e d c b a a a a a g g g f e d c b a g f e cd a ab bc cd d 0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30 0,35 0,40 0,45 0,50 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 H à m l ư ợ n g đạ m ( g /l )
Thời gian (giờ)
Đạm formol Đạm amoniac Đạm amin
Hình 7: Biểu đồ ảnh hưởng của thời gian đến hàm lượng đạm
*Ghi chú:
Các giá trị có cùng ký tự không khác biệt ý nghĩa thống kê ở mức 5%
%CV (formol): 3,15; %CV (amoniac): 5,14; %CV (amin): 3,73
Thời gian thủy phân cũng là một trong những yếu tố quan trọng có ảnh hưởng lớn đến khả năng thủy phân của enzyme.
Khi thời gian thủy phân càng lâu thì hàm lượng đạm amoniac càng tăng. Trong khoảng thời gian ngắn từ 4-12 giờ thì hàm lượng đạm amoniac bằng 0. Nhưng hàm lượng đạm amoniac lại tăng rất nhanh đạt giá trị lần lượt là 0,014 - 0,110g/l khi tiếp tục kéo dài thời gian thủy phân từ 16 - 48 giờ và hàm lượng đạm amoniac cao nhất là 0,110g/l khi thời gian thủy phân là 48 giờ (bảng 17, phụ lục 2) khác biệt có ý nghĩa thống kê so với các mức thời gian khác.
Nguyên nhân là thời gian càng dài cùng với môi trường thích hợp là điều kiện thuận lợi cho vi sinh vật nhân mật số (Nguyễn Lân Dũng và Bùi Thị Việt Hà, 2009). Khi mật số vi sinh vật càng lớn thì quá trình chuyển hóa acid amin thành amoniac càng mạnh. Do vậy khi thời gian thủy phân bã đậu nành càng lâu thì hàm lượng đạm amoniac sinh ra càng nhiều.
Qua kết quả khảo sát cho thấy trong quá trình thủy phân protein bã đậu nành bằng bromelain vỏ, thời gian thủy phân từ 4 - 48 giờ thì hàm lượng đạm formol tăng
dần. Trong đó thì khoảng thời gian từ 4 - 20 giờ hàm lượng đạm formol tăng nhanh từ 0,177 - 0,462g/l nhưng khi tiếp tục kéo dài thời gian thủy phân hơn nữa thì hàm lượng đạm formol có tăng nhưng khác biệt giữa các khoảng thời gian không có ý nghĩa thống kê và đạt 0,471g/l mức thời gian thủy phân là 48 giờ (bảng 17, phụ lục 2).
Nguyên nhân có thể là do khi phản ứng thủy phân đã đạt giá trị cực đại thì chính các sản phẩm thủy phân này sẽ ức chế lại hoạt động của enzyme vì vậy khi kéo dài thời gian thủy phân thì hàm lượng đạm formol cũng không tăng nữa. Thêm vào đó khả năng thủy phân của enzyme cũng giảm do bị biến tính khi thời gian thủy phân kéo dài (Whitaker et al., 2003). Vì vậy trong giai đoạn này quá trình thủy phân không xảy ra nữa mà chỉ có các loại vi sinh vật chuyển hóa acid amin thành đạm amoniac. Do đó hàm lượng đạm formol không có sự thay đổi lớn.
Qua biểu đồ hình 7 cho thấy khi thời gian thủy phân từ 4-20 giờ, hàm lượng đạm amin sinh ra càng tăng từ 0,177 - 0,420g/l (bảng 17, phụ lục 2) . Hàm lượng đạm amin đạt giá trị cao nhất là 0,420g/l ở 20 giờ và có khác biệt ý nghĩa ở mức 5% so với các nghiệm thức còn lại. Sau đó tiếp tục kéo dài thời gian từ 24 - 48 giờ, hàm lượng đạm amin giảm dần từ 0,406 - 0,362g/l (bảng 17, phụ lục 2).
