Nuôi T.harzianum trong môi trường thạch Czapeck – Dox ( không Cacbon ) có bổ sung 0.5% ; 1% ; 2% ; 3% ; 4% chitin.
Sau thời gian 2 ngày nuôi cấy, cho 10 ml thuốc thử Lugol vào, để trong tối từ 5 - 10 phút, ta thu được kết quả như sau :
Tỷ lệ chitin (%) Đường kính vòng phân giải ( cm )
0,5 2,5
1 3,5
4 3,2
Bảng 4.2. Đường kính vòng tròn phân giải
Hình 4.3. Đường tròn phân giải Chitin 1%
Nhận xét :
Qua bảng trên ta nhận thấy rằng : đường kính vòng tròn phân giải ở tỷ lệ Chitin 1% ( 3,5 cm )lớn hơn so với đường kính vòng tròn phân giải của các tỷ lệ Chitin khác.
Như vậy khả năng sinh enzym Chitinase của T.harzianum ở tỷ lệ Chitin 1% là tốt nhất. Vì vậy ta chọn tỷ lệ Chitin 1% để nuôi cấy T.harzianum.
4.3. Nuôi lắc T.harzianum trong môi trường dịch thể để thu nhận sinh khối
T.harzianum có hoạt tính enzyme Chitinase mạnh nhất
Tiến hành nuôi cấy T.harzianum trong môi trường nước chiết giá có bổ sung 2% đường kính và 1% huyền phù Chitin . Sau đó đem nuôi lắc trong 7 ngày, ta thu được kết quả :
Hệ số pha loãng : n = 10
Thời gian nuôi cấy
OD Hàm lượng
Glucosamin
Tổng hoạt tính (đvht)
1 0,026 7,63 114,45 2 0,032 9,4 141 3 0,049 14,39 215,85 4 0,033 9,69 145,35 5 0,028 8,22 123,3 6 0,014 4,11 61,65 7 0,012 3,52 52,8
Bảng 4.3. Hoạt tính của enzyme Chitinase theo thời gian nuôi cấy
Nhận xét :
Từ kết quả trên ta nhận thấy rằng : khi nuôi lắc T.harzianum trong môi trường nước chiết giá có bổ sung 2% đường và 1% chitin thì hoạt tính của enzyme Chitinase
cao nhất ở ngày nuôi cấy thứ 3, vì lúc này hàm lượng Glucosamin được tạo ra là nhiều nhất ( 14,39µg/ml ). Sau ngày thứ 3 thì hoạt tính của enzyme Chitinase bắt đầu giảm.
Điều này có thể được giải thích như sau: trong quá trình tăng sinh khối, ở giai đoạn đầu, tế bào vi nấm tổng hợp các hệ enzyme Chitinase nhằm phân giải cơ chất Chitin có trong môi trường nuối cấy, tạo thành các hợp chất đơn giản và nhờ đó tăng cường quá trình trao đổi chất giữa tế bào với môi trường. Sau thời điểm hệ enzyme
Chitinase hoạt động ở mức cao nhất, hoạt tính enzyme có xu hướng giảm do trong quá trình thủy phân tạo ra nhiều sản phẩm trung gian hay sản phẩm cuối (Glucosamin) có thể gây ức chế quá trình sinh tổng hợp enzyme Chitinase hoặc gây kiềm chế dị hoá với các phân tử enzyme.
4.4. Định lượng Calci bằng phương pháp hóa học4.4.1. Khi ngâm Cua Đồng trong acid acêtic 15%4.4.1. Khi ngâm Cua Đồng trong acid acêtic 15% 4.4.1. Khi ngâm Cua Đồng trong acid acêtic 15%
Thực hiện ngâm Cua ở các nồng độ acid acetic khác nhau, ta thấy ở nồng độ acid acetic 15% là thích hợp nhất.
a) Hàm lượng Calci có trong dịch ngâm Số ngày ngâm ( ngày ) Vmẫu ( ml) VNaOH 1N ( ml ) V EDTA 0,1M ( ml ) % Ca ( %) 1 2 8 2,7 5,86 2 2 8 3,6 10,41 3 2 8 4,8 18,51 4 2 8 5,5 24,3 5 2 8 6,2 30,88 6 2 8 7 39,36 7 2 8 7 39,36
Bảng 4.4. Hàm lượng Calci có trong dịch ngâm acid acetic 15% (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hình 4.4. Hàm lượng Calcium có trong dịch ngâm acid acetic 15%
Nhận xét
Hàm lượng Ca2+ tăng nhanh trong 6 ngày đầu, sau ngày thứ 6 thì hàm lượng Ca2+ không tăng nữa.
