Nhìn chung, qua kết quả ghi nhận vào bảy thời điểm 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ, 96 giờ, 120 giờ, 144 giờ và 168 giờ sau khi đặt khuẩn ty (GSKĐKT) (Bảng 3.1), có một số nghiệm thức xử lý thể hiện khả năng hạn chế sự phát triển đường kính khuẩn ty, và khả năng này thay đổi tùy theo nồng độ và thời gian quan sát.
Ở thời điểm quan sát đầu tiên (24 GSKĐKT), chỉ có ba nghiệm thức xử lý với dung dịch CaCl2 20 mM, dịch trích lá neem 4% và 6% thể hiện khả năng hạn chế sự phát triển đường kính khuẩn ty và khác biệt có ý nghĩa so với đối chứng. Trong đó, nghiệm thức dịch trích lá neem 6 % cho đường kính khuẩn ty nhỏ nhất (10,3 mm), kế đến là hai nghiệm thức neem 4% (11,5 mm) và CaCl2 20 mM (12,0 mm), so với nghiệm thức đối chứng (13,3 mm) (Bảng 3.1).
Tại thời điểm 48 GSKĐKT, ba nghiệm thức xử lý với dung dịch CaCl2 20 mM, dịch trích lá neem 4% và 6% tiếp tục thể hiện khả năng hạn chế sự phát triển của nấm Fusarium sp. với khác biệt có ý nghĩa so với nghiệm thức không xử lý. Bên cạnh đó, nghiệm thức dịch trích lá neem 2% và dịch trích lược vàng 2% bắt đầu thể hiện khả năng hạn chế sự phát triển khuẩn ty nấm. Trong đó, nghiệm thức dịch trích lá neem 6 % tiếp tục cho đường kính khuẩn ty nhỏ nhất (19,2 mm), kế đến là nghiệm thức neem 4% (21,7 mm), lược vàng 2% (21,8 mm), CaCl2 20 mM (23,0 mm) và nghiệm thức neem 2% (23,3 mm) so với nghiệm thức đối chứng (25,8 mm). Các nghiệm thức còn lại chưa thể hiện khả năng hạn chế sự phát triển khuẩn ty nấm, thể hiện qua chỉ tiêu đường kính khuẩn ty nấm khác biệt không ý nghĩa so với nghiệm thức đối chứng (Bảng 3.1).
Tại năm thời điểm cuối cùng (72, 96, 120, 144, 168 GSKĐKT), ngoại trừ ba nghiệm thức xử lý với dung dịch CaCl2 40 mM và 60 mM, dịch trích lược vàng 4%, các nghiệm thức còn lại đều thể hiện khả năng hạn chế sự phát triển khuẩn ty nấm. Tại thời điểm 168 GSKĐKT, đường kính khuẩn ty của các nghiệm thức trên
24
dao động trong khoảng 61 mm đến 68 mm, và thấp hơn có ý nghĩa so với nghiệm thức đối chứng (80,0 mm) (Bảng 3.1).
25
Bảng .1 Đường kính (mm) khuẩn ty của nấm Fusarium sp.tr ng điều kiện in vitro
Ghi chú *: số liệu khác biệt ở mức ý nghĩa 5 % ns : khác biệt không ý nghĩa thống kê Trong cùng một cột, những số có cùng chữ số theo sau thì khác biệt không ý nghĩa ở mức 5 %.
