phạm vi phòng thí nghiệm 0,413a 0,075b 0,488b 0,385b 0,203a 0,588a 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7
Formol Amoniac Amin
Chỉ tiêu phân tích H à m l ư ợ n g đ ạ m ( g /l ) Dịch trích vỏ khóm Bã vỏ khóm xay nhuyễn
Hình 9: Ảnh hưởng của phương pháp trích bromelain đến quá trình thủy phân bã đậu nành
*Ghi chú:
Các giá trị có cùng ký tự không khác biệt ý nghĩa thống kê ở mức 5%
%CV (formol): 2,32; %CV (amoniac): 6,51; %CV (amin): 2,77
Với mục đích kiểm tra khả năng thủy phân protein bã đậu nành bằng bromelain vỏ khóm ở phạm vi phòng thí nghiệm và tiến đến đơn giản hóa quá trình thủy phân nhằm thực hiện thủy phân bã đậu nành một cách dễ dàng ngoài thực tế. Chính vì thế thí nghiệm so sánh phương pháp trích ly bromelain bằng cách ép vỏ khóm thu dịch trích bromelain và bã vỏ khóm xay nhuyễn để thu bromelain chứa cả xác vỏ khóm được thực hiện. Bromelain được trích từ hai phương pháp này sẽ được dùng thể thủy phân protein bã đậu nành ở phạm vi phòng thí nghiệm nhằm so sánh hiệu quả thủy phân. Từ các điều kiện thủy phân thích hợp chọn ở các thí nghiệm 1, 2, 3 và 4 một lượng bã đậu nành gấp 200 lần (200g) so với các thí nghiệm trước được bổ sung dung dịch đệm pH 8,0, bổ sung 2 loại dịch trích bromelain từ 2 phương pháp khác nhau và được ủ ở 50oC trong 20 giờ.
Qua kết quả khảo sát quá trình thủy phân hình 9 bằng 2 phương pháp trích ly bromelain khác nhau cho thấy ở nghiệm thức trích ly bromelain bằng cách bã vỏ khóm
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 36 Viện NC&PT Công Nghệ Sinh học
xay nhuyễn thu cả dịch bromelain và xác đem thủy phân cho hàm lượng đạm amoniac sinh ra nhiều hơn với giá trị là 0,203g/l so với phương pháp trích ly bromelain bằng cách ép vỏ khóm thu dịch trích và bỏ phần xác hàm lượng đạm amoniac chỉ có 0,075g/l (bảng 20, phụ lục 2) khác biệt giữa 2 nghiệm thức này có ý nghĩa thống kê ở mức 5%.
Ở nghiệm thức bã vỏ khóm xay nhuyễn, có chứa cả phần xác vỏ khóm có hàm lượng đạm amoniac cao hơn có thể là do trong và trên về mặt vỏ khóm có chứa vi sinh vật gồm nhiều loại với mật số khác nhau (Trần Minh Tâm, 2000). Khi gặp điều kiện thuận lợi trong quá trình thủy phân như pH, nhiệt độ, lượng acid amin có trong dung dịch thủy phân,..., các loài vi sinh vật sẽ chuyển hóa các acid amin thành đạm amoniac để phục vu nhu cầu sinh trưởng và phát triển của chúng. Khi thủy phân bromelain có thêm xác vỏ khóm thì một phần bromelain còn lại trong xác vỏ khóm cũng tham gia phản ứng do đó hàm lượng enzyme cao hơn dẫn đến việc enzyme xúc tác các phản ứng tự thủy phân hoặc thủy phân tạo nhiều sản phẩm không mong muốn trong đó có đạm amoniac (Nguyễn Đức Lượng, 2004).