Nguyên nhân là do lúc đầu nồng độ [H+] còn cao, khi tiếp xúc với cua đồng, phản ứng giữa Calcicacbonate và acid acetic diễn ra mạnh mẽ, Calci tan vào dịch nhiều. Sau đó, khi nồng độ [H+] giảm, không còn khả năng hoà tan lượng Calcicacnonat còn lại
Hình 4.5. Cua Đồng ngâm trong acid acetic 15% b) Sự biến thiên pH
Thời gian ngâm ( ngày ) pH
0 2,36 1 4,13 2 4,37 3 4,45 4 4,48 5 4,50 6 4,51
Bảng 4.5. Sự biến thiên pH khi ngâm cua trong acid acetic 15%
pH dịch ngâm Cua Đồng tăng nhanh trong ba ngày đầu, những ngày sau tăng chậm. Đến ngày thứ 7 và thứ 8 thì pH không tăng nữa. Điều này chứng tỏ rằng trong 3 ngày đầu, [H+] cao nên đã hòa tan Calci trong Cua Đồng khá nhiều, sau 3 ngày thì [H+] giảm, khả năng rút Calci ra ngoài là rất ít.
c) Đánh giá cảm quan Thời gian ngâm
( ngày) Đánh giá cảm quan
1 Cả con còn rất cứng 2 Cả con còn rất cứng
3 Phần mai và càng còn cứng, phần chân và bụng hơi mềm 4 Phần mai và càng còn cứng, phần chân và bụng hơi mềm 5 Phần giữa mai hơi mềm, phần chân và bụng mềm,càng
còn cứng
6 Phần giữa mai và càng hơi mềm, phần chân và bụng mềm
7 Cả con mềm hết
Bảng 4.6. Đánh giá cảm quan khi ngâm cua trong acid acetic 15%
Nhận xét
Qua bảng trên ta thấy : sau 7 ngày ngâm cua trong nồng độ acid acetic 15% thì độ mềm của cua biến đổi dần dần, đến ngày thứ 7 thì hầu hết cả con cua đã mềm và có mùi vị chua dịu.
4.4.2. Khi ngâm Cua Đồng trong acid lactic với các nồng độ khác nhau
Tiến hành thí nghiệm với các nồng độ acid lactic khác nhau : 10% , 15% , 20% , 25% , 30% , 35% , 40%.
Trong 15 ngày theo dõi , ta thu được kết quả như sau : Hàm lượng Calci ở các nồng độ khác nhau
Số ngày ngâm ( ngày ) Vmẫu ( ml) V EDTA 0,1M ( ml ) 10% 15% 20% 25% 30% 35% 40% 1 2 0,8 1,2 1,6 1,9 2,0 2,1 2,2 2 2 1,6 2,6 2,7 2,4 2,8 2,9 2,6 3 2 2,7 3,3 3,5 3,2 3,4 4 4,3 4 2 3,0 3,8 4,0 3,6 4,2 4,6 4,8 5 2 3,4 4,1 4,2 4,4 4,8 5,0 5,2 6 2 3,6 4,5 4,6 4,9 5,3 5,5 5,7 7 2 3,7 4,8 4,7 5,2 5,5 5,7 6 8 2 3,8 5 4,9 5,6 6,2 6,1 6,2 9 2 4 5,2 5,1 5,7 6,3 6,2 6,3 10 2 4,6 5,6 5,2 5,8 6,5 6,3 6,3 11 2 4,8 5,8 5,4 5,9 6,6 6,3 6,3 12 2 5,0 5,9 5,5 6,1 6,6 6,3 6,3 13 2 5,2 6 5,6 6,2 6,6 6,3 6,3 14 2 6 6,2 5,7 6,2 6,6 6,3 6,3 15 2 6 6,2 5,7 6,2 6,6 6,3 6,3
Bảng 4.7. Thể tích EDTA 0,1M theo các nồng độ acid lactic
Số ngày ngâm ( ngày ) %Ca 10% 15% 20% 25% 30% 35% 40% 1 0,5 1,2 2,1 2,9 3,2 3,5 3,9 2 2,1 5,4 5,9 4,6 6,3 6,8 5,4 3 5,9 8,8 9,8 8,2 9,3 12,8 14,8 4 7,2 11,6 12,8 10,4 14,2 17 18,5 5 9,3 13,5 14,2 15,6 18,5 20,1 21,7 6 10,4 16,3 17 19,3 22,6 24,3 26,1 7 11,0 18,5 19,3 21,7 24,3 26,1 28,9 8 11,6 20,1 20,9 25,2 30,9 29,9 31,4 9 12,9 21,7 21,7 26,1 31,9 30,9 31,9 10 17,0 25,2 23,4 27,0 35 31,9 31,9 11 18,5 27,0 24,3 28,0 35 31,9 31,9 12 20,08 27,9 25,2 29,9 35 31,9 31,9 13 21,72 28,9 26,1 30,9 35 31,9 31,9 14 28,92 30,9 26,1 30,9 35 31,9 31,9
Bảng 4.8. Hàm lượng Calci ở các nồng độ acid lactic khác nhau
Nhận xét: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Trong 15 ngày theo dõi ta nhận thấy :
+ Hàm lượng Calci càng ngày càng tăng lên. Ở các nồng độ acid lactic thấp như 10%, 15%, 20% thì lượng Calci được tách ra ít hơn so với các nồng độ cao 25%, 30%, 35%, 40%.