Nghiệm thức Thời gian quan sát (giờ sau khi đặt khuẩn ty)
Loại dịch trích Nồng độ 24h 48h 72h 96h 120h 144h 168h
Dung dịch CaCl2 20 mM 12,0 cd 23,0 cd 30,1 cde 38,9 de 46,3 bc 54,8 d 65,2 d 40 mM 12,8 bc 25,5 ab 32,8 abc 45,0 abc 55,8 a 63,5 abc 73,3 abc 60 mM 12,8 bc 26,2 a 34,5 ab 45,5 ab 57,7 a 65,2 ab 78,8 a Lá neem 2% 12,8 bc 23,3 bcd 30,7 cde 40,8 cd 50,0 b 58,5 cd 66,7 cd 4% 11,5 d 21,7 d 28,2 ef 37,5 de 45,8 bc 54,0 d 63,8 d 6% 10,3 e 19,2 e 25,3 f 35,6 e 43,7 c 52,5 d 62,2 d Lá lược vàng 2% 12,2 bcd 21,8 d 28,8 de 38,4 de 46,2 bc 54,4 d 60,6 d 4% 14,3 a 25,8 a 34,4 ab 45,8 ab 56,0 a 64,0 abc 74,2 ab 6% 13,3 ab 24,3 abc 31,4 bcd 41,7 bcd 50,2 b 60,7 bc 68,3 bcd Đối chứng nước cất 13,3 ab 25,8 a 34,9 a 48,0 a 59,0 a 68,8 a 80,0 a Mức ý nghĩa * * * * * * * CV (%) 6,96 7,92 8,03 8,84 8,30 7,87 8,47
26
Hiệu quả ức chế sự phát triển của khuẩn ty nấm trong điều kiện in vitro được thể hiện ở bảng 3.2. Ở thời điểm 24 GSKĐKT, ngoại trừ hai nghiệm thức lược vàng 4% và lược vàng 6%, các nghiệm thức còn lại đều có hiệu quả ức chế sự phát triển của khuẩn ty nấm, trong đó nghiệm thức neem 6% có hiệu quả cao nhất với 21,50% và khác biệt có ý nghĩa so với đối chứng. Sang 48 GSKĐKT nghiệm thức neem 6% tiếp tục thể hiện hiệu quả ức chế khuẩn ty nấm với 24,91%, các nghiệm thức còn lại không còn hiệu quả. Tại thời điểm 72 GSKĐKT, nghiệm thức dịch trích lá neem 6% lại tiếp tục thể hiện hiệu quả ức chế cao đối với sự phát triển khuẩn ty nấm (khoảng 27%), bên cạnh đó nghiệm thức neem 4% bắt đầu có hiệu quả ức chế với 18,93% và khác biệt có ý nghĩa so với đối chứng. Tuy nhiên, sang các thời điểm 96,120,144,172 GSKĐKT, tất cả các nghiệm thức xử lý không còn thể hiện hiệu quả ức chế khuẩn ty nấm (Bảng 3.2).
Theo kết quả của Moslem và EL-Kholie, (2009) cho thấy dịch trích lá neem ức chế hoàn toàn 100% sự phát triển của nấm Fusarium ở nồng độ 40%. Kết quả này chỉ ra rằng nấm Fusarium là nấm nhạy cảm nhất với dịch trích lá neem và dịch trích hạt neem (Gupta và Bansal, 2003; Amadioha, 2004). Và ở nồng độ 10%, dịch trích lá neem ức chế sự phát triển của nấm Fusarium hiệu quả từ 30,9-43,9%. Điều này phù hợp với sự ức chế phát triển nấm Fusarium của dịch trích neem 6%.
Riêng dịch trích lá lược vàng, kết quả thí nghiệm cho thấy các nồng độ thử nghiệm đều không cho hiệu quả hoặc hiệu quả đạt được rất thấp. Qua kết quả nghiên cứu của Nguyễn Thị Mỹ Linh (2013), Vương Hoàng Thân (2013), Võ Trọng Kỳ (2013), nhóm nghiên cứu chọn nồng độ 6% để tiếp tục khảo sát trên trái.
Dịch trích lá neem 6% và dịch trích lá lược vàng 6% là loại dịch trích được chọn để sử dụng khảo sát. Trong ba nghiệm thức xử lý hóa chất, nghiệm thức xử lý với dung dịch CaCl2 20mM được chọn để tiếp tục sử dụng trong các thí nghiệm trên trái.
27
Bảng 3.2: Hiệu quả ức chế (%) sự phát triển khuẩn ty nấm Fusarium sp. của các loại dịch trích và dung dịch CaCl2 tr ng điều kiện in vitro
Ghi chú *: số liệu khác biệt ở mức ý nghĩa 5 % ns : khác biệt không ý nghĩa thống kê Trong cùng một cột, những số có cùng chữ số theo sau thì khác biệt không ý nghĩa ở mức 5 %.
Nghiệm thức Thời gian quan sát (giờ sau khi đặt khuẩn ty)
Loại dịch trích Nồng độ 24h 48h 72h 96h 120h 144h 168h
Dung dịch CaCl2 20 mM 8,88 a 9,94 ab 13,28 abc 17,33 20,08 19,04 19,15 40 mM 2,89 a 0,26 ab 5,52 abc 5,00 4,62 7,19 7,87 60 mM 2,80 a 0,00 b 0,74 c 3,85 1,57 4,86 0,94 Lá neem 2% 2,33 a 8,75 ab 11,76 abc 13,68 14,50 14,25 16,26 4% 12,63 a 15,34 ab 18,93 ab 20,74 21,60 20,89 20,64 6% 21,50 a 24,91 a 27,00 a 24,92 25,08 22,90 25,07 Lá lược vàng 2% 7,36 a 13,93 ab 16,57 abc 17,97 20,62 19,99 25,17 4% 0,00 b 0,00 b 1,09 bc 3,21 4,26 6,23 6,50 6% 0,00 b 4,71 ab 9,54 abc 12,16 13,86 10,61 14,66 Đối chứng nước cất 0,00 b 0,00 b 0,00 c 0,00 0,00 0,00 0,00 Mức ý nghĩa * * * ns ns ns ns CV (%) 16,05 18,18 21,55 21,81 21,31 16,95 18,99
28
Hình 3.1: Hiệu quả của dịch trích thực vật và CaCl2 với nấm Fusarium sp.tr n môi trường PDA thời điểm 168 giờ sau thử nghiệm tr ng điều kiện in vitro.
