Hình 3.4. Quy trình thu nhận Chitin từ mai Cua
3.2.2. Phương pháp xác định hoạt tính enzyme Chitinase [4,8]
Chuẩn bị dịch huyền phù chitin 1%
Vỏ mai cua Loại khoáng, tạp chất Loại protein Tẩy màu Khử màu phụ Chitin
Rửa sạch, sấy khô, xay nhỏ
Ngâm trong dung dịch HCl 15% , tỷ lệ m/v : 1/10, nhiệt độ phòng trong 36 giờ, rửa nước nhiều lần.
Dung dịch NaOH 15%, tỷ lệ m/v: 1/8, nhiệt độ 100 °C trong 1 giờ, rửa nước nhiều lần.
Ngâm trong hỗn hợp dung dịch KMnO4 5%, m/v: 1/6 ở nhiệt độ phòng trong 1 giờ, rửa nước nhiều lần.
Ngâm trong dung dịch acid oxalic 4% , tỷ lệ m/v: 1/5, nhiệt độ phòng, 20 phút, rửa nước nhiều lần.
Sấy khô ở 50 °C , hay để khô tự nhiên , bảo quản nơi khô ráo.
Do Chitin không hòa tan trong nước nên để tiến hành xác định hoạt tính enzyme
Chitinase cần huyền phù hóa Chitin: Lấy 5 g Chitin hòa tan trong 50ml HCl đậm đặc. Khuấy đều trong vòng 3 phút ở 40°C. Sau đó cho nước cất lạnh 5°C từ từ tới 500ml, Chitin sẽ tạo huyền phù màu trắng sữa. Huyền phù sẽ được lọc qua giấy lọc. Rửa nước nhiều lần để pH đạt 4-5, bảo quản huyền phù ở tủ lạnh ( 2-6°C).
Xác định hoạt tính enzyme Chitinase:
Nguyên tắc: hoạt tính enzyme Chitinase được xác định đựa trên phương pháp định lượng Glucosamin trong quá trình phân giải chitin.
Cách tiến hành:
°Đối với dịch enzyme làm đối chứng:
Cho 1ml dịch enzyme vào ống nghiệm đem đun cách thủy ở 100 °C trong 5 phút, sau đó cho thêm 1ml dịch huyền phù chitin 1% vào. Lọc loại bỏ cặn.
° Đối với enzyme làm thí nghiệm:
Hỗn hợp phản ứng gồm: 1ml huyền phù chitin 1% và 1ml dịch enzyme
Chitinase.
Hỗn hợp này được ủ ở 30°C trong vòng 20 phút. Ngừng phản ứng bằng cách đun sôi cách thủy trong 3 phút. Lọc loại bỏ cặn .
Lượng Glucosamin tạo ra được xác định theo phương pháp Elson- Morgan.
Cách tính: Một đơn vị hoạt tính tương ứng với 1µg Glucosamin tạo ra trong thời gian 1 phút thủy phân Chitin ở nhiệt độ phản ứng .
Tổng hoạt tính (đvht) =
t V n a. .
Hoạt tính chung (đvht/g.CP.E ) = vtm v n a . . ' . . Trong đó:
a: hàm lượng Glucosamin (µg /ml) trong dịch thí nghiệm đã pha loãng n: hệ số pha loãng
V: thể tích dịch môi trường nuối cấy (ml) v’: thể tích dịch enzyme ban đầu (ml) v : thể tích enzyme thí nghiệm (ml) t : thời gian phản ứng ( phút) m : khối lượng enzyme (g)
vòng phân giải
Nguyên tắc:
Khi cho Chitinase tác dụng lên cơ chất (Chitin, Chitosan, vỏ mai Cua ) trong môi trường thạch, cơ chất bị phân giải cho ra các đường amin. Các đường này không cho phản ứng màu với thuốc thử Lugol. Vì thế, có thể định tính hoạt độ hệ enzyme
Chitinase dựa vào đường kính vòng phân giải. Tiến hành:
- Chuẩn bị môi trường nuối cấy
Đổ vào mỗi erlen 20ml môi trường khoáng .
Đậy kín erlen bằng các nút bông không thấm nước, hấp khử trùng ở 121°C trong 15 phút. Để nguội đến 50-55 °C.
- Nuôi cấy :
Chuẩn bị các đĩa erlen vô trùng, kích thước bằng nhau. Đổ 20ml môi trường trên từ erlen vào mỗi đĩa Petri đã vô trùng. Để nguội.
Cấy chủng nấm mốc T.harzianum vào giữa đĩa Petri. Ủ ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ.
- Nhuộm màu
Sau 2 ngày nuối cấy, lấy 10ml thuốc thử Lugol cho vào mỗi đĩa, để yên 5-10 phút, đo đường kính vòng phân giải để xác định tỷ lệ Chitin tối ưu.
3.2.4. Phương pháp định lượng Glucosamin ( phương pháp Elson-Morgan )
Nguyên tắc
Phương pháp này dựa trên sự hình thành các dẫn xuất pyrrole khi Glucosamin được đun nóng trong thuốc thử acetyl acetone. Những pyrrole này sẽ cho phản ứng màu khi tác dụng với thuốc thử Erlich .
Phương pháp này chỉ xảy ra khi đun nóng thuốc thử, Elson và Morgan sử dụng phản ứng này trong phương pháp so màu để xác định hàm lượng Glucosamin. Đường amin hydrochlorid được đun nóng với acetyl aceton trong dung dịch kiềm khoảng 1giờ trước khi thêm thuốc thử Erlich, những lượng tương đương Glucosamin cho ra những cường độ màu tương đương ở cùng điều kiện.
Thuốc thử Erlich : 