Mục đích:
Xác định được trọng lượng của những phân tử protein hoặc những đoạn peptide có trong mẫu.
Nguyên tắc:
Phương pháp SDS - PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate - Polyacrylamide Gel Electrophoresis) còn được gọi là phương pháp điện di trên gel acrylamide không liên tục và mẫu protein được gây biến tính (discontinuous and denaturing). SDS là một tác nhân làm biết tính và âm tính hóa các phân tử protein. Dưới tác động của điện trường protein sẽ dịch chuyển bên trong lớp gel về cực dương và sự dịch chuyển này chỉ phụ thuộc vào kích thước. Từ đó xác đinh được trong lượng phân tử của protein.
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 18 Viện NC&PT Công Nghệ Sinh học
CHƯƠNG 3. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Phương tiện nghiên cứu
3.1.1. Thời gian, địa điểm
- Thời gian: từ tháng 8/2013 đến tháng 11/2013
- Địa điểm: thí nghiệm được thực hiện tại PTN Sinh hóa, PTN Công nghệ Enzyme và PTN Vi sinh thực phẩm của Viện nghiên cứu và phát triển Công nghệ Sinh học, trường Đại Học Cần Thơ.
3.1.2. Dụng cụ, thiết bị
Tủ lạnh hitsuji, tủ lạnh đông sanyo, tủ sấy Ehret, máy ly tâm Centrifuge 5415, máy đo quang phổ, máy vortex, máy vô cơ, máy phân tích nitơ tổng, water bath, máy đo pH Inolab, máy ép mẫu Panasonic, cân phân tích Mettler Aj150, cuvette thạch anh, ống eppendorf, beaker, ống nghiệm, bình tam giác, ống đong, ống nhỏ giọt, pipet, micropipet, buret và một số dụng cụ khác.
3.1.3. Nguyên vật liệu
Vỏ khóm được xin tại chợ Xuân Khánh - Thành phố Cần Thơ
Bã đậu nành được thu tại hộ sản xuất sữa đậu nành số 218/15B, đường Trần Hưng Đạo, phường An Nghiệp, quận Ninh Kiều, thành phố Cần Thơ.
3.1.4. Hóa chất
Casein, L - Cysteine hydrochlorid – monohydrate (Merck), Trichloroacetic acid (TCA) (Trung Quốc), sodium dihydro phosphate (NaH2PO4.2H2O) (Trung Quốc), Ethylene diamine tetraacetic acid disodium salt (EDTA) (Trung Quốc), Tris, Glycerin, L - Tyrosine (C9H11NO3) (Merck), Disodium hydro phosphate (Na2HPO4.12H2O), acid sulfuric (H2SO4) (Trung Quốc), Coomassie Brilliant Blue G250, Coomassie Brilliant Blue R250, Bromophenol blue, Sodium hydroxide (NaOH) (Trung Quốc), Magie oxit (MgO) (Trung Quốc), acid boric (H3BO3), acid clohidric (HCl) (Trung Quốc), Amonium persulphat (APS), Tetramethylethylenediamine (TEMED), Tris, Sodium dodecyl sulfate (SDS), Glycerol (Trung Quốc), Methanol, Acid Acetic, Sodium acetate (CH3COONa) (Trung Quốc),....
3.2. Phương pháp nghiên cứu3.2.1. Chuẩn bị nguyên liệu 3.2.1. Chuẩn bị nguyên liệu
Bã đậu nành sau khi thu tại cơ sở sản xuất được làm khô bằng cách sấy ở nhiệt độ 40oC khoảng 48 giờ, sau đó xay nhuyễn, rây và được bảo quản ở điều kiện khô ráo để sử dụng bố trí thí nghiệm.
Vỏ khóm được xin tại chợ Xuân Khánh về đem ép lấy dịch ngay, sau đó ly tâm dịch khóm ở 4oC với tốc độ 7000 vòng/phút, 10 phút để loại bỏ tạp chất. Dịch trong thu được là bromelain. Enzyme này sau khi trích ly được bảo quản ở -20oC sử dụng bố trí thí nghiệm.
3.2.2. Khảo sát nguyên liệu
- Xác định ẩm độ của bã đậu nành (phụ lục 1).
- Xác định hàm lượng nitơ tổng và hàm lượng protein trong bã đậu nành bằng phương pháp Kjeldahl (phụ lục 1).