Điều này có thể giải thích là trong quá trình thủy phân theo thời gian, enzyme có thể tự phân giải, bị biến tính, mất hoạt tính hoặc sản phẩm sinh ra ức chế hoạt động của enzyme (Whitaker et al., 2003)..
Kết quả này khá phù hợp với nghiên cứu của Đỗ Thúy Vi (2005) kết luận 24 giờ là thời gian thích hợp để bromelain thủy phân bánh dầu đậu nành.
Tuy nhiên kết quả này khác với kết quả của Trần Cảnh Đình et al., (2010) cũng ghi nhận thời gian tối ưu cho enzyme bromelain thủy phân phế liệu đầu tôm là 2 giờ. Thêm vào đó Đinh Thị Bé Ngọc (2012) cho rằng thời gian để bromelain vỏ thủy phân nước rửa máu cá tra tốt nhất là 30 giờ, Nguyễn Thị Thanh Trúc et al., (2010) khi nghiên cứu thời gian thủy phân của bromelain trên cơ chất máu cá tra là 32 giờ.
Quá trình thủy phân nhanh hay chậm còn phụ thuộc nhiều vào yếu tố như khả năng phân cắt của enzyme, kích thước và cấu trúc phân tử của protein.
Do đó từ kết quả thí nghiệm thời gian thủy phân 20 giờ được chọn để tiến hành thí nghiệm tiếp theo.
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 32 Viện NC&PT Công Nghệ Sinh học
Kết quả điện di SDS - PAGE khảo sát quá trình thủy phân protein bã đậu nành bằng bromelain vỏ khóm theo thời gian
Hình 8a: Phổ điện di SDS-PAGE khảo sát sự thủy phân của bromelain vỏ trên protein bã đậu nành theo thời gian
*Ghi chú:
Hình 8a.
Giếng 1: Protein chuẩn. Giếng 2: Mẫu thủy phân 4 giờ. Giếng 3: Mẫu thủy phân 8 giờ. Giếng 4: Mẫu thủy phân 12 giờ. Giếng 5: Mẫu thủy phân 16 giờ. Giếng 6: Mẫu thủy phân 20 giờ. Giếng 7: Mẫu thủy phân 24 giờ. Giếng 8: Mẫu đậu nành đối chứng. Giếng 9: Bromelain vỏ. 35 45 25 18,4 14,4 kDa 112 28,8 kDa 16,5 kDa 15,1 kDa 19,7 kDa 23,8 kDa 54,8 kDa 62,9 kDa 39,9 kDa 33,6 kDa 66,2 35 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Hình 8b:Điện di đồ của protein bã đậu nành được thủy phân theo thời gian
Hình 8b.
Giếng 1': Protein chuẩn.
Giếng 2': Mẫu đậu nành đối chứng. Giếng 3': Mẫu thủy phân 16 giờ. Giếng 4': Mẫu thủy phân 20 giờ. Giếng 5': Mẫu thủy phân 24 giờ. Giếng 6': Mẫu thủy phân 32 giờ. Giếng 7': Mẫu thủy phân 40 giờ. Giếng 8': Mẫu đậu nành 48 giờ.
Giếng 9': Bromelain vỏ.
Từ kết quả điện di (hình 8) suy ra phương trình tuyến tính thể hiện mối tương quan giữa trọng lượng phân tử M (y = logM) của protein chuẩn và sự dịch chuyển tương đối của các băng protein (x = Rf) là:
y = - 0,9538x + 2,0406 có độ tin cậy R2= 96,08%.