+ Ở tất cả các nồng độ, đến ngày thứ 14 và 15 thì lượng Calci không tăng lên nữa. Nhưng riêng ở các nồng độ 30%, 35%, 40% thì lượng Ca được tách ra rất nhiều và không tăng lên sau ngày thứ 10. Nguyên nhân này là do ở nồng độ acid cao thì nồng độ [H+] cao nên Calci tan vào dịch nhiều. Sau nhiều ngày ngâm thì nồng độ [H+] giảm, không còn khả năng hòa tan lượng Calcicacbonat còn lại trong Cua nữa thì lượng Calci gần như không hòa tan vào dịch ngâm nữa.
4.5. Xử lý Cua Đồng bằng phương pháp vi sinhQuy trình :Quy trình :Quy trình : Quy trình :
Bằng dịch và sinh khối T.harzianum nuôi trong môi trường nước chiết giá có bổ sung 2% đường và 1% huyền phù chitin, kết hợp với lên men lactic, ta có quy trình như sau :
Cua Đồng
Hấp chín
Bổ sung dịch lên men lactic Ngâm trong dịch sinh khối T.harzianum
Cua mềm vỏ,ăn được cả con
Tiến hành thí nghiệm :
+ Cua đem đi hấp chín
+ Ngâm Cua đã hấp chín vào trong dịch sinh khối T.harzianum đã được nuôi cấy lắc
+ Bổ sung dịch lên men lactic vào dịch sinh khối T.harzianum, sao cho dịch ngâm Cua có pH = 4,5 – 4,8 để cho T.harzianum sinh trưởng và phát triển bình thường.
+ Tỷ lệ ngâm ( m/V) = 70g/242ml = 1/3,5
Hình 4.6. Xử lý Cua Đồng bằng phương pháp vi sinh
Sau 8 ngày theo dõi, ta thu được kết quả như sau:
4.5.1. Kết quả định lượng Calcium (Ca)
Ngày ngâm ( ngày) Vmẫu ( ml) VNaOH 1N ( ml ) V EDTA 0,1M ( ml ) % Ca ( % ) 1 2 6 0,2 0,03 2 2 6 0,3 0,07 3 2 6 0,4 0,13 4 2 6 0,5 0,2 5 2 6 0,6 0,3 6 2 6 0,7 0,39 7 2 6 0,8 0,51 8 2 6 0,9 0,65
Bảng 4.9. Hàm lượng Calci có trong dịch ngâm Nhận xét :
Dựa vào bảng trên ta thấy : hàm lượng Calci có trong dịch ngâm tăng lên chậm ở 5 ngày đầu, nhưng sang đến ngày thứ 6 thì lượng Calci tăng lên nhanh hơn. Nguyên
nhân này có thể là do lượng acid lactic được tạo ra trong dịch ngâm tăng dần kết hợp với yếu tố nào khác để giải phóng Calci ra khỏi vỏ cua.
