Các glycosid hiện diện trong rất nhiều họ thực vật và ở tất cả các bộ phận cây: lá, vỏ, hạt,... Các glycosid thường là chất kết tinh và có vị đắng.
Glycosid là hợp chất mà cấu trúc hoá học gồm hai phần: phần đường và phần không đường thường được gọi là aglycon. Dưới tác dụng của enzyme thực vật hoặc acid hoặc kiềm, glycoside bị thuỷ phân thành aglycon và phần đường.
Phần đường của glycosid: Phần đường phổ biến là D-glucose,
D-galactose, L-arabinose, L-rhamnose, D-xylose, acid glucuronic, acid galacturonic và một số đường khác.
Phần aglycon của glycosid: Phần aglycon rất đa dạng gồm tất cả các loại hợp chất tự nhiên như: monoterpen, sesquiterpen, diterpen, triterpen, steroid, iridoid, flavonoid, alcoloid, quinonoid, polyphenol,... [21]. Một số hợp chất tiêu biểu được trình bày trong Hình 2.3.
Rutin (Hedyotis nigricans) Flavon glycosid O O O O HOH2C HO HO OH Osmundalacton (Osmunda japonica) Lacton glucosid O H3C CH3 O H3C OH 0 OH HO HO HOH2C Ptaquilosid (Hypolepis punctata) Sesquiterpen glucosid O COOH HO O HOH2C O OH HO HOHOH2C Deacetylasperulosid (Hedyoits corymbosa) Iridoid glucosid N H O O OH HO HOH2C HO O Isatan B (Isatis tinctoria) Alkaloid glycosid O O CH3 OH HO H N CH3COO C OCH3 S Niazinin (Moringa oleifera) Tiocarbamat glycosid O O OH OH HOH2C HO HO Arbutin (Hedyotis nigricans) Phenol glucosid O O O O OH HO HO OH HO HO OH O O Alizarin-2-O-primverosid (Hedyotisnumbeilata) Quinon glycosid O HO OH O OHO O HO OH O O OH OH CH3 OH OH
Hình 2. 3: Cấu trúc hoá học của một vài hợp chất glycosid
2.4 Cơ sở lý thuyết và một số phƣơng pháp thực nghiệm 2.4.1 Các kỹ thuật chiết tách hợp chất thiên nhiên ra khỏi cây
Có nhiều cách để chiết tách hợp chất hữu cơ ra khỏi cây cỏ. Các kỹ thuật đều xoay quanh hai phương pháp chính là chiết lỏng - lỏng và chiết rắn - lỏng [21].
2.4.1.1 Kỹ thuật chiết lỏng - lỏng
Việc chiết lỏng - lỏng được thực hiện bằng bình lóng ở nhiệt độ phòng, trong đó cao alcol thô ban đầu được hòa tan vào pha nước. Việc chiết sẽ được thực hiện lần lượt từ dung môi hữu cơ kém phân cực đến dung môi hữu cơ phân cực. Dung dịch thu được sau các lần chiết sẽ được gom chung lại, làm khan nước, đuổi dung môi thu được cao chiết.
Sự chiết bởi một dung môi cụ thể nào đó được coi là hoàn tất khi lần chiết thứ n, trên bản mỏng không còn nhìn thấy vết của chất đó trong pha nước cũng như trong pha hữu cơ. Cũng có thể kiểm tra bằng cách nhỏ một giọt dung dịch chiết lần thứ n lên trên một tấm kiếng sạch, sau khi bay hết dung môi, không còn để lại vết gì trên mặt kiếng.
2.4.1.2 Kỹ thuật chiết rắn - lỏng a. Kỹ thuật chiết ngấm kiệt
Ngấm kiệt là một phương pháp chiết liên tục trong đó dung môi được cho đi qua mẫu theo một hướng nhất định, với một tốc độ nhất định. Quá trình hòa tan xảy ra trong phương pháp ngấm kiệt theo gradient nồng độ.