Từ biểu đồ hình 9 qua hai phương pháp trích ly bromelain khác nhau cho thấy nghiệm thức ở phương pháp trích ly bromelain bằng cách bã vỏ khóm xay nhuyễn thu cả dịch trích bromelain và xác cho hàm lượng đạm formol cao hơn so với nghiệm thức ép vỏ khóm thu dịch trích bromelain. Hàm lượng đạm formol ở nghiệm thức bã vỏ khóm xay nhuyễn đạt giá trị là 0,588 g/l khác biệt có ý nghĩa thống kê so với nghiệm thức ép vỏ khóm thu dịch bromelain chỉ đạt 0,488 g/l (bảng 20, phụ lục 2). Nguyên nhân có thể là do trong quá trình thủy phân ở nghiệm thức bã vỏ khóm xay nhuyễn có hàm lượng đạm amoniac cao hơn nên dẫn đến giá trị hàm lượng đạm formol cũng cao. Thêm vào đó khi quá trình thủy phân có xác vỏ khóm thì thành phần này nằm lơ lững trong môi trường thủy phân, nên một lượng protein bã đậu nành được giữ lại trên phần xác vỏ khóm này làm cho diện tích tiếp xúc giữa cơ chất và enzyme tăng làm quá trình thủy phân tăng (Nguyễn Đức Lượng, 2004) dẫn đến hàm lượng đạm formol tăng.
Nhận thấy hàm lượng đạm formol ở nghiệm thức bã vỏ khóm xay nhuyễn cao nhưng đồng thời thì hàm lượng đạm amoniac ở nghiệm thức này cũng cao hơn nhiều so với nghiệm thức ép vỏ khóm thu dịch bromelain. Chính vì vậy hàm lượng đạm amin sinh ra ở nghiệm thức này thấp hơn chỉ đạt giá trị là 0,385 g/l khác biệt có ý nghĩa thống kê so với nghiệm thức ép vỏ khóm thu dịch bromelain đạt 0,413 g/l.
Qua kết quả phân tích cho thấy giá trị hàm lượng đạm amin nghiệm thức bã vỏ khóm xay nhuyễn tuy đạt giá trị 0,385 g/l thấp hơn nghiệm thức ép vỏ khóm thu dịch bromelain 0,413 g/l nhưng vẫn có thể sử dụng hình thức này để trích ly bromelain thủy phân bã đậu nành được do quy trình dễ thực hiện và có thể áp dụng quy mô lớn. Mặc dù vậy thì nếu có điều kiện nên áp dụng quy trình trích bằng cách ép vỏ khóm thu dịch bromelain để thủy phân bã đậu nành vì quá trình thủy phân tốt hơn sinh ra hàm lượng đạm amin cao (0,413 g/l) và đạm amoniac thấp 0,075 g/l (bảng 20, phụ lục 2).
Giá trị hàm lượng đạm amin ở phạm vi sản xuất phòng thí nghiệm đạt giá trị cao nhất là 0,413 g/l thấp hơn hàm lượng đạm amin đạt được trong thí nghiệm trước là 0,420 g/l nhưng sự chênh lệch hàm lượng đạm amin là không lớn do những điều kiện khách quan như ở quy mô thực hiện trong thí nghiệm thì thủy phân với số lượng ít nên độ chính xác cao, các điều kiện thủy phân được kiểm soát tốt hơn,....Điều đó cho thấy qui trình sản xuất dịch thủy phân giàu đạm amin từ protein bã đậu nành bằng bromelain vỏ khóm khá ổn định có thể áp dụng sản xuất ở phạm vi lớn hơn.
Kết quả điện di SDS-PAGE so sánh 2 phương pháp trích bromelain vỏ khóm dùng để thủy phân protein bã đậu nành ở phạm vi phòng thí nghiệm:
Hình 10: Điện di đồ thể hiện quá trình thủy phân protein bã đậu nành theo hai phương pháp trích bromelain vỏ khác nhau
Từ kết quả điện di (hình 10) suy ra phương trình tương quan tuyến tính giữa trọng lượng phân tử M (y = logM) của protein chuẩn và sự dịch chuyển tương đối của các băng protein (x = Rf) là: y = - 0,9608x + 2,0672 có độ tin cậy R2= 96,28%. *Ghi chú: Giếng 1: Protein chuẩn Giếng 2: Enzyme bromelain vỏ Giếng 3: Đậu nành chưa xử lý
Giếng 4: Thủy phân bằng dịch enzyme
+ bất hoạt nhiệt
Giếng 5: Thủy phân bằng dịch enzyme
+ không bất hoạt nhiệt
Giếng 6: Thủy phân bằng dịch enzyme
+ xác vỏ khóm + không bất hoạt nhiệt
Giếng 7: Thủy phân bằng dịch enzyme
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 38 Viện NC&PT Công Nghệ Sinh học
Nhận thấy băng bromelain vỏ trên gel điện di có trọng lượng phân tử là 28,8 kDa (giếng 2, hình 10) kết quả điện di này phù hợp với kết quả nghiên cứu của Yamada et al., (1976).