- Xác định hàm lượng đạm amin trong bã đậu nành bằng phương pháp chuẩn độ đạm formol và ammoniac (phụ lục 1).
- Khảo sát hàm lượng protein của bromelain trong dịch chiết vỏ khóm bằng phương pháp Bradford (phụ lục 1).
- Khảo sát hoạt tính bromelain trong dịch chiết vỏ khóm bằng phương pháp Kunitz cải tiến (phụ lục 1).
3.2.3. Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân
Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến quá trình thủy phân
- Mục đích: xác định nồng độ enzyme thích hợp cho quá trình thủy phân để sản phẩm sinh ra có hàm lượng đạm amin cao nhất.
- Bố trí thí nghiệm: hoàn toàn ngẫu nhiên một nhân tố (nồng độ enzyme) với 10 mức độ, 3 lần lặp lại, tổng số 30 đơn vị thí nghiệm.
Bảng 3: Bố trí thí nghiệm 1
Nghiệm thức NT1 NT2 NT3 NT4 NT5 NT6 NT7 NT8 NT9 NT10 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
[Enzyme]
(U/g cơ chất) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 20 Viện NC&PT Công Nghệ Sinh học
- Tiến hành thí nghiệm: 1g cơ chất protein bã đậu nành sau khi bổ sung enzyme ở các nồng độ 1; 2; 3; 4; 5; 6; 7; 8; 9; 10U.mg-1 được thủy phân ở nhiệt độ 30oC trong 16 giờ. Mỗi NT đều có mẫu đối chứng là enzyme bất hoạt. Kết thúc thủy phân ly tâm 3500 vòng/phút trong 10 phút thu dịch trong dùng để xác định hàm lượng đạm amin.
- Chỉ tiêu đánh giá:
+ Hàm lượng đạm formol và amoniac sinh ra (phụ lục 1). + Hàm lượng đạm amin sinh ra (phụ lục 1).
Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình thủy phân
- Mục đích: xác định nhiệt độ thích hợp cho quá trình thủy phân để sản phẩm sinh ra có hàm lượng đạm amin cao nhất.
- Bố trí thí nghiệm: hoàn toàn ngẫu nhiên 1 nhân tố (nhiệt độ thủy phân) với 8 mức độ, 3 lần lặp lại, tổng số đơn vị thí nghiệm là 24.
Bảng 4: Bố trí thí nghiệm 2
Nghiệm thức NT1 NT2 NT3 NT4 NT5 NT6 NT7 NT8
Nhiệt độ (oC) 30 35 40 45 50 55 60 65
*NT: Nghiệm thức
- Tiến hành thí nghiệm: Protein bã đậu nành trong mỗi nghiệm thức sau khi bổ sung nồng độ enzyme thích hợp chọn ở thí nghiệm 1 đem thủy phân ở các nhiệt độ 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65oC trong 16 giờ. Mỗi NT đều có mẫu đối chứng là enzyme bất hoạt. Kết thúc thủy phân ly tâm 3500 vòng/phút trong 10 phút thu dịch trong dùng để xác định hàm lượng đạm amin.
- Chỉ tiêu đánh giá:
+ Hàm lượng đạm formol và amoniac sinh ra (phụ lục 1). + Hàm lượng đạm amin sinh ra (phụ lục 1).
Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của pH đến quá trình thủy phân
- Mục đích: xác định pH thích hợp cho quá trình thủy phân để sản phẩm sinh ra có hàm lượng đạm amin cao nhất.
- Bố trí thí nghiệm: hoàn toàn ngẫu nhiên 1 nhân tố (pH môi trường thủy phân) với 10 mức độ, 3 lần lặp lại, tổng số đơn vị thí nghiệm là 30.
Bảng 5: Bố trí thí nghiệm 3
NT NT1 NT2 NT3 NT4 NT5 NT6 NT7 NT8 NT9 NT10
pH 3 4 5 6 7 7,5 8 8,5 9 10
*NT: Nghiệm thức
- Tiến hành thí nghiệm: Protein bã đậu nành trong mỗi nghiệm thức sau khi bổ sung nồng độ enzyme và được ủ nhiệt độ thích hợp chọn ở thí nghiệm 1 và 2 đem thủy phân ở các mức pH 3; 4; 5; 6; 7,5; 8; 8,5; 9; 10 trong 16 giờ. Mỗi NT đều có mẫu đối chứng là enzyme bất hoạt. Kết thúc thủy phân ly tâm 3500 vòng/phút trong 10 phút thu dịch trong dùng để xác định hàm lượng đạm amin.