Dụng cụ: Gồm một bình ngấm kiệt bằng thủy tinh, hình trụ đứng, dưới đáy bình là một van khóa để điều chỉnh vận tốc của dung dịch chảy ra, một bình chứa đặt bên dưới để hứng dung dịch chiết. Phía trên cao của bình ngấm kiệt là bình lóng để chứa dung môi tinh khiết.
Bột cây được xay thô đến kích cỡ thích hợp. Đáy của bình ngấm kiệt được lót bằng một lớp bông, tốt hơn là bông thủy tinh và một tờ giấy lọc. Bột cây được đặt vào bình, lên trên lớp bông thủy tinh, lên gần đầy bình. Đậy bề mặt lớp bột bằng một tờ giấy lọc và chặn lên bằng những viên bi thủy tinh để dung môi không làm xáo trộn bề mặt lớp bột. Từ từ rót dung môi cần chiết vào bình cho đến khi dung môi phủ xấp xấp phía trên lớp mặt. Có thể sử dụng dung môi nóng hoặc nguội.
Để yên một thời gian, thường là 12-24 giờ. Mở van bình ngấm kiệt cho dịch chiết chảy ra từng giọt nhanh và đồng thời mở khóa bình ló ng để dung môi tinh khiết chảy xuống bình ngấm kiệt. Điều chỉnh sao cho vận tốc dung môi tinh khiết chảy vào bình ngấm kiệt bằng vận tốc dung dịch chiết chảy ra khỏi bình này.
b. Kỹ thuật chiết ngâm dầm
Kỹ thuật ngâm dầm cũng tương tự như kỹ thuật chiết ngấm kiệt nhưng không đòi hỏi thiết bị phức tạp, vì thế có thể dễ dàng thao tác với một lượng lớn mẫu cây.
Ngâm dầm là một phương pháp chiết gián đoạn trong đó toàn bộ lượng dung môi được tiếp xúc đồng thời với toàn bộ lượng mẫu trong những dụng cụ thích hợp.
Ngâm bột cây trong một bình chứa bằng thủy tinh, bình có nắp đậy. Rót dung môi tinh khiết vào bình cho đến xấp xấp bề mặt của lớp bột cây. Giữ yên ở nhiệt độ phòng trong một đêm hoặc một ngày, để cho dung môi xuyên thấm vào cấu trúc tế bào thực vật và hòa tan các hợp chất tự nhiên. Sau đó, dung dịch chiết được lọc ngang qua một tờ giấy lọc, thu hồi dung môi sẽ có được cao chiết. Tiếp theo, rót dung môi mới vào bình chứa bột cây và tiếp tục quá trình chiết thêm một số lần nữa cho đến khi chiết kiệt mẫu cây.
2.4.2 Sắc ký cột hở
Sắc ký cột hở được tiến hành ở áp suất khí quyển. Pha tĩnh là chất hấp thu, mẫu chất cần phân tích được nạp lên đầu cột, phía trên pha tĩnh. Pha động là các dung môi giải ly cột [21].
2.4.2.1 Lựa chọn chất hấp thu và dung môi để khởi đầu giải ly
Trong loại sắc ký cột với pha tĩnh là silica gel loại thường, hợp chất không phân cực được giải ly ra khỏi cột trước, hợp chất phân cực được giải ly sau.
Bảng 2. 2: Các loại hợp chất có tính phân cực tăng dần
Loại hợp chất Thứ tự giải ly ra khỏi cột
Hydrocarbon Nhanh, với dung môi không phân cực
Alken Ether Hydrocarbon R-H Hợp chất thơm Ketone Aldehyde Ester Alcohol Amine Carboxylic acid
Các hợp chất kiềm mạnh Chậm nhất, cần dung môi phân cực
b. Chọn dung môi bắt đầu cho quá trình sắc ký cột
Trước khi triển khai sắc ký cột, nhất thiết phải sử dụng sắc ký lớp mỏng để dò tìm hệ dung môi giải ly cho phù hợp. Các bước tuần tự như sau:
Mẫu chất cần sắc ký được hòa tan trong dung môi phù hợp, với nồng độ 10 mg/mL. Gọi là dung dịch mẫu (A).
