Các hợp chất cô lập được sau quá trình sắc ký cột, khi quan sát bằng mắt thường ta thấy chúng ở dạng bột trắng, đôi khi là tinh thể không màu, khi sắc ký lớp mỏng với nhiều hệ dung môi khác nhau vẫn cho một vết tròn gọn đẹp nhưng thực ra độ tinh khiết của chúng cũng chỉ từ 90-95% mà thôi.
Với độ tinh khiết từ 90-95%, việc xác định cấu trúc bằng các phương pháp hóa lý sẽ kém hiệu quả. Do vậy, việc kết tinh lại hợp chất là rất cần thiết.
Một hợp chất tinh khiết có độ tinh khiết > 95% mới có thể khảo sát bằng các phương pháp hoá lý.
CHƢƠNG 3
PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Phƣơng tiện nghiên cứu
3.1.1 Dụng cụ
Tủ sấy: Dùng để sấy nguyên liệu và các dụng cụ bằng thủy tinh.
Máy cô quay: Để thu hồi dung môi, làm khô mẫu trước khi gởi đo phổ.
Cột sắc ký có đường kính (d), chiều dài (l) như sau: + d = 3,0 cm, l = 55 cm
+ d = 2,5 cm, l = 40 cm + d = 2,0 cm, l = 40 cm + d = 1,0 cm, l = 45 cm
Một số dụng cụ khác: hũ bi, chai đựng dung dịch, các loại cốc thủy tinh, bình chiết, đũa thủy tinh, bếp điện, cân điện tử,…
3.1.2 Hoá chất
Silica gel 60 (0,04-0,06 mm) Scharlau và bản mỏng tráng sẵn (Merck, Đức).
Dung môi: Petroleum ether, hexane, chloroform, dichloromthane, ethyl acetate, methanol.
Na2SO4 dùng để làm khan dung môi.
Acid sulfuric, vanilin dùng để pha thuốc thử hiện hình và một số hóa chất khác.
3.1.3 Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài
Thời gian: từ 1/8 đến 10/11/2013.
Địa điểm: phòng thí nghiệm Hữu cơ 1, bộ môn Hoá, khoa Khoa Học Tự Nhiên, trường Đại học Cần Thơ.
3.2 Phƣơng pháp nghiên cứu
3.2.1 Phƣơng pháp thu mẫu và sử lý mẫu
Lá chùm ngây (Moringa oleifera Lam.) được thu hái ở ấp Tà Lọt, thị trấn Tri Tôn, tỉnh An Giang. Sau khi loại bỏ những phần héo, lá được rửa sạch, phơi gió đến khô rồi sấy ở nhiệt độ khoảng 60ºC trong 8 giờ. Sau đó, xay nhuyễn thu được bột nguyên liệu.
3.2.2 Phƣơng pháp tách chiết
Chiết cao tổng bằng phương pháp ngấm kiệt với methanol nóng. Bột lá chùm ngây khô được cho vào bình chiết (mỗi lần khoảng 150 g), sau đó cho methanol nóng (45-50ºC) vào và dùng đũa thủy tinh khuấy đều để methanol ngấm đều vào bột lá khô. Để yên 5 phút, xả dịch chiết vào bình hứng. Dịch này được đem cô quay chân không thu được cao methnol tổng.
Chiết lỏng - lỏng cao methanol tổng lần lượt với các dung môi hexane, dichloromethane, ethyl acetate để điều chế các cao thành phần tương ứng.
3.2.3 Phƣơng pháp phân lập và tinh chế
Sử dụng phương pháp SKC để tách các chất.
Dò tìm hệ dung môi giải ly cột và kiểm tra quá trình SKC cũng như mức độ tinh sạch của hợp chất bằng SKLM.
Dùng phương pháp kết tinh lại để tinh chế hợp chất.
