được qua giấy lọc hatman (có đường kính lỗ lọc 0,5 µm) vào 1 cốc thủy tinh đã thanh trùng khô (dịch trích trong cốc thủy tinh đạt nồng độ đậm đặc 100%). Dùng bọc nilong bao cả bộ cốc thủy tinh và giấy lọc bên trên.
Nấu tan môi trường PDA. Khi chai môi trường đạt nhiệt độ khoảng 55-60oC (có thể cầm được chai môi trường bằng tay) thì đưa 2, 4 và 6 ml dịch trích thực vật đã chuẩn bị sẵn (lượng dịch trích này được trích ra từ cốc thủy tinh đậm đặc 100%)
19
vào chai thủy tinh tương ứng chứa 98, 96 và 94 ml môi trường PDA sẽ đạt được nồng độ ở Bảng 2.1, lắc chai môi trường để dịch trích hòa tan đều vào môi trường. Sau đó, môi trường trong chai sẽ được đổ vào các đĩa Petri (10 ml môi trường/đĩa petri). Sau khi môi trường đặc lại, đặt các khoanh khuẩn ty nấm đã chuẩn bị vào chính giữa đĩa petri (Dhinggra và Sinclair, 1995) (Hình 2.1).
Hình 2.1 Sơ đồ bố trí thử nghiệm hiệ ả củ dịch trích thực vật đối với nấm gây bệnh sau thu hoạch.
Ch ti ghi nhận ghi nhận đường kính khuẩn lạc của nấm vào các thời điểm 24, 48, 72, 96... giờ sau đặt khoanh khuẩn ty. Chỉ tiêu được ngừng ghi nhận khi khuẩn lạc của nấm phát triển đến mép đĩa petri.
Hiệu quả của hóa chất được tính theo công thức: (ĐKKLđc – ĐKKLi)
HQT (%) = x 100 ĐKKLđc
Trong đó: ĐKKLđc: Đường kính khuẩn lạc của nghiệm thức đối chứng ĐKKLi: Đường kính khuẩn lạc của nghiệm thức thuốc i.
Môi trường đã có dịch trích thực vật theo nồng độ tính sẵn Khoanh khuẩn ty nấm gây bệnh
(đường kính khoảng 7 mm)
20
2.2.2 Thí nghiệm 2 Đánh giá hiệ ả củ việc ử l CaCl2, dịch trích lá neem và dịch trích lá lược vàng khi lây ệnh nhân tạ tr n trái
Các thí nghiệm sẽ được thực hiện với 12 lặp lại, 1 trái/lặp lại. Chọn các trái đồng đều về kích thước, màu sắc và được xử lý bằng cồn 70o trước khi thí nghiệm. Các thí nghiệm được thực hiện theo phương pháp của Talibi và ctv. (2011) và Yu và ctv. (2012).
Mục đích thí nghiệm: ghi nhận hiệu quả của hóa chất CaCl2, dịch trích lá neem và lá lược vàng trong việc ức chế sự phát triển của nấm bệnh khi mầm bệnh đã hiện diện trên trái.
Thực hiện thí nghiệm:
Thí nghiệm được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên gồm 4 nghiệm thức (gồm hai dịch trích, CaCl2 và nghiệm thức đối chứng xử lý với nước cất vô trùng) và 12 lặp lại (1 trái/lặp lại).
- Từ thí nghiệm 1: đối với nấm Fusarium sp. nghiệm thức CaCl2 và dịch trích được chọn là lá neem 6%, lược vàng 6% và hóa chất CaCl2 20 mM.
- Từ thí nghiệm 1: đối với nấm Rhizopus sp. nghiệm thức dịch trích được chọn là lá neem 4%.
Chuẩn bị nguồn nấm: nấm được nuôi cấy trong đĩa petri khoảng 10-15 ngày trước khi tiến hành thí nghiệm.
Dịch trích thực vật được thu và pha nồng độ tương tự như thí nghiệm 1.