Qua kết quả điện di cho thấy bã đậu nành chứa hàm lượng protein lớn với các trọng lượng phân tử khác nhau từ 14,4 - 66,2 kDa (hình 10). Trong đó băng protein chủ đạo thể hiện rõ trên gel điện di có trọng lượng phân tử lần lượt là: 62,9; 54,8; 33,6; 23,8 và 19,7 kDa (giếng 3, hình 10).
Có thể thấy rõ tuy bromelain được ly trích từ 2 phương pháp khác nhau nhưng enzyme vẫn có khả năng phân cắt protein bã đậu nành ở các trọng lượng phân tử lớn thành các đoạn peptid ngắn và acid amin.
Bằng chứng là ở mẫu đối chứng chứa bã đậu nành (giếng 3, hình 10) có các băng protein hiện rõ ở các trọng lượng phân tử lớn là 62,9; 54,8; 33,6; 23,8 kDa nhưng sau khi quá trình thủy phân diễn ra thì các băng này mờ di rõ rệt và khó được nhận thấy trên gel. Điển hình là thủy phân bằng phương pháp ép vỏ khóm thu dịch trích bromelain (giếng 4, hình 10) quá trình thủy phân tốt nên các băng protein có trọng lượng phân tử lớn 62,9 và 54,8 kDa đã không còn xuất hiện trên gel.
Nhưng nhận thấy vẫn còn một phần protein khó thủy phân có trọng lượng phân tử là 33,5 và 23,8 kDa vẫn còn hiện mờ trên gel. Riêng đối với giếng 4 và 5 (hình 10) cho thấy khi quá trình thủy phân được bổ sung enzyme bằng phương pháp ép vỏ khóm thu dịch bromelain thủy phân tốt tạo thành các peptid ngắn và acid amin nhưng khi xử lí nhiệt thì một lượng sản phẩm bị tủa bởi tác nhân nhiệt độ vì thế giếng 4 có các băng sản phẩm nhạt màu hơn so với giếng 5 không bị xử lý nhiệt. Tương tự đối với trường hợp bổ sung enzyme bằng cách xay nhuyễn thu cả dịch trích bromelain và xác vỏ khóm thì lượng sản phẩm sinh ra cũng bị kết tủa một phần khi xử lý nhiệt do đó giếng số 6 (hình 10) không xử lí nhiệt sậm màu hơn giếng 7 (hình 10) bị xử lí nhiệt.
Kết quả điện di đồ của sản phẩm thủy phân bằng hai phương pháp trích bromelain vỏ khóm khác nhau dùng để thủy phân protein bã đậu nành ở phạm vi phòng thí nghiệm là phù hợp với kết quả phân tích đạm amin khi nhận thấy quá trình thủy phân protein bã đậu nành bằng phương pháp trích ly bromelain vỏ bằng cách ép chỉ lấy dịch trích bromelain và bỏ xác có hiệu quả tốt hơn.
CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1. Kết luận
Qua quá trình nghiên cứu thực hiện đề tài cho thấy:
Bromelain trích từ vỏ khóm có thể sử dụng để thủy phân protein bã đậu nành tạo chế phẩm dịch thủy phân giàu đạm amin dễ tiêu hóa với tỉ lệ enzyme là 6U.mg-1 cho 1g cơ chất.
Điều kiện thích hợp để bromelain vỏ thủy phân protein bã đậu nành là 50oC, ở pH 8,0 trong khoảng thời gian là 20 giờ thu được lượng đạm amin là 0,420 g/l.
Các băng protein bã đậu nành xuất hiện trên gel có trọng lượng phân tử lớn tương ứng là 19,7; 23,8; 33,6; 43,9; 58,4 và 62,9 kDa bị thủy phân sau 20 giờ. Kết quả cho thấy thành phần trong dịch thủy phân ngoài acid amin còn có các băng là các đoạn peptid ngắn có trọng lượng phân tử từ 14,4 - 18,4 kDa.
5.2. Đề nghị
Phân tích thành phần acid amin của dịch thủy phân.