3.2.4 Phƣơng pháp khảo sát và xác định cấu trúc hoá học
Các chất phân lập được ở dạng tinh khiết là đối tượng để khảo sát các đặc trưng vật lý: màu sắc, mùi, dạng thù hình, Rƒ, điểm nóng chảy, đo hoạt tính quang học,… Khi các chất đủ sạch sẽ tiến hành ghi các phổ khối lượng (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR), carbon-13 (13C-NMR), phổ HSQC và HMBC với các kỹ thuật một chiều và hai chiều tuỳ theo chất cụ thể. Các số liệu phổ của các chất sạch được dùng để xác định cấu trúc hoá học của chúng. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
3.3 Thực nghiệm 3.3.1 Điều chế cao 3.3.1 Điều chế cao
3.3.1.1 Chuẩn bị nguyên liệu
Lá chùm ngây (Moringa oleifera Lam.) được thu hái ở ấp Tà Lọt, thị trấn Tri Tôn, tỉnh An Giang. Sau khi qua các công đoạn xử lý thu được 18,5 kg lá tươi.
Lá được phơi tránh ánh nắng trong nhà một tuần, rồi đem sấy ở 60ºC trong 8 giờ, sau đó xay nhuyễn thu được 3,7 kg bột khô. Hàm lượng chất khô thu được tương đương với 20% nguyên liệu ban đầu.
Sau khi sấy khô, sản phẩm có giá trị sử dụng như trà hoặc dạng thức ăn gia súc, được bảo quản ở điều kiện thường.
Từ 3,7 kg bột lá chùm ngây khô tiến hành điều chế các loại cao xác định các hợp chất tự nhiên.
3.3.1.2 Điều chế cao methanol tổng
Chiết cao tổng bằng phương pháp ngấm kiệt với methanol nóng.
Bột lá chùm ngây khô được cho vào bình chiết (mỗi lần khoảng 150 g), sau đó cho methanol nóng (45-50ºC) vào và dùng đũa thủy tinh khuấy đều để methanol ngấm đều vào bột lá khô. Để yên 5 phút, xả dịch chiết vào bình hứng. Dịch này được đem cô quay chân không thu được cao methanol (cao tổng), dung môi thu hồi được tái sử dụng cho quá trình chiết. Quá trình chiết kết thúc khi nhỏ một giọt dịch chiết lên mặt kính, để dung môi bay hơi hết và quan sát không thấy vết gây mờ mặt kính do chất có trong dịch chiết.
Từ 3,70 kg bột lá chùm ngây ban đ ầu thu được 675 g cao tổng. Hiệu suất chiết cao tổng là: 675 18, 24%
3700
H
3.3.1.3 Điều chế các cao thành phần từ cao methanol tổng a. Điều chế cao hexane
Chuẩn bị bình lóng loại 500 mL, lấy mỗi lần khoảng 50 g cao methanol, cho thêm nước vào với tỉ lệ thể tích cao : nước = 1 : 1 cho vào bình lóng cùng dung môi hexane (200-300 mL/lần). Lắc đều và để bình lóng yên khoảng 15 phút, sau đó tách lấy lớp hexane ở phía trên, lấy lớp dưới tiếp tục chiết với hexane cho đến khi màu của lớp hexane phía trên nhạt dần và kiểm tra bằng SKLM. Nếu thấy không còn vết chứng tỏ chất đã được chiết hoàn toàn vào dung môi hexane, sau đó gom lớp hexane của các lần chiết lại, cô quay thu hồi dung môi thu được 218,32 g cao hexane.
Hiệu suất chiết cao hexane từ cao methanol tổng:
% 34 , 32 675 100 32 , 218 H
b. Điều chế cao dichloromethane
Sau khi chiết cao hexane, lấy phần dịch còn lại cho vào bình lóng cùng với dung môi dichloromethane (200-300 mL/lần). Lắc đều và để bình lóng yên khoảng 15 phút, sau đó tách lấy lớp dichloromethane phía dưới, kiểm tra lớp dichloromethane bằng SKLM cho đến khi không còn thấy vết, gom phần dịch dichloromethane của các lần chiết lại, cô quay thu hồi dung môi thu được 31,47 g cao dichlomethane.
Hiệu suất chiết cao dichloromethane từ cao methanol tổng:
% 66 , 4 675 100 47 , 31 H
c. Điều chế cao ethyl acetate
Thao tác tương tự như điều chế cao dicloromethane. Sau khi cô quay khối lượng cao ethyl acetate thu được là 24,16 g.