4.5.2. Kết quả định lượng acid lactic
Tiến hành thí nghiệm như ở 3.2.5
Sau 8 ngày theo dõi , ta có kết quả như sau :
Thời gian ngâm
( ngày ) Vmẫu
( ml)
VNaOH 0,1N ( ml ) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Lượng acid lactic ( mg ) 1 2 0,3 27 2 2 0,4 36 3 2 0,6 54 4 2 0,7 63 5 2 0,8 72 6 2 0,6 54 7 2 0,5 45 8 2 0,4 36
Bảng 4.10. Hàm lượng acid lactic có trong dịch ngâm
Nhận xét :
Sau 8 ngày theo dõi thì hàm lượng acid lactic có trong dịch ngâm ngày càng tăng lên trong 5 ngày đầu, và tăng nhiều nhất là đến ngày thứ 5 ( 72mg). Sau ngày thứ 5 thì hàm lượng acid lactic giảm dần. Điều này có thể do sinh khối T.harzianum tăng trưởng trong quá trình ngâm, đã sử dụng acid lactic như nguồn cacbon để tăng trưởng, làm giảm hàm lượng acid lactic. Tuy nhiên T.harzianum không làm giảm lượng Calci .
Hình 4.7. Sự biến đổi hàm lượng acid lactic
Tiến hành thí nghiệm như ở 3.2.3, ta có kết quả sau :
Thời gian ngâm
( ngày ) Vmẫu ( ml) OD Hàm lượng Glucosamin ( µg/ml ) 1 3 0,012 3,52 2 3 0,020 5,87 3 3 0,028 8,22 4 3 0,051 14,97 5 3 0,049 14,39 6 3 0,013 3,2 7 3 0,009 2,64 8 3 0,005 1,47
Bảng 4.11. Hàm lượng Glucosamin có trong dịch ngâm
Nhận xét : Dựa vào bảng kết quả trên ta thấy : trong 8 ngày theo dõi thì hàm
lượng Glucosamin tăng lên trong 4 ngày đầu và tăng nhanh nhất là ở ngày thứ 4 (14,97 µg/ml ). Sau ngày thứ 4 thì hàm lượng Glucosamin bắt đầu giảm dần.
Giải thích : trong 4 ngày đầu thì chủng nấm mốc T.harzianum đã tiết ra enzyme
Chitinase và phân hủy Chitin có trong vỏ cua để tạo ra Glucosamin. Nhưng trong quá trình ngâm có thể sinh khối T.harzianum đã sử dụng Glucosamin như nguồn glucose và acid amin nên hàm lượng Glucosamin giảm dần. Hiện tượng giảm hàm lượng acid lactic và Glucosamin trong quá trình ngâm Cua Đồng trong dịch sinh khối
T.harzianum cần được nghiên cứu thêm.
Đánh giá cảm quan : Thời gian ngâm
( ngày ) Đánh giá cảm quan
1 Cả con còn rất cứng, có vị chua nồng 2 Cả con còn rất cứng, có vị chua nồng
3 Phần mai và càng còn cứng, phần chân và bụng hơi mềm, có vị chua dịu
5 Phần mai và càng còn cứng, phần chân và bụng hơi mềm, có vị chua dịu
6 Phần giữa mai hơi mềm, phần chân và bụng mềm,càng còn cứng, vị chua dịu
7 Phần giữa mai hơi mềm, phần chân và bụng mềm,càng còn cứng, vị chua dịu, mùi thơm
8 Phần giữa mai hơi mềm, phần chân và bụng mềm,càng còn cứng, vị chua dịu, mùi thơm
Bảng 4.12. Đánh giá cảm quan khi ngâm Cua Đồng trong dịch sinh khối
T.harzianum
4.5.4. Chế biến một số món từ Cua Đồng đã biến đổi sinh học4.5.4.1. Cua Đồng xào giấm4.5.4.1. Cua Đồng xào giấm4.5.4.1. Cua Đồng xào giấm 4.5.4.1. Cua Đồng xào giấm
Nguyên liệu
- 1kg Cua Đồng mềm - 1củ hành tây
- ½ củ tỏi, ngò (mùi) , dầu thực vật - 100g củ kiệu chua
- 1 muỗng cafe bột năng - Đường, nước tương, tiêu. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
4.5.4.2. Cua Đồng ngâm giấm
Nguyên liệu
- Cua Đồng mềm: 500g - Riềng: 1000g cắt sợi - Tỏi: 100g cắt lát - Tiêu: 20g xay nhuyễn - Ớt: 50 g cắt lát
- Giấm (chứa 3% acid acetic) : 50 ml - Đường cát: 20g
Hình 4.8. Cua Đồng xào giấm CHƯƠNG 5
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1. Kết luận
Trong quá trình làm thí nghiệm chúng tôi rút ra một số kết luận sau: - Hàm lượng Chitin trong vỏ Cua Đồng chiếm 19,1%
- Chitin 1% là chất cảm ứng tốt để nuôi cấy T. harzianum nhằm tạo được dịch sinh khối T.harzianum có hoạt tính enzyme Chitinase mạnh.