- Chỉ tiêu đánh giá:
+ Hàm lượng đạm formol và amoniac sinh ra (phụ lục 1). + Hàm lượng đạm amin sinh ra (phụ lục 1).
Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của thời gian đến quá trình thủy phân
- Mục đích: xác định thời gian thích hợp cho quá trình thủy phân để sản phẩm sinh ra có hàm lượng đạm amin cao nhất.
- Bố trí thí nghiệm: hoàn toàn ngẫu nhiên 1 nhân tố (thời gian thủy phân) với 9 mức độ, 3 lần lặp lại, tổng số đơn vị thí nghiệm là 27.
Bảng 6: Bố trí thí nghiệm 4 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Nghiệm thức NT1 NT2 NT3 NT4 NT5 NT6 NT7 NT8 NT9
Thời gian (giờ) 4 8 12 16 20 24 32 40 48
*NT: Nghiệm thức
- Tiến hành thí nghiệm: Protein bã đậu nành trong mỗi nghiệm thức sau khi bổ sung nồng độ enzyme, nhiệt độ thủy phân, pH thích hợp chọn ở thí nghiệm 1, 2 và 3 đem thủy phân ở các mức thời gian 4, 8, 12, 16, 20, 24, 32, 40, 48 giờ. Mỗi NT đều có mẫu đối chứng là enzyme bất hoạt. Kết thúc thủy phân ly tâm 3500 vòng/phút trong 10 phút thu dịch trong dùng để xác định hàm lượng đạm amin.
- Chỉ tiêu đánh giá:
+ Hàm lượng đạm formol và amoniac sinh ra (phụ lục 1). + Hàm lượng đạm amin sinh ra (phụ lục 1).
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 22 Viện NC&PT Công Nghệ Sinh học
Thí nghiệm 5: Khảo sát phương pháp trích ly bromelain vỏ để thủy phân bã đậu nành ở phạm vi phòng thí nghiệm
- Mục đích: xác định quy trình trích bromelain vỏ thích hợp cho quá trình thủy phân để sản phẩm sinh ra có hàm lượng đạm amin cao. Đồng thời đánh giá khả năng thủy phân bã đậu nành ở phạm vi phòng thí nghiệm.
- Bố trí thí nghiệm: hoàn toàn ngẫu nhiên 1 nhân tố (phương pháp trích ly bromelain vỏ), với 2 mức độ (dịch trích bromelain và bã vỏ khóm được xay nhuyễn), 2 lần lặp lại, 4 đơn vị thí nghiệm.
Bảng 7: Bố trí thí nghiệm 5
Nghiệm thức NT1 NT2
Phương pháp trích bromelain Dịch trích bromelain Bã vỏ khóm xay nhuyễn
*NT: Nghiệm thức
- Tiến hành thí nghiệm:
Tiến hành thủy phân 200g bã đậu nành ở nhiệt độ, pH và thời gian thủy phân chọn ở thí nghiệm 2, 3 và 4 bổ sung bromelain từ 2 phương pháp trích ly khác nhau:
Ép vỏ khóm thu dịch khóm sau đó ly tâm 7000 vòng/phút ở 4oC trong 10 phút. Phần dịch trong là bromelain được dùng để bố trí thí nghiệm.
Bromelain được thu bằng cách xay nhuyễn vỏ khóm. Trong hỗn hợp này có chứa cả dịch bromelain và xác vỏ khóm, dùng hỗn hợp có chứa bromelain này để bố trí thí nghiệm.
Mỗi NT đều có mẫu đối chứng là enzyme bất hoạt. Kết thúc thủy phân ly tâm 3500 vòng/phút trong 10 phút thu dịch trong dùng để xác định hàm lượng đạm amin.
- Chỉ tiêu đánh giá:
+ Hàm lượng đạm formol và amoniac sinh ra (phụ lục 1). + Hàm lượng đạm amin sinh ra (phụ lục 1).
+ Trọng lượng phân tử của sản phẩm thủy phân trên gel SDS-PAGE (phụ lục 1).