Phương pháp lây bệnh và xử lý dịch trích: tất cả các dụng cụ đã được thanh trùng. Đầu tiên, tạo vết thương trên trái bằng cách dùng một bó kim ghim (gồm 9 cây kim) châm lên phần mô trái với độ sâu 2 mm, châm 3 điểm trên thân trái. Sau khi châm để trái khoảng 30 phút bắt đầu tiến hành chủng bệnh. Tiếp đến, dùng pipet hút 10-15 ml nước cất thanh trùng cho vào đĩa nấm nguồn đã làm thuần và pha tạo huyền phù. Sau đó, dùng lame đếm hồng cầu để đếm mật số bào tử trong huyền phù (mật số 106 bào tử/ml), xong dùng pipet hút 1 ml huyền phù bào tử nấm nhỏ lên những vết thương trên trái. Sau đó để trái vào bọc nilon và buột chặt lại ủ ở điều kiện 250C. Sau khi lây bệnh khoảng 12-24 giờ, trái sẽ được xử lý dịch trích và CaCl2 theo nồng độ, lần lượt nhúng từng trái vào nồng độ dịch trích và CaCl2 đã chuẩn bị sẵn, mỗi trái nhúng khoảng 20 giây, sao cho cả trái thấm đều dịch trích và hóa chất CaCl2. Sau khi xử lý dịch trích xong, trái sẽ để trong bọc nilong riêng có bổ sung ẩm độ và ủ ở điều kiện nhiệt độ phòng (28-300C).
21
Ch tiêu ghi nhận: bắt đầu ghi nhận đường kính vết bệnh ở các thời điểm tính từ thời điểm trái bắt đầu xuất hiện triệu chứng đầu tiên. Ghi nhận cho đến khi đường kính vết bệnh của các vết thương trên trái giao nhau.
Hiệu quả ức chế (%) đường kính vết bệnh được tính theo công thức của Yu và ctv. (2012):
TBDKVBđc - TBDKVBi
HQT (%) = x 100 TBDKVBđc
Trong đó: TBDKVBĐC: trung bình đường kính vết bệnh của nghiệm thức đối chứng TBDKVBi: trung bình đường kính vết bệnh của nghiệm thức thuốc i.
2.2.3 Thí nghiệm Đánh giá hiệ ả củ việc ử l C Cl2, dịch trích lá neem và dịch trích lá lược vàng trước khi lây ệnh nhân tạ tr n trái
Các thí nghiệm sẽ được thực hiện với 12 lặp lại, 1 trái/ lặp lại. Chọn các trái đồng đều về kích thước, màu sắc và được xử lý bằng cồn 70o trước khi thí nghiệm. Các thí nghiệm được thực hiện theo phương pháp của Talibi và ctv. (2011) và Yu và ctv. (2012).
Mục đích thí nghiệm: ghi nhận hiệu quả của CaCl2, dịch trích lá neem và lá lược vàng ức chế sự phát triển của bệnh khi mầm bệnh chưa hiện trên trái.
Thực hiện thí nghiệm:
Thí nghiệm được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên gồm 4 nghiệm thức (gồm hai dịch trích, hóa chất CaCl2 và nghiệm thức đối chứng không xử lý) và 12 lặp lại (1 trái/lặp lại).
- Từ thí nghiệm 1: đối với nấm Fusarium sp. nghiệm thức CaCl2 và dịch trích được chọn là lá neem 6%, lược vàng 6% và hóa chất CaCl2 20 mM.
- Từ thí nghiệm 1: đối với nấm Rhizopus sp. nghiệm thức dịch trích được chọn là lá neem 4%.
Chuẩn bị nguồn nấm: nấm được nuôi cấy trong đĩa petri khoảng 10-15 ngày trước khi tiến hành thí nghiệm
22
Phương pháp xử lý dịch trích và lây bệnh trên trái: Trái sẽ được xử lý CaCl2, dịch trích là neem và lá lược vàng theo nồng độ trước, lần lượt nhúng từng trái vào nồng độ dịch trích và CaCl2 đã chuẩn bị sẵn, mỗi trái nhúng khoảng 20 giây, sao cho cả trái thấm đều dịch trích và CaCl2, sau đó trái sẽ để trong bọc nilong riêng có bổ sung ẩm độ và ủ ở điều kiện nhiệt độ 250C, sau 24 giờ xử lý dịch trích bắt đầu tiến hành chủng bệnh, tất cả các dụng cụ đã được thanh trùng. Đầu tiên, tạo vết thương trên trái bằng cách dùng một bó kim ghim (gồm 9 cây kim) châm lên phần mô trái với độ sâu 2 mm, châm 3 điểm trên thân trái. Sau khi châm để trái khoảng 30 phút thì bắt đầu tiến hành chủng bệnh. Tiếp đến, dùng pipet hút 10-15 ml nước cất thanh trùng cho vào đĩa nấm nguồn đã làm thuần và pha tạo huyền phù. Sau đó, dùng lame đếm hồng cầu để đếm mật số bào tử trong huyền phù (mật số 106 bào tử/ml), xong dùng pipet hút 1 ml huyền phù bào tử nấm nhỏ lên những vết thương trên trái. Sau đó để trái vào bọc nilon và buột chặt lại ủ ở điều kiện 250
C trong một ngày rồi chuyển về điều kiện phòng (28-300C) để theo dõi quá trình phát triển của bệnh qua các thời điểm.