(A): Đối chứng (B): CaCl2 20 mM (C): Neem 6% (D): Lược vàng 6%
A B
29
3.1.2 Hiệu quả của việc xử lý CaCl2, dịch trích lá neem và lá lược vàng sau khi lây bệnh nhân tạo trên trái
Kết quả bảng 3.3 cho thấy, ở thời điểm 48 giờ sau khi chủng bệnh (GSKCB) chỉ có nghiệm thức CaCl2 20mM thể hiện được khả năng ức chế bệnh (18,04mm) và khác biệt có ý nghĩa so với đối chứng (23,79mm), hai nghiệm thức còn lại là neem 6% và lược vàng 6% không có hiệu quả hoặc khác biệt không có ý nghĩa.
Ở thời điểm 72 (GSKCB), cho thấy cả 3 nghiệm thức đều thể hiện khả năng ức chế bệnh. Trong đó nghiệm thức neem 6% cho đường kính nhỏ nhất (29,71mm), kế đến là CaCl2 20mM (31,54mm) và lược vàng 6% (34,83mm) khác biệt có ý nghĩa so với đối chứng (40,88mm) (Bảng 3.3).
Tại 3 thời điểm (96, 120, 144 GSKCB), cả 3 nghiệm thức tiếp tục thể hiện khả năng ức chế bệnh và khác biệt có ý nghĩa so với đối chứng. Trong đó, nghiệm thức lược vàng 6% cho đường kính nhỏ nhất (45,58 mm; 58,92 mm và 70,17 mm; tương ứng ba thời điểm 96, 120 và 144 GSKCB), kế đến hai nghiệm thức lá neem 6% (46,92 mm; 63,25 mm và 84,83 mm) và CaCl2 20mM (49,33 mm; 64,63 mm và 85,92 mm), so với nghiệm thức đối chứng (58,21 mm; 73,67 mm và 93,46 mm) (Bảng 3.3).
Ở thời điểm 168 GSKCB, cho thấy ngoại trừ neem 6%, 2 nghiệm thức còn lại đều cho cho khả năng giảm bệnh. Trong đó nghiệm thức lược vàng 6% cho đường kính nhỏ nhất (84,33mm), kế đến là CaCl2 20mM (89,00mm) và khác biệt có ý nghĩa so với đối chứng (97,88mm) (Bảng 3.3).
Ở thời điểm cuối cùng là 192 GSKCB, cả 3 nghiệm thức đều thể hiện khả năng giảm bệnh. Trong đó nghiệm thức lược vàng 6% tiếp tục cho đường kính nhỏ nhất (98,75mm), kế đến là CaCl2 20mM (104,00mm) và neem 6% (108,33mm), cả 3 nghiệm thức đều khác biệt có ý nghĩa so với đối chứng (114,42mm) (Bảng 3.3).
Như vậy nghiệm thức CaCl2 20mM và lược vàng 6% cho đường kính thấp hơn ý nghĩa so với đối chứng và khả năng hạn chế bệnh kéo dài, nghiệm thức neem 6% cũng có hiệu quả nhưng không ổn định. Theo nghiên cứu trên trái quýt đường của Nguyễn Thị Tuyết Mai và ctv. (2012) cho thấy rằng nghiệm thức đối chứng có tỷ lệ trái bị nhiễm bệnh nhiều nhất là 3,2%, các nghiệm thức xử lý với CaCl2 6% có xuất hiện bệnh nhưng ít hơn so với đối chứng ở thời điểm 10 ngày sau thu hoạch và khác biệt thống kê ở mức ý nghĩa 5%. Nghiệm thức xử lý CaCl2 8% có tỷ lệ bệnh thấp nhất so với các nghiệm thức còn lại ở thời điểm 30 ngày sau khi bảo quản.