Quy trình điều chế các loại cao được tóm tắt trong sơ đồ sau: Hexane Bột lá chùm ngây khô (3,7 kg) Cao tổng (675 g) Cao hexane (218,32 g) Cao Dicloromethane (31,37 g) Cao ethylacetate (24,16 g) Cao nước (430 g) Chiết kiệt với methanol
Dicloromethane Ethylacetate
3.3.2 Khảo sát cao Ea
3.3.2.1 Khảo sát sắc ký lớp mỏng cao Ea
Khảo sát sơ bộ bằng SKLM c ao Ea ban đầu với hệ dung môi Ea:Me (8:2), sau đó hiện hình bằng thuốc thử vanilin cho kết quả:
Một vết chính màu vàng có Rƒ khoảng 0,6.
Tại Rƒ khoảng 0,7 có một vết hơi dẹp màu hồng.
Dưới vết chính là vệt kéo dài màu hồng không có vết rõ ràng. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hình 3. 3: SKLM cao Ea Hệ dung môi giải ly Ea:Me (8:2)
Nhận xét: Từ vết quả sắc ký lớp mỏng cho thấy phần lớn các chất trong cao Ea là các chất phân cực mạnh. Hai vết chính có có độ phân cực gần nhau, vết dưới vo tròn có lượng nhiều, vết trên hơi dẹp do lượng ít. Tiếp tục khảo sát mong rằng sẽ cô lập được chất trong cao Ea.
3.3.2.2 Phân tích sắc ký cột cao Ea
Tiến hành sắc ký cột để khảo sát cao Ea ban đầu.
Hấp phụ 3 g cao Ea với 6 g silica gel. Qua cột với 45 g silica gel, sử dụng cột có đường kính 3 cm. Nạp mẫu khô, dung môi giải ly ban đầu là ethyl acetate và tăng dần độ phân cực bằng cách pha thêm vào dung môi methanol. Hứng dung dịch ra khỏi cột với thể tích mỗi lần là 150 mL. Theo dõi quá trình giải ly cột bằng SKLM, gom các hũ có SKLM giống nhau sau đó cô quay thu hồi dung môi thu được 3 phân đoạn.
Hình 3. 4: SKC cao Ea Bảng 3. 1: Kết quả SKC cao Ea
STT Phân đoạn Dung môi giải ly cột lƣợng (g) Nhận xét trên SKLM Khối
1-2 Ea1 Ea 100% 0,6
Tại Rƒ khoảng 0,6 có một vết tròn mờ màu hồng, bên dƣới là vết màu nâu đậm có viền màu vàng, kéo vệt nhiều ở phía dƣới.
3-8 Ea2 Ea
Ea:Me (95:5) 0,8
Có vết màu nâu kéo vệt dài ở cả trên và dưới
9-22 Ea3 Ea:Me (9:1)
Me 100% 1,2
Vệt kéo dài màu xám, không có vết chính
Nhận xét: Trong 3 phân đoạn thu được thì phân đoạn Ea1 có vết rõ ràng nhất. Do đó phân đoạn Ea1 được chọn để tiếp tục khảo sát.
Hình 3. 5: SKLM các phân đoạn Ea1, Ea2, Ea3 Hệ dung môi giải ly Ea: Me (9:1)
a. Khảo sát phân đoạn Ea1
Tiến hành SKC phân đoạn Ea1 có khối lượng 0,6 g. Hệ dung môi giải ly cột ban đầu là Ea:Dc (7:3). Dung dịch ra khỏi cột được hứng lại mỗi lần khoảng 30 mL. Theo dõi quá trình giải ly bằng SKLM và gom các hũ có SKLM giống nhau.
Bảng 3. 2: Kết quả SKC phân đoạn Ea1
Phân đoạn Dung môi giải ly cột Khối lƣợng (g) Nhận xét trên SKLM Ea1.1 Ea:Dc (7:3) 0,11 Vết chính màu hồng có Rƒ khoảng 0,6. Vệt tạp kéo dài màu xanh nhạt ở phía trên và dưới
Ea1.2 Ea:Dc (7:3) 0,38
Vết chính màu vàng đậm có Rƒ khoảng 0,5, có viền màu hồng bao ở ngoài. Vệt tạp kéo dài ở phía trên và dƣới.