Chuẩn bị 5-6 tấm bản mỏng (2×5 cm), chấm lên những tấm bảng này, mỗi chấm khoảng 2-5 µL dung dịch mẫu (A).
Mỗi bảng được giải ly với các dung môi hoặc hệ dung môi có độ phân cực khác nhau, tiến hành hiện hình các vết ở mỗi bảng bằng UV hay thuốc thử.
Đối với mẫu cao thô chiết xuất từ cây cỏ, chọn dung môi giải ly đầu tiên là dung môi có thể đẩy vết ít phân cực nhất của cao chiết lên vị trí ở bảng với Rƒ = 0,5 và chọn dung môi chấm dứt sắc ký cột là dung môi có thể đẩy vết phân cực nhất của cao chiết với Rƒ = 0,2.
Sau khi chọn được hệ dung môi phù hợp, có thể áp dụng dung môi này cho sắc ký cột. Giải ly trước tiên bằng dung môi không phân cực và tăng dần độ phân cực cho dung môi giải ly.
2.4.2.2 Tỉ lệ giữa lƣợng mẫu chất cần tách đối với kích thƣớc cột a. Tỷ lệ lƣợng mẫu cần tách và lƣợng chất hấp thu sử dụng
Trọng lượng của chất hấp thu phải lớn hơn 25-50 lần lượng mẫu cần sắc ký. Tuy nhiên, đối với những hỗn hợp mẫu chất khó tách riêng thì cần sử dụng lượng chất hấp thu nhiều hơn (lớn hơn 100-200 lần), còn với các hỗn hợp dễ tách thì có thể sử dụng lượng chất hấp thu ít hơn.
b. Tỷ lệ giữa chiều cao chất hấp thu trong cột và đƣờng kính trong của cột sắc ký
Các khảo sát thực nghiêm cho thấy muốn tách chất tốt, chiều cao của chất hấp thu nạp trong cột cần đạt tỉ lệ: Chiều cao chất hấp thu : Đường kính trong của cột vào khoảng (10 : 1).
2.4.2.3 Nạp chất hấp thu vào cột
Muốn tách riêng các hợp chất trong hỗn hợp một cách có hiệu quả, chất hấp thu phải được nạp trong cột một cách đồng nhất để hạn chế những dày xéo, bất thường.
a. Nạp chất hấp thu dạng sệt vào cột
Dùng kẹp giữ cho cột thẳng đứng trên giá. Phần đầu ra của cột không có miếng thuỷ tinh xốp để chặn thì có thể dùng một bông thuỷ tinh để chặn.
Chất hấp thu được nạp vào cột ở dạng sệt, được chuẩn bị như sau:
Trong một cốc đã chứa sẵn dung môi (dung môi bắt đầu cho quá trình giải ly cột), cho chất hấp thu từ từ vào cốc, đều đặn, mỗi lần một lượng nhỏ, vừa rót vừa khuấy nhẹ đều.
Nhờ một phễu lọc có đuôi dài đặt trên đầu cột, rót hỗn hợp sệt vào cột, vừa mở nhẹ khóa ở bên dưới cột để dung môi chảy ra.
Tiếp tục rót hỗn hợp sệt vào cột cho đến khi hết số lượng, vừa rót vừa dùng một thanh cao su gõ nhẹ vào bên ngoài thành cột để chất hấp thu nén đều trong cột.