Kết hợp với các loại protease khác để tăng khả năng thủy phân bã đậu nành. Khảo sát các điều kiện thủy phân như nhiệt độ, thời gian, pH,...
Khảo sát điều kiện sấy, hàm lượng phối trộn dịch thủy phân bã đậu nành với chất độn để tạo chế phẩm bột đạm sử dụng cho chăn nuôi gia súc và thủy sản.
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 40 Viện NC&PT Công Nghệ Sinh học
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt
Dương Thị Hương Giang. 2004. Giáo Trình thực tập công nghệ enzyme. Trường đại học Cần Thơ, 40 trang.
Đinh Thị Bé Ngọc. 2012. Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân protein từ nước rửa máu cá tra bằng bromelain vỏ khóm. Luận văn tốt nghiệp đại học. Viện NC&PT Công nghệ Sinh học. Trường Đại học Cần Thơ.
Đỗ Quý Hai. 2004. Giáo trình Hóa sinh đại cương, Tài liệu lưu hành nội bộ Trường Đại Học Khoa Học Huế.
Hà Thanh Toàn, Dương Thị Phượng Liên. 2012. Giáo trình Công nghệ sau thu hoạch ngũ cốc. Nhà xuất bản Đại học Cần Thơ.
Lại Mai Hương. 2008. Nghiên cứu công nghệ chế biến bã đậu nành tạo chế phẩm dinh dưỡng giàu chất xơ. Đề tài nghiên cứu cấp Thành Phố. Mạng Thông Tin Khoa Học & Công Nghệ TP. HCM.
Lại Thị Ngọc Hà, 2009. Tách và tạo chế phẩm bromelain từ phế phụ phẩm dứa. Tạp chí Khoa học và Phát triển, 7(2): 203-211.
Lê Thị Anh Thư. 2008. Ảnh hưởng của pH và nhiệt độ lên hoạt tính xúc tác của enzyme papin trong đu đủ. Luận văn tốt nghiệp đại học. Khoa Nông nghiệp & SHƯD. Trường Đại học Cần Thơ.
Lý Thị Thùy Trang. 2006. Nghiên cứu thủy phân protein bánh dầu đậu nành bằng enzyme proteaz. Luận văn Thạc sĩ khoa học. Viện NC&PT Công nghệ Sinh học. Trường Đại học Cần Thơ.
Nguyễn Đức Lượng. 2001. Công nghệ Sinh học. Nhà xuất bản Đại học Quốc Gia TP. Hồ Chí Minh.
Nguyễn Đức Lượng. 2004. Công nghệ enzyme. Nhà xuất bản Đại học Quốc Gia TP. Hồ Chí Minh.
Nguyễn Đức Lượng và Phạm Minh Tâm. 2002. Vệ sinh và an toàn thực phẩm. Nhà xuất bản Đại học Quốc Gia TP. Hồ Chí Minh.
Nguyễn Lân Dũng và Bùi Thị Việt Hà. 2009. Sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật. Nhà xuất bản Đại học Quốc Gia TP. Hồ Chí Minh.
Nguyễn Thái Nguyên. 2011. Khảo sát các điều kiện ảnh hưởng đến quá trình sấy phun dịch đạm thủy phân từ trùn quế (Perionyx excavatus). Luận văn tốt nghiệp đại học. Viện NC&PT Công nghệ Sinh học. Trường Đại học Cần Thơ.
Nguyễn Thanh Phương. 2010. Nghiên cứu thủy phân protein bánh dầu đậu nành thành đạm hòa tan bằng nấm mốc Aspergillus oryzae, kết hợp enzyme papain và vi khuẩn Bacillus subtilis. Luận văn tốt nghiệp đại học. Viện NC&PT Công nghệ Sinh học. Trường Đại học Cần Thơ.
Nguyễn Thị Kim Đông. 2009. Ảnh hưởng của sự bổ sung bã đậu nành trong khẩu phần lên tăng trưởng, tỉ lệ tiêu hóa dưỡng chất và hiệu quả kinh tế của Thỏ lai. Tạp chí khoa học - trường Đại Học Cần Thơ, 11: 51-59.
Nguyễn Thị Ngọc Tĩnh. 2013. Ứng dụng vi khuẩn nitrate hóa trong nuôi trồng thủy sản. Viện Nghiên cứu Nuôi trồng thủy sản II.