30
Calci là thành phần xây dựng và làm vững chắc vách tế bào thực vật. Vách tế bào thực vật bao quanh tế bào chất của tế bào giúp duy trì cấu trúc và hình dạng tế bào. Sự giảm bớt thành phần calci trong tế bào gây ra những lỗ hổng hoặc làm nứt trong vách tế bào, điều này sẽ dẫn đến gia tăng sự phát triển của vi khuẩn và nấm trên mô tế bào thực vật. Conway và Sam (1984) cũng đã chỉ ra rằng calci làm nâng cao sự phát triển của mô giúp chống lại sự xâm nhập của nấm bằng sự vững chắc của vách tế bào, bằng cách đó làm cho tế bào kháng lại những enzyme có hại gây ra bởi nấm và nó cũng giúp trì hoãn sự lão hóa của trái cây. Có lẽ vì thế mà bệnh xuất hiện ở các nghiệm thức có cung cấp thêm calci thấp hơn ở nghiệm thức đối chứng.
31
Bảng . Đường kính (mm) vết bệnh trên trái do nấm Fusarium . gây r tr ng điều kiện in vivo
Ghi chú *: số liệu khác biệt ở mức ý nghĩa 5 % ns : khác biệt không ý nghĩa thống kê Trong cùng một cột, những số có cùng chữ số theo sau thì khác biệt không ý nghĩa ở mức 5 %.
Nghiệm thức Thời gian quan sát (giờ sau khi chủng bệnh)
Loại dịch trích Nồng độ 48h 72h 96h 120h 144h 168h 192h Dung dịch CaCl2 20 mM 18,04 c 31,54 bc 49,33 b 64,63 b 85,92 b 89,00 bc 104,00 bc Lá neem 6% 21,04 bc 29,71 c 46,92 b 63,25 bc 84,83 b 92,79 ab 108,33 b Lá lược vàng 6% 26,63 a 34,83 b 45,58 b 58,92 c 70,17 c 84,33 c 98,75 c Đối chứng nước cất 23,79 ab 40,88 a 58,21 a 73,67 a 93,46 a 97,88 a 114,42 a Mức ý nghĩa * * * * * * * CV (%) 16,50 13,87 12,13 10,08 9,36 9,53 6,32
32
Hiệu quả thể hiện khả năng ức chế bệnh trong điều kiện in vivo được thể hiện ở bảng 3.4. Ở thời điểm 48 giờ sau khi chủng bệnh (GSKCB), 2 nghiệm thức CaCl2 20mM, neem 6% cho hiệu quả hạn chế bệnh lần lượt là 22,37% và 9,22% khác biệt không ý nghĩa so với đối chứng, nghiệm thức lược vàng 6% không cho hiệu quả (Bảng 3.4).
Ở thời điểm 72, 96, 120 GSKCB, cả 3 nghiệm thức CaCl2 20mM, neem 6% và lược vàng 6% đều thể hiện hiệu quả ức chế bệnh và khác biệt có ý nghĩa so với đối chứng. Ở 72 GSKCB hiệu quả từ 13,41-25,93%, 96 GSKCB có hiệu quả từ 14,99-21,05% và 120 GSKCB có hiệu quả từ 12,20-19,85% (Bảng 3.4).
Sang 144 và 168 GSKCB thì 2 nghiệm thức CaCl2 20mM và neem 6% không thể hiện hiệu quả khác biệt so với đối chứng nữa, chỉ có lược vàng 6% là cho hiệu quả 24,83% và 13,71% lần lượt đối với 144 và 168 GSKCB và khác biệt có ý nghĩa so với đối chứng (Bảng 3.4).
Ở thời điểm cuối cùng là 192 GSKCB, vẫn nghiệm thức lược vàng 6% thể hiện hiệu quả ức chế bệnh với hiệu quả 13,62%, nghiệm thức CaCl2 20mM thể hiện hiệu quả ức chế bệnh trở lại với 9,06% (Bảng 3.4).
Như vậy nghiệm thức lược vàng 6%, CaCl2 20mM và neem 6% thể hiện được hiệu quả trong thí nghiệm này, trong đó lược vàng 6% cho hiệu quả ổn định nhất. Theo Bastiaanse và ctv. (2010) và Janisiewicz và Conway (2010), cơ chế của CaCl2 làm giảm mầm bệnh trên trái sau thu hoạch bao gồm kích thích tính kháng của kí chủ, hiệu quả ức chế trực tiếp hoặc tạo ra một số phức hợp tương phản giữa ion calcium, kí chủ và mầm bệnh (Yu và ctv., 2012). Theo Olennikov và ctv. (2008), đã xác định thành phần hóa học từ dịch trích của cây lược vàng gồm carbohydrates, axit ascorbic, amino axit, gallic, caffeic, chicoric, ferulic, flavonoid, courmarin, antraquinon, hợp chất triterpenic và choline. Hai hợp chất coumarin và flavonoid đã được chứng minh là có hiệu quả để phòng trị vi sinh vật gây bệnh sau thu hoạch (Ojala và ctv., 2000; Ortuno và ctv., 2006; Sanzani., 2009; trích dẫn từ Gatto và ctv., 2011). Axit caffeic cũng là một chất có tác dụng ức chế vi sinh vật gây bệnh sau thu hoạch (Zhu và ctv., 2004; Widmer và Laurent, 2006; Korukluoglu và ctv., 2008; trích dẫn từ Gatto và ctv., 2011).