Sau khi nạp xong, cho dung môi chảy ra và rót trở lại vào đầu cột vài ba lần để cột được nạp chặt hơn, cho đến khi chất hấp thu trong cột có dạng đồng nhất.
b. Nạp chất hấp thu dạng khô vào cột
Dùng kẹp giữ cho cột thẳng đứng trên giá, cho dung môi loại kém phân cực nhất có thể vào khoảng hai phần ba chiều cao cột. Ngang qua một phễu lọc có đuôi dài, cho chất hấp thu ở dạng bột khô vào thẳng trong cột, đều đặn mỗi lần một lượng nhỏ, vừa cho vừa gõ nhẹ thành cột. Khi lớp chất hấp thu đạt được chiều cao khoảng 2 cm trong cột, thì mở nhẹ khoá ở bên dưới cho dung môi chảy ra, hứng vào một becher trống để ở bên dưới cột, dung môi này được sử dụng lại để rót trả lại lên đầu cột.
Sau khi nạp xong cho dung môi chảy qua chất hấp thu vài lần đến khi thấy chất hấp thu trong cột có dạng đồng nhất.
2.4.2.4 Nạp mẫu chất cần tách lên đầu cột sắc ký a. Nạp mẫu chất ở dạng dung dịch
Nếu mẫu ở dạng lỏng có thể cho trực tiếp lên đầu cột sắc ký. Nếu mẫu ở dạng rắn, hòa tan mẫu chất vào một lượng nhỏ dung môi, loại dung môi khởi đầu cho SKC. Thực hiện nạp mẫu lên cột như sau:
Đóng khóa lại, nạp dung dịc h mẫu vào đầu cột. Dùng pipet cho dung dịch chất chảy ra dọc theo thành trong của cột, chạm xuống bề mặt chất hấp thu.
Mở khóa bên dưới cho dung môi chảy ra khỏi cột, làm cho dung dịch mẫu được thấm hết vào chất hấp thu trên đầu cột.
Dùng pipet cho một lượng nhỏ dung môi mới lên đầu cột, tranh thủ dùng lượng dung môi này để rửa sạch thành ống.
Dùng bông thủy tinh (hoặc bông gòn) đặt nhẹ lên mặt thoáng của chất hấp thu để bề mặt cột không bị xáo trộn.
Cuối cùng cho dung môi vào đầu cột để bắt đầu quá trình giải ly.
b. Nạp mẫu chất ở dạng bột khô
Áp dụng cho mẫu chất không tan trong dung môi lựa chọn để bắt đầu quá trình sắc ký.
Trong một bình cầu dùng để cô quay, mẫu cần sắc ký (X g) được hòa tan trong dung môi như ethyl acetate hoặc methanol (50X g), cho thêm vào silica gel (10X g). Hỗn hợp này được cô quay chân không đến khi bột silica gel khô. Bây giờ, mẫu chất cần sắc ký đã được tẩm lên bề mặt của những hạt silica gel.
Đặt mẫu bột khô này lên đầu cột, dùng một ít dung môi (loại được chọn để bắt đầu quá trình SKC), thấm ướt phần bột silica gel. Dùng bông gòn bảo vệ bề mặt cột. Cuối cùng cho dung môi vào đầu cột để bắt đầu quá trình giải ly.
2.4.2.5 Giải ly cột
Tùy theo chất hấp thu được dùng và yêu cầu tốc độ chảy của cột mà người ta có thể tiến hành giải ly cột bằng áp suất thường hoặc ở áp suất nén.
Ở sắc ký cột cổ điển, dung môi rửa cột được dùng với độ phân cực tăng dần.
Đối với loại cột dùng silica gel pha đảo làm pha tĩnh thì pha động sử dụng thường là nước hoặc các hỗn hợp dung môi có chứa nước.
Sự thay đổi từ dung môi này sang dung môi khác phải chuyển từ từ bằng cách pha tỉ lệ tăng dần hoặc giảm dần. Nếu tăng tính phân cực nhanh và đột ngột có thể làm gãy cột.
Vận tốc chảy của dung môi rửa cột cũng phải điều chỉnh cho phù hợp, không được quá nhanh cũng không được quá chậm hoặc cho ngưng lại một thời gian vì sẽ làm cho chất tan bị khuếch tán, ảnh hưởng đến hiệu quả tách.