Nguyễn Thị Xuân Dung. 2005. Nghiên cứu sử dụng enzyme papain để thủy phân protein trong bánh dầu đậu nành. Luận văn tốt nghiệp đại học. Viện NC&PT Công nghệ Sinh học. Trường Đại học Cần Thơ.
Phạm Thu Cúc. 1999. Giáo trình sinh hóa I. Tủ sách Đại Học Cần Thơ
Phạm Thị Trân Châu, Trần thi Áng. 1999. Hoá sinh học, NXB Giáo dục, Hà Nội. Phan Thị Xuân Huyên. 2008. Sử dụng enzyme bromelain - khóm để ức chế hoạt động
của enzyme pectinmetylesterase trong nước ép trái bưởi. Luận văn tốt nghiệp đại
học. Khoa Nông Nghiệp và SHƯD. Trường Đại học Cần Thơ.
Trần Cảnh Đình, Vũ Xuân Sơn, Nguyễn Thị Hường. 2010. Nghiên cứu chế độ thủy phân phế liệu đầu tôm bằng enzyme. Bản tin quý số 15-tháng 1-2010, Viện Nghiên cứu Hải sản.
Trần Minh Tâm. 2000. Bảo Quản & Chế Biến Nông Sản Sau Thu Hoạch. Nhà xuất bản Nông Nghiệp, 402 trang.
Trần Thanh Trúc. 2007. Ảnh hưởng của pH và nhiệt độ lên hoạt tính xúc tác của enzyme Bromelain trong quả dứa. Luận văn tốt nghiệp. Khoa Nông Nghiệp và SHƯD. Trường Đại học Cần Thơ.
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 42 Viện NC&PT Công Nghệ Sinh học
Trương Thị Minh Hạnh và Nguyễn Thị Thanh Tịnh. 2013. Nghiên cứu quá trình thủy phân - lên men acid citric từ bã đậu nành bằng Aspergillus oryzae và Aspergillus niger. Tạp chí khoa học & Công nghệ. Đại học Đà Nẵng, 01(62): 54-59.
Vũ Ngọc Bội. 2008. Tối ưu hóa quá trình phân giải protein của protease trong thịt cá và thử nghiệm sản xuất mới từ protein được thủy phân. Luận án tiến sĩ kỹ thuật. Đại học kỹ thuật Nha Trang.
Tiếng Anh.
Bradford, M.M. 1976. A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding. Anal. Biochem., 72: 248-254.
Bollag, D.M., S.J. Edelstein. 1991. Protein Methods. New York: J Wiley and Sons. Bourne, M.C., M.G. Clemente and J. Banzon. 1976. Survey of the suitability of thirty
cultivars of soybeans for soymilk manufacture. J. Food Sci., 4: 1204-1208. Briggs, G.E., J.B.S. Haldane. 1925. A note on the kinematics of enzyme action. J.
Biochem., 19(2): 338–339.
Bruno, M.A., M.F. Pardo, N.O. Caffini, L.M.I. López. 2003. Hieronymain I, a new cysteine peptidase isolated from unripe fruits of Bromelia hieronymi Mez (Bromeliaceae). J. Protein Chem., 22(2): 127-34.
Coppens d’Eeckenbrugge, G., F. Leal. 2001. The application of International Code of Nomemclature to pineapple cultivars. Tropical Fruits Newsletter 40-41:20-31. Endres, J.G. 2001. Soy protein products: characteristics, nutritional aspects and
utilization (edition). Library of Congress, AOCS Press ISBN 1-893997-27-8. United States of America
Garcia-Carreno, F.L., N.F. Haard. 1993. Characterization of proteinase classes in langostilla (Pleuroncodes palanipes) extracts. J. Food Biochem., 17: 97 - 113. Godfrey, T., J. Reichelt. 1983. Industrial Enzymology. Macmillan Publishers Ltd.,
Surrey (U.K.).
Gortner, W.A., and V.L. Singleton. 1965. Chemical and physical development of the pineapple fruit. III. Nitrogenous and enzyme constitents. J. Food Sci., 30: 24–9. Head, K.A. 1997. Isoflavones and other soy constituents in human health and disease.