Ch tiêu ghi nhận: bắt đầu ghi nhận đường kính vết bệnh trên trái ở các thời điểm tính từ thời điểm trái bắt đầu xuất hiện triệu chứng đầu tiên. Ghi nhận cho đến khi đường kính vết bệnh của các vết thương trên trái giao nhau.
Hiệu quả ức chế (%) đường kính vết bệnh được tính theo công thức của Yu và ctv. (2012):
TBDKVBđc - TBDKVBi
HQT (%) = x 100 TBDKVBđc
Trong đó: TBDKVBĐC: trung bình đường kính vết bệnh của nghiệm thức đối chứng TBDKVBi: trung bình đường kính vết bệnh của nghiệm thức thuốc i.
23
CHƯƠNG
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 KẾT QUẢ KHẢO SÁT HIỆU QUẢ PHÒNG TRỊ CỦA CaCl2, DỊCH TRÍCH LÁ NEEM VÀ LÁ LƯỢC VÀNG ĐỐI VỚI NẤM FUSARIUM SP. TRÍCH LÁ NEEM VÀ LÁ LƯỢC VÀNG ĐỐI VỚI NẤM FUSARIUM SP. GÂY HẠI TRÊN TRÁI CÀ CHUA SAU THU HOẠCH
3.1.1 Khả năng hạn chế sự phát triển khuẩn ty nấm của dịch trích thực vật và dung dịch CaCl2 tr ng điều kiện invitro dung dịch CaCl2 tr ng điều kiện invitro
Nhìn chung, qua kết quả ghi nhận vào bảy thời điểm 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ, 96 giờ, 120 giờ, 144 giờ và 168 giờ sau khi đặt khuẩn ty (GSKĐKT) (Bảng 3.1), có một số nghiệm thức xử lý thể hiện khả năng hạn chế sự phát triển đường kính khuẩn ty, và khả năng này thay đổi tùy theo nồng độ và thời gian quan sát.
Ở thời điểm quan sát đầu tiên (24 GSKĐKT), chỉ có ba nghiệm thức xử lý với dung dịch CaCl2 20 mM, dịch trích lá neem 4% và 6% thể hiện khả năng hạn chế sự phát triển đường kính khuẩn ty và khác biệt có ý nghĩa so với đối chứng. Trong đó, nghiệm thức dịch trích lá neem 6 % cho đường kính khuẩn ty nhỏ nhất (10,3 mm), kế đến là hai nghiệm thức neem 4% (11,5 mm) và CaCl2 20 mM (12,0 mm), so với nghiệm thức đối chứng (13,3 mm) (Bảng 3.1).
Tại thời điểm 48 GSKĐKT, ba nghiệm thức xử lý với dung dịch CaCl2 20 mM, dịch trích lá neem 4% và 6% tiếp tục thể hiện khả năng hạn chế sự phát triển của nấm Fusarium sp. với khác biệt có ý nghĩa so với nghiệm thức không xử lý. Bên cạnh đó, nghiệm thức dịch trích lá neem 2% và dịch trích lược vàng 2% bắt đầu thể hiện khả năng hạn chế sự phát triển khuẩn ty nấm. Trong đó, nghiệm thức dịch trích lá neem 6 % tiếp tục cho đường kính khuẩn ty nhỏ nhất (19,2 mm), kế đến là nghiệm thức neem 4% (21,7 mm), lược vàng 2% (21,8 mm), CaCl2 20 mM (23,0 mm) và nghiệm thức neem 2% (23,3 mm) so với nghiệm thức đối chứng (25,8 mm). Các nghiệm thức còn lại chưa thể hiện khả năng hạn chế sự phát triển khuẩn ty nấm, thể hiện qua chỉ tiêu đường kính khuẩn ty nấm khác biệt không ý nghĩa so với nghiệm thức đối chứng (Bảng 3.1).
Tại năm thời điểm cuối cùng (72, 96, 120, 144, 168 GSKĐKT), ngoại trừ ba nghiệm thức xử lý với dung dịch CaCl2 40 mM và 60 mM, dịch trích lược vàng 4%, các nghiệm thức còn lại đều thể hiện khả năng hạn chế sự phát triển khuẩn ty nấm. Tại thời điểm 168 GSKĐKT, đường kính khuẩn ty của các nghiệm thức trên
24
dao động trong khoảng 61 mm đến 68 mm, và thấp hơn có ý nghĩa so với nghiệm thức đối chứng (80,0 mm) (Bảng 3.1).