Trên thực tế nhiều khi dùng những dung môi thông thường không tách được nên người ta thường dung hỗn hợp nhiều dung môi.
2.4.2.6 Theo dõi quá trình giải ly cột
Với các chất cần phân tích có màu, quá trình giải ly bằng sắc ký cột có thể được theo dõi bằng mắt thường. Tuy nhiên, đa số hợp chất hữu cơ tự nhiên đều không có màu nên việc hứng và kiểm tra các phân đoạn giải ly ra khỏi cột thường bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng.
2.4.3 Sắc ký lớp mỏng
2.4.3.1 Giới thiệu chung về sắc ký lớp mỏng
Sắc ký lớp mỏng còn gọi là sắc ký phẳng (planar chromatography), dựa chủ yếu vào hiện tượng hấp thu trong đó pha động là một dung môi hay một hỗn hợp dung môi, di chuyển qua một pha tĩnh là một chất hấp thu trơ, ví dụ: Silica gel hay aluminium oxide. Pha tĩnh này được tráng thành một lớp mỏng, đều, phủ lên một nền phẳng như tấm kiếng, tấm nhôm hoặc plastic. Do chất hấp thu được tráng thành một lớp mỏng nên phương pháp này gọi là sắc ký lớp mỏng [21].
Một chất tinh khiết sẽ chỉ cho một vết tròn, có giá trị Rƒ không đổi trong một hệ dung môi xác định, trị số Rƒ được tính như sau:
b a Rf a b
Đoạn đường di chuyển của hợp chất Đoạn đường di chuyển của dung môi
2.4.3.2 Các bƣớc chuẩn bị trƣớc khi sắc ký lớp mỏng a. Chuẩn bị ống mao quản
Dùng 2 tay cầm 2 đầu ống mao quản, hơ nóng đoạn giữa của mao quản đến mềm dẻo. Đem mao quản tránh khỏi ngọn lửa rồi kéo từ từ hai ống ra xa. Giữ yên cho đến khi thủy tinh đặc cứng lại.
Tiến hành rửa mao quản đã kéo bằng cách chấm vào lọ thủy tinh có chứa acetone, lấy mao quản ra và chấm vào giấy thấm để rút bỏ acetone. Làm lại vài lần để mao quản được sạch.
b. Chấm mẫu lên bản mỏng
Mẫu là chất lỏng, lấy mẫu và chấm trực tiếp trên bản mỏng. Mẫu là chất rắn thì phải hòa tan mẫu trong dung môi hữu cơ phù hợp.
Cắt bản mỏng nhỏ (52 cm), dùng viết chì kẻ một đường thẳng phía dưới bản cao 1 cm làm mức xuất phát. Một đường thằng phía trên cách mép trên 0,5 cm làm tiền tuyến dung môi.
Chấm mao quản vào dung dịch mẫu, chạm nhẹ đầu mao quản vào tấm bản mỏng tại vạch xuất phát. Nhanh chóng nhấc mao quản ra khỏi tấm bản mỏng để vết chấm chỉ lan rộng ra thành vết tròn có đường kính 2-5 mm.
Sau khi chấm xong, sấy nhẹ để dung môi bay ra khỏi vết chấm rồi nhúng vào dung dịch giải ly.
Nếu cần khảo sát một lượng nhiều mẫu khác nhau, chuẩn bị và chấm mỗi mẫu một vết trên bản mỏng. Vết này cách vết kia 1 cm, hai vết ngoài bìa cách mép 1,5 cm.
Với SKLM điều chế (20×20 cm), dung dịch mẫu chất sẽ được chấm lên thành một đường dài, đều, dọc theo vạch xuất phát bằng cách dùng mao quản kéo một đường dài dọc theo vạch xuất phát.
2.4.3.3 Giải ly bản mỏng