Kết quả điện di đồ khảo sát quá trình thủy phân protein trong bã đậu nành theo các mức thời gian cho thấy:
43,9kDa 33,6kDa 19,7kDa 16,5kDa 14,4 18,4 25 35 23,8kDa kDa 112 66,2 45 62,9kDa 54,8kDa 28,8kDa 15,1kDa 1' 2' 3' 4' 5' 6' 7' 8' 9' 33,6kDa
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 34 Viện NC&PT Công Nghệ Sinh học
Từ kết quả giếng 9 (hình 8a) và 9' (hình 8b) cho thấy bromelain vỏ có trọng lượng phân tử khoảng 28,8 kDa, kết quả điện di này phù hợp với kết quả nghiên cứu của Yamada et al., (1976) khi cho rằng bromelain vỏ có phân tử lượng khoảng từ 23 đến 31 kDa tùy thuộc vào kỹ thuật phân tích của phòng thí nghiệm.
Qua kết quả điện di cho thấy bã đậu nành chứa hàm lượng protein lớn với các trọng lượng phân tử khác nhau từ 14,4 - 66,2 kDa (giếng 8, hình 8a; giếng 2', hình 8b). Trong đó băng protein chủ đạo thể hiện rõ trên gel điện di có trọng lượng phân tử lần lượt là 15,1; 16,5; 19,7; 23,8; 33,6; 43,9; 58,4 và 62,9 kDa.
Có thể thấy rõ thời gian có ảnh hưởng lớn đến quá trình thủy phân. Dễ dàng nhận thấy tất cả các giếng có chứa dịch thủy phân khi thời gian tăng dần thì quá trình thủy phân diễn ra càng có hiệu quả. So với đối chứng là mẫu đậu nành (giếng 8, hình 8a; giếng 2', hình 8b) cho thấy các băng protein của mẫu đậu nành đã được thủy phân có hiệu quả nên các băng này đã mờ dần.
Cụ thể trong khoảng thời gian từ 4 - 24 giờ (từ giếng 2 - 7, hình 8a) bã đậu nành đã được thủy phân tốt nên các băng protein ở kích thước phân tử lớn là 19,7; 23,8; 33,6; 43,9; 58,4 và 62,9 kDa đã mờ đi rõ rệt vì lượng protein này đã bị bromelain vỏ phân cắt thành các acid amin và các peptid có trọng lượng phân tử nhỏ hơn khoảng 14,4 - 18,4 kDa. Cụ thể từ giếng 2 - 5 (hình 8a) tương ứng với mức thời gian thủy phân là 4 - 16 giờ các protein lớn bị thủy phân tạo thành acid amin hoặc các peptid có trọng lượng phân tử nhỏ hơn khoảng 14,4 - 18,4 kDa nhưng quá trình thủy phân chưa triệt để vẫn còn băng mờ ở trọng lượng phân tử 33,6; 58,4 và 62,9 kDa. Khi từ 20 giờ (giếng 6, hình 8a) về sau thì các băng này nhạt dần và khó nhận diện trên gel cho thấy quá trình thủy phân tăng khi kéo dài thời gian thủy phân.
Khi thời gian thủy phân từ 20 - 48 giờ (giếng 4' - 8', hình 8b) thì các băng có trọng lượng phân tử lớn là 58,4 và 62,9 kDa không còn xuất hiện trên gel. Nhưng vẫn còn băng mờ ở trọng lượng phân tử 33,6 kDa. Điều này cho thấy đạm trong bã đậu nành là loại đạm khó thủy phân khi kéo dài quá trình thủy phân thì prorein chỉ bị thủy phân phần lớn chứ không thủy phân hoàn toàn. Kết quả này phù hợp với kết quả phân tích đạm amin khi dịch thủy phân 20 giờ (giếng 6, hình 8a và giếng 4', hình 8b) có kết quả điện di tốt vì các băng protein bã đậu nành có trọng lượng phân tử lớn 33,6; 43,9; 58,4 và 62,9 kDa đã mờ đi rõ rệt so với đối chứng bã đậu nành tạo sản phẩm thủy phân chứa acid amin và các đoạn peptid ngắn có trọng lượng phân tử từ 14,4 đến 18,4kDa.