- Thời gian nuối cấy lắc chủng nấm mốc T. harzianum. sp trong môi trường nước chiết giá + 2% đường + 1% chitin để tạo enzyme chitinase có hoạt tính cao nhất là 3 ngày.
- Thời gian làm mềm vỏ Cua Đồng bằng cách ngâm trong acid acetic 15% là 7 ngày.
- Thời gian tách khoáng thích hợp khi ngâm Cua Đồng trong các nồng độ acid lactic khác nhau là 15 ngày.
- Xử lý Cua Đồng bằng phương pháp vi sinh : + Tỷ lệ Cua/dịch sinh khối T.harzianum = 1/3,5
+ Thời gian ngâm từ 4-8 ngày ( sau 4 ngày lượng Glucosamin và acid lactic giảm mạnh, sau 8 ngày lượng Ca vẫn tăng ).
5.2. Kiến nghị
- Hoàn thiện quy trình thu nhận Chitin , cần cải tiến phương pháp lọc để thu hiệu quả cao hơn.
- Có thể mở rộng quy mô làm mềm với các loài giáp xác khác có lớp vỏ cứng hơn như: Ghẹ,…
- Nâng cao hoạt tính enzyme Chitinase để quá trình làm mềm vỏ nhanh hơn. - Hiện tượng giảm hàm lượng acid lactic và Glucosamin trong quá trình ngâm Cua Đồng trong dịch sinh khối T.harzianum cần được nghiên cứu thêm.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt
1. Cao Cường, (2000). Khả năng kháng nấm bệnh và phân giải lân khó tan ở một số chủng Trichoderma, Khóa luận cử nhân Sinh Học, ĐH Khoa Học Tự Nhiên TP.HCM, tr 2-15, 34-35.
2. Đinh Minh Hiệp (2004). Nghiên cứu quy trình tách chiết và ứng dụng nguồn enzyme chitinase từ nấm mật (coprinus fimentarius), báo cáo tổng kết nghiệm thu, sở khoa học và công nghệ TP.HCM, tr 153-160.
3. Nguyễn Khắc Khoái, (2001). Liệu pháp trị bệnh bằng giấm và trứng, NXB phụ nữ.
4. Đỗ Minh Phụng, Đặng Văn Hợp, (1997). Phân tích kiểm nghiệm sản phẩm thủy sản, Đại Học Thủy Sản, tr 218-219.
5. Hồ Thị Ren. (2004), Thử nghiệm xử lý bã đậu nành (okara) bằng nấm mốc thành nguyên liệu thích hợp để chế biến thực phẩm. Khóa luận tốt nghiệp, tr.11.
6. Trần Thị Thuần, Lê Minh Thi, Dương Thị Hồng, (1990-1995). Kết quả nghiên cứu bước đầu về nấm Trichoderma, Tuyển tập các công trình nghiên cứu bảo vệ thực vật, tr 202-210.
7. Nguyễn Thị Trinh – Nghiên cứu chế biến các loại phomai từ sữa bò – Luận văn tốt nghiệp, 2005 – Trang 26-27.
8. Nguyễn Thị Ngọc Tú, Phan Thị Mai, (1998). Nghiên cứu ứng dụng chitosan dùng trong y tế, tạp chí dược học số 3, tr 14-15.
Tài liệu tiếng Anh
10. Elisa Espostio and Manuel da silva, (1998), Systematics and environmental application of the genus Trichoderma crical reviews in Microbiology – 24(2), p 89-98.
11. EC Webb (1992), Enzyme nomenciature academine, p353. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
12. Grange L, et al (1996), Expression of a Trichoderma reesei Beta xylanase gene (XYN2) in sachromyces cerevisia applied ang environment, microbiology, p1036- 1004, 1036-1040.
13. G S Ainsworth & A.S Sussan (1968), The fungi an advance treatise, vol III,
The fungal population acad press Ine, New york, London.
14. P.Jolles and RA.A Muzzarelli, (1997), chitin and chitinase birkhause verlag, basel, Switzerland, p125-133.
15. Reetarani S.Patil, Vandana ghormade, mukund V. Deshpande (1999),
chitinolitic enzymes an exploration.
16. Sahai and Manocha, (1993), Chitinase of fungi and plants their in morphogenesis and host parasite interattion FEMS microbiol rev 11, p 317-338.