25
Bảng .1 Đường kính (mm) khuẩn ty của nấm Fusarium sp.tr ng điều kiện in vitro
Ghi chú *: số liệu khác biệt ở mức ý nghĩa 5 % ns : khác biệt không ý nghĩa thống kê Trong cùng một cột, những số có cùng chữ số theo sau thì khác biệt không ý nghĩa ở mức 5 %.
Nghiệm thức Thời gian quan sát (giờ sau khi đặt khuẩn ty)
Loại dịch trích Nồng độ 24h 48h 72h 96h 120h 144h 168h
Dung dịch CaCl2 20 mM 12,0 cd 23,0 cd 30,1 cde 38,9 de 46,3 bc 54,8 d 65,2 d 40 mM 12,8 bc 25,5 ab 32,8 abc 45,0 abc 55,8 a 63,5 abc 73,3 abc 60 mM 12,8 bc 26,2 a 34,5 ab 45,5 ab 57,7 a 65,2 ab 78,8 a Lá neem 2% 12,8 bc 23,3 bcd 30,7 cde 40,8 cd 50,0 b 58,5 cd 66,7 cd 4% 11,5 d 21,7 d 28,2 ef 37,5 de 45,8 bc 54,0 d 63,8 d 6% 10,3 e 19,2 e 25,3 f 35,6 e 43,7 c 52,5 d 62,2 d Lá lược vàng 2% 12,2 bcd 21,8 d 28,8 de 38,4 de 46,2 bc 54,4 d 60,6 d 4% 14,3 a 25,8 a 34,4 ab 45,8 ab 56,0 a 64,0 abc 74,2 ab 6% 13,3 ab 24,3 abc 31,4 bcd 41,7 bcd 50,2 b 60,7 bc 68,3 bcd Đối chứng nước cất 13,3 ab 25,8 a 34,9 a 48,0 a 59,0 a 68,8 a 80,0 a Mức ý nghĩa * * * * * * * CV (%) 6,96 7,92 8,03 8,84 8,30 7,87 8,47
26
Hiệu quả ức chế sự phát triển của khuẩn ty nấm trong điều kiện in vitro được thể hiện ở bảng 3.2. Ở thời điểm 24 GSKĐKT, ngoại trừ hai nghiệm thức lược vàng 4% và lược vàng 6%, các nghiệm thức còn lại đều có hiệu quả ức chế sự phát triển của khuẩn ty nấm, trong đó nghiệm thức neem 6% có hiệu quả cao nhất với 21,50% và khác biệt có ý nghĩa so với đối chứng. Sang 48 GSKĐKT nghiệm thức neem 6% tiếp tục thể hiện hiệu quả ức chế khuẩn ty nấm với 24,91%, các nghiệm thức còn lại không còn hiệu quả. Tại thời điểm 72 GSKĐKT, nghiệm thức dịch trích lá neem 6% lại tiếp tục thể hiện hiệu quả ức chế cao đối với sự phát triển khuẩn ty nấm (khoảng 27%), bên cạnh đó nghiệm thức neem 4% bắt đầu có hiệu quả ức chế với 18,93% và khác biệt có ý nghĩa so với đối chứng. Tuy nhiên, sang các thời điểm 96,120,144,172 GSKĐKT, tất cả các nghiệm thức xử lý không còn thể hiện hiệu quả ức chế khuẩn ty nấm (Bảng 3.2).
Theo kết quả của Moslem và EL-Kholie, (2009) cho thấy dịch trích lá neem ức chế hoàn toàn 100% sự phát triển của nấm Fusarium ở nồng độ 40%. Kết quả này chỉ ra rằng nấm Fusarium là nấm nhạy cảm nhất với dịch trích lá neem và dịch trích hạt neem (Gupta và Bansal, 2003; Amadioha, 2004). Và ở nồng độ 10%, dịch trích lá neem ức chế sự phát triển của nấm Fusarium hiệu quả từ 30,9-43,9%. Điều này phù hợp với sự ức chế phát triển nấm Fusarium của dịch trích neem 6%.
Riêng dịch trích lá lược vàng, kết quả thí nghiệm cho thấy các nồng độ thử nghiệm đều không cho hiệu quả hoặc hiệu quả đạt được rất thấp. Qua kết quả nghiên cứu của Nguyễn Thị Mỹ Linh (2013), Vương Hoàng Thân (2013), Võ Trọng Kỳ (2013), nhóm nghiên cứu chọn nồng độ 6% để tiếp tục khảo sát trên trái.
Dịch trích lá neem 6% và dịch trích lá lược vàng 6% là loại dịch trích được chọn để sử dụng khảo sát. Trong ba nghiệm thức xử lý hóa chất, nghiệm thức xử lý