3.2.4. Phương pháp xử lý số liệu
Các kết quả thí nghiệm được phân tích bằng: Phần mềm Microsoft Excel 2007.
CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Thành phần nguyên liệu
4.1.1. Hàm lượng nitơ, protein tổng số, hàm lượng amin và độ ẩm trong bã đậu nành đậu nành
Kết quả khảo sát cho thấy hàm lượng nitơ tổng số của bã đậu nành là 4,8628 %, hàm lượng protein tổng số là 30,39 %. Cho thấy qua quá trình xử lý nhiệt, ép lấy nước từ mẫu đậu nành, protein trong bã đậu vẫn còn khá cao so với protein ban đầu trong đậu nành khoảng 35 - 45 % (Mian, 2006).
Kết quả hàm lượng protein này lại cao hơn so với kết quả nghiên cứu của Van der Reit et al., (1989) khi ghi nhận hàm lượng protein trong bã đậu nành là 25,4 - 28,4%. Và kết quả này cũng cao hơn so với nghiên cứu của Ma et al., (1996) khi ghi nhận hàm lượng protein trong bã đậu nành là: 26,8%. Sự khác nhau này có thể là do tại ứng với quy trình sản xuất khác nhau thì thành phần bã đậu nành sẽ thay đổi khác nhau.
Đồng thời sau xử lí nguyên liệu bã đậu nành có ẩm độ là 8,05%, điều này rất tốt cho quá trình bảo quản nguyên liệu khỏi sự gây hại các loại vi sinh vật trong quá trình nghiên cứu.
4.1.2. Hoạt tính và hàm lượng protein trong dịch chiết vỏ khóm (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Kết quả phân tích cho thấy trong dịch trích bromelain từ vỏ khóm có hàm lượng protein là 2,316 mg/ml và hoạt tính tổng là 14,119 U/ml. Từ đó hoạt tính đặc hiệu trong dịch chiết vỏ khóm là 6,096 U.mg-1.
Kết quả hoạt tính đặc hiệu của bromelain vỏ ghi nhận được cao hơn so với nghiên cứu của Lại Thị Ngọc Hà (2009) (4,236 U.mg-1) và Đinh Thị Bé Ngọc (2012) (5,258 U.mg-1). Kết quả này cũng cao hơn nghiên cứu của Nguyễn Đức Lượng (2004) khi ghi nhận hoạt tính thủy phân cơ chất casein của enzyme bromelain vỏ xanh (4,0 U.mg-1), vỏ chín (3,0 U.mg-1).
Như vậy, có thể sử dụng dịch chiết enzyme vỏ khóm được trích ly này để tiến hành thí nghiệm khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân protein bã đậu nành của bromelain vỏ khóm để tạo thành dịch thủy phân giàu đạm amin.
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 24 Viện NC&PT Công Nghệ Sinh học
4.2. Ảnh hưởng của một số yếu tố đến quá trình thủy phân protein từ bã đậu nành nành
4.2.1. Ảnh hưởng của nồng độ enzyme
d d d d d d c c b a g g f e cd a ab bc cd d f f e d c ab ab b ab a 0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30 0,35 0 2 4 6 8 10 H à m l ư ợ n g đ ạ m ( g /l ) Nồng độ enzyme (U.mg-1) Đạm Amoniac Đạm amin Đạm formol
Hình 4: Biểu đồ ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến hàm lượng đạm *Ghi chú:
Các giá trị có cùng ký tự không khác biệt ý nghĩa thống kê ở mức 5% %CV (formol): 3,57; %CV (amoniac): 0; %CV (amin): 3,73
Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ enzyme bổ sung vào quá trình thủy phân (hình 4) cho thấy nồng độ enzyme là một yếu tố có ảnh hưởng lớn đến quá trình thủy phân bã đậu nành. Sau thời gian thủy phân là 16 giờ thì cả 3 hàm lượng đạm formol, amoniac và amin đều có sự thay đổi. Hàm lượng đạm formol tăng từ 0,126 - 0,287g/l khi nồng độ enzyme từ 1-7 U.mg-1 (bảng 14, phụ lục 2). Sau đó hàm lượng đạm formol giảm còn 0,275g/l tại nồng độ enzyme là 8 U.mg-1 nhưng lại tiếp tục tăng khi nồng độ enzyme tăng lên 9 và 10 U.mg-1 và hàm lượng đạm formol đạt giá trị cao nhất là 0,289g/l tại 10 U.mg-1 (bảng 14, phụ lục 2) không khác biệt ý nghĩa thống kê so với nồng độ 6,7 và 9U.mg-1.