33
Bảng 3.4: Hiệu quả ức chế (%) của dịch trích và CaCl2 đối với đường kính vết bệnh của trái do nấm Fusarium . gây r tr ng điều kiện in vivo
Ghi chú *: số liệu khác biệt ở mức ý nghĩa 5% ns : khác biệt không ý nghĩa thống kê Trong cùng một cột, những số có cùng chữ số theo sau thì khác biệt không ý nghĩa ở mức 5%.
Nghiệm thức Thời gian quan sát (giờ sau khi chủng bệnh)
Loại dịch trích Nồng độ 48h 72h 96h 120h 144h 168h 192h Dung dịch CaCl2 20 mM 22,37 a 21,81 a 14,99 a 12,20 b 7,75 b 8,70 ab 9,06 ab Lá neem 6% 9,22 a 25,93 a 18,49 a 14,02 ab 8,97 b 4,65 b 5,20 bc Lá lược vàng 6% 0,00 b 13,41 a 21,05 a 19,85 a 24,83 a 13,71 a 13,62 a Đối chứng nước cất 0,00 b 0,00 b 0,00 b 0,00 c 0,00 b 0,00 b 0,00 c Mức ý nghĩa * * * * * * * CV (%) 13,84 18,87 18,28 16,59 15,87 26,33 15,29
34
Hình 3.2: Hiệu quả hạn chế đường kính vết bệnh của dịch trích thực vật và hóa chất CaCl2
sau khi lây bệnh nhân tạo với nấm Fusarium sp. các thời điểm tr ng điều kiện in vivo
(A): 96GSKCB (B): 144GSKCB (C): 168GSKCB
Đối chứng CaCl2 20mM Neem 6% Lược vàng 6% Đối chứng CaCl2 20mM Neem 6% Lược vàng 6% Đối chứng CaCl2 20mM Neem 6% Lược vàng 6%
A
B
35
3.1.3 Hiệu quả của việc xử lý CaCl2, dịch trích lá neem và lá lược vàng trước khi lây bệnh nhân tạo trên trái
Kết quả bảng 3.5 cho thấy, ở thời điểm 24 giờ sau khi chủng bệnh (GSKCB), không có nghiệm thức nào có khả năng hạn chế bệnh so với đối chứng.
Ở các thời điểm 48, 72, 96, 120, 144 và 168 GSKCB thì chỉ có nghiệm thức lược vàng 6% có hiệu quả với đường kính lần lượt là (35,96mm; 43,96mm; 50,21mm; 61,58mm; 75,21mm và 90,58mm) thấp hơn có ý nghĩa so với đối chứng (39,83mm; 50,83mm; 60,46mm; 71,63mm; 84,25mm và 102,92mm). Riêng ở thời điểm cuối là 168 GSKCB có thêm 2 nghiệm thức CaCl2 20mM (93,38mm) và neem 6% (91,08mm) có thể hiện khả năng giảm bệnh có ý nghĩa so với đối chứng (Bảng 3.5).
36
Bảng .5 Đường kính (mm) vết bệnh trên trái do nấm Fusarium sp.gây r tr ng điều kiện in vivo
Ghi chú *: số liệu khác biệt ở mức ý nghĩa 5 % ns : khác biệt không ý nghĩa thống kê Trong cùng một cột, những số có cùng chữ số theo sau thì khác biệt không ý nghĩa ở mức 5 %.
Nghiệm thức Thời gian quan sát (giờ sau khi chủng)
Loại dịch trích Nồng độ 24h 48h 72h 96h 120h 144h 168h Dung dịch CaCl2 20 mM 34,50 b 39,50 b 55,79 a 61,88 a 75,58 a 81,46 ab 93,38 b Lá neem 6% 37,67 a 43,08 a 53,63 ab 58,25 a 68,71 a 79,25 ab 91,08 b Lá lược vàng 6% 32,50 bc 35,96 c 43,96 c 50,21 b 61,58 b 75,21 b 90,58 b