Nhận xét: Phân đoạn Ea1.1 có vết chính màu hồng, phân đoạn Ea1.2 có vết chính màu vàng đậm, phân cực hơn vết màu hồng của phân đoạn Ea1.1. Tuy nhiên phân đoạn Ea1.1 có khối lượng không nhiều khó có thể tiếp tục khảo sát. Phân đoạn Ea1.2 có khối lượng lớn hơn nên được chọn để tiếp tục khảo sát.
Hình 3. 6: SKLM phân đoạn Ea1.1 và Ea1.2 Hệ dung môi giải ly Ea :Me (9:1)
b. Khảo sát phân đoạn Ea1.2
Tiến hành SKC 0,38 g phân đoạn Ea1.2. Hệ dung môi giải ly ban đầu là PE:Ea (7:3) và tăng dần độ phân cực của dung môi. Dung dịch ra khỏi cột
Bảng 3. 3: Kết quả SKC phân đoạn Ea1.2 Phân đoạn Dung môi gải ly cột Khối lƣợng (g) Nhận xét trên SKLM
Ea1.2a PE:Ea (7:3) 0,008 Vết tròn màu xanh nhạt.
Ea1.2b PE:Ea (6 :4) 0,03 Vết tròn màu tím, hơi kéo vệt ở phía trên. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Ea1.2c PE:Ea (6:4) 0,05 2 vết màu vàng nâu nằm sát nhau. Hơi kéo vệt ở trên và dưới.
Ea1.2d PE:Ea (6:4) 0,15 Vết tròn màu vàng có Rƒ = 0,45; hơi kéo vệt ở phía dƣới.
Nhận xét: Trong 4 phân đoạn thu được thì 2 phân đoạn đầu có khối lượng rất nhỏ không thể tiếp tục khảo sát. Còn lại 2 phân đoạn cuối thì phân đoạn Ea1.2d chỉ có một vết chính tương đối dễ tinh chế hơn. Do đó, phân đoạn Ea1.2d được chọn để tiếp tục khảo sát
Hình 3. 7: SKLM các phân đoạn Ea1.2a, Ea1.2b, Ea1.2c, Ea1.2d Hệ dung môi giải ly Dc:Me (9:1)
c. Khảo sát phân đoạn Ea1.2d
Phân đoạn Ea1.2d có một vết chính vo tròn màu vàng còn lẫn tạp. Do đó, tiếp tục SKC phân đoạn này để tinh chế, hệ dung môi giải ly cột là C:Me (7:3). Sau khí SKC và gom các hũ bi có SKLM giống nhau thu được phân đoạn chứa vết chính. Tuy nhiên vẫn chưa sạch hoàn toàn vì còn lẫn tạp ở dưới. Do lượng mẫu còn không nhiều nên tiến hành SKLM điều chế để tinh sạch hợp chất này.
Hình 3. 8: Phân đoạn chứa vết chính sau khi SKC phân đoạn Ea1.2d Hệ dung môi giải ly Dc:Me (9:1)
Pha động của SKLM điều chế để tinh sạch phân đoạn chứa vết chính trên là hệ Dc:Me (9:1). Sau khi giải ly, lấy bản mỏng ra khỏi bình sắc ký, để bay hơi dung môi sau đó soi UV và dùng viết chỉ khoanh vùng chứa vết chính.
Tiến hành cạo phần silica gel trên bản mỏng chứa vết chính đã được đánh dấu bằng viết chì. Sau đó, giải hấp phụ chất bằng dung môi methanol. Kiểm tra lại bằng SKLM với 3 hệ dung môi khác nhau thì thấy một vêt tròn màu vàng đậm không còn lẫn tạp.
Như vậy, sau quá trình tinh chế bằng SKC và SKLM điều chế ta thu được chất tinh khiết có khối lượng 8 mg. Đặt tên hợp chất này là MO-EA2. Tiến hành gửi mẫu đi đo các phổ MS, phổ NMR một chiều và hai chiều để xác định cấu trúc.
Hình 3. 9: Tinh thể MO-EA2 Hình 3. 10: SKLM MO-EA2 với 3 hệ dung môi khác nhau
CHƢƠNG 4
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết quả thực nghiệm
Khối lượng cao Ea thu được sau quá trình chiết là 24,16 g.