Nguyên nhân của sự giảm rồi tăng của hàm lượng đạm formol ở nồng độ enzyme 8, 9 và 10 U.mg-1 là do khi nồng độ enzyme tăng thì hàm lượng đạm amoniac (một loại đạm không mong muốn) sinh ra ở các nghiệm thức cũng tăng dần. Cụ thể khi tăng nồng độ enzyme từ 1-6 U.mg-1 thì hàm lượng đạm amoniac bằng 0, tiếp tục tăng từ 7-
10 U.mg-1 thì hàm lượng đạm amoniac tăng mạnh từ 0,014 - 0,042 g/l và đạt giá trị cao nhất tại 10U.mg-1 là 0,042 g/l. Như đã biết thì hàm lượng đạm formol gồm có đạm amin và đạm amoniac. Do đó dựa vào biểu đồ cho thấy ở nồng độ enzyme là 9 và 10U.mg-1 có hàm lượng đạm amoniac cao lần lượt là 0,028 và 0,042 g/l (bảng 14, phụ lục 2). Nên dẫn đến hàm lượng đạm formol tăng so với nồng độ enzyme cao 8U.mg-1.
Hàm lượng amoniac tăng mạnh khi tăng nồng độ enzyme nguyên nhân có thể là do khi enzyme ở nồng độ cao thì phản ứng thủy phân chậm lại và tạo các sản phẩm phụ trong đó có amoniac hoặc do khi nồng độ enzyme cao các phân tử enzyme xúc tác tự phân cắt tạo thành acid amin vì bromelain có bản chất vẫn là một protein, sau đó vi sinh vật chuyển hóa acid amin và các sản phẩm thủy phân thành đạm amoniac (dạng NH4+) (Nguyễn Thị Ngọc Tĩnh , 2013)
Từ kết quả của hàm lượng đạm formol và amoniac cho thấy hàm lượng đạm amin sinh ra trong quá trình thủy phân protein bã đậu nành bằng bromelain vỏ khóm tuân theo phương trình động học Michaelis – Menten (1913). Theo biểu đồ hình 4, hàm lượng đạm amin tăng lên rất nhanh trong khoảng nồng độ enzyme từ 1 - 6 U.mg-1 với hàm lượng đạm amin tăng từ 0,126 g/l lên đến 0,282 g/l và hàm lượng đạm amin cao nhất đạt 0,282 g/l ở nồng độ 6U.mg-1 (bảng 14, phụ lục 2).
Tuy nhiên khi tiếp tục tăng nồng độ enzyme lên cao hơn 6U.mg-1 thì tốc độ phản ứng không tăng nữa. Khi nồng độ enzyme tăng từ 7 - 10U.mg-1 hàm lượng đạm amin sinh ra giảm từ 0,273 xuống còn 0,247 g/l (bảng 14, phụ lục 2) thấp hơn ở nồng độ 6U.mg-1 (khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5%).
Hiện tượng này có thể giải thích là ban đầu do lượng cơ chất nhiều đã gây kìm hãm hoạt động của enzyme, enzyme có thể liên kết với nhiều cơ chất tạo thành phức hợp enzyme-cơ chất không hoạt động (Phạm Thị Trân Châu, 1999). Sau đó khi đã có lượng cơ chất thích hợp thì vận tốc của phản ứng tỷ lệ thuận với nồng độ enzyme. Theo Roman (2006) thì hoạt động của enzyme sẽ không tăng đồng biến với nồng độ enzyme, ở nồng độ cao hơn 6U.mg-1 khả năng thủy phân của bromelain giảm có thể do khi tăng nồng độ enzyme lên cao sản phẩm sinh ra có thể tác động vào trung tâm hoạt động của enzyme làm cho enzyme mất đi hoạt tính xúc tác và phản ứng thủy phân không tăng nữa (Nguyễn Xuân Trình et al., 2011).
Qua khảo sát cho thấy với 6U.mg-1 bromelain vỏ khóm thủy phân 1g protein bã