Khảo sát sơ bộ cao Ea bằng SKLM với hệ dung môi Ea:Me (8:2) thì thấy có 1 vết chính màu vàng có Rƒ khoảng 0,6 và một vết hơi dẹp màu hồng ở trên có Rƒ khoảng 0,7; bên dưới vết chính là vệt dài không có vết rõ ràng.
Tiến hành SKC 3 g cao Ea với hệ dung môi ban đầu là Ea sau đó tăng dần độ phân cực của dung môi. Kiểm tra quá trình SKC bằng SKLM. Gom các hũ có SKLM giống nhau thu được ba phân đoạn. Phân đoạn đầu tiên có vết rõ ràng nhất nên phân đoạn này được chọn để tiếp tục khảo sát.
Từ phân đoạn đầu tiên của cao Ea qua nhiều quá trình phân tách đã cô lập được chất MO-EA2 (8 mg).
Đặc điểm của MO-EA2 là: tinh thể không màu, hình kim, tan tốt trong methanol.
4.2 Biện luận cấu trúc của MO-EA2
4.2.1 Thông tin nhận đƣợc từ phổ MS của MO-EA2 (phụ lục 1)
Hợp chất này có mũi cơ bản là [M+Na]+
có m/z = 302 suy ra khối lượng phân tử của MO-EA2 là 279 amu. CTPT phù hợp của MO-EA2 là C14H17O5N.
4.2.2 Thông tin nhận đƣợc từ phổ 1
H-NMR của MO-EA2 (MeOD, 500MHz) (phụ lục 2)
Hợp chất MO-EA2 có 14H (không tính H của –OH, −COOH,…).
Các tín hiệu của vùng từ trường trung bình H = 6-8 cho thấy sự hiện diện của proton vòng thơm. Trên phổ giãn rộng quan sát được 2 mũi đôi cộng hưởng tại H = 7,30 (2H; mũi đôi; J = 8,5 Hz) và 7,10 (2H; mũi đôi; J = 8,5 Hz). Với hằng số ghép J = 8,5 Hz, mỗi tín hiệu là của 2 proton cho biết đây là nhân thơm mang 2 nhóm thế ở vị trí para với nhau.
Các tín hiệu ở vùng từ trường cao H = 3-4 được quy kết cho 4 proton nhóm metin >CH− kề oxigen của phần đường. Mũi đôi tại H = 5,46 là pronton gắn với C anomer, proton này có hằng số ghép J = 1,5 Hz phù hợp với tín hiệu của đường α-L-rhamnose.
Tại H = 3,84 xuất hiện một mũi đơn với cường độ tích phân bằng 2 được suy đoán là 2 proton nhóm −CH2− gắn với nhân thơm và một nhóm thế khác.
Tại H = 1,24 có một mũi đôi (J = 6 Hz) với cường độ tích phân bằng 3 chính là 3 proron của nhóm metyl –CH3. Do vòng thơm không mang nhóm thế −CH3 nên 3 proton này là thuộc phần đường. Như vậy, phần đường có 8 proton nên hợp chất MO-EA2 chỉ mang một gốc đường.
Từ dữ liệu phổ MS và 1 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
H-NMR ta có thể kết luân sơ bộ MO-EA2 là một glycosid gồm một phân tử đường α-L-rhamnose. Phần aglycon có chứa vòng thơm mang nhóm thế.
4.2.3 Thông tin từ phổ 13C-NMR và DEP T-NMR của MO-EA2 (MeOD, 500MHz) (phụ lục 3, 4) (MeOD, 500MHz) (phụ lục 3, 4)
Phân tử hợp chất MO-EA2 có 14C.
Trên phổ DEPT 90 cho 9 tín hiệu của nhóm metin CH (gồm 2 loại: 4 =CH− của vòng thơm và 5 >CH− của đường).
Dựa vào phổ DEPT 135 thì thấy trên phổ đồ có một mũi âm, do đó hợp chất có 1 nhóm −CH2− . Kết hợp DEPT 135 và DEPT 90 biết được hợp chất có 1 nhóm −CH3
Hợp chất MO-EA2 có 14C trong đó có 4 nhóm =CH− của vòng thơm, 5 nhóm >CH− của đường, 1 nhóm −CH2−, 1 nhóm −CH3 và 3 C tứ cấp. Tín hiệu ở vùng từ trường thấp C = 157,4 là tín hiệu C tứ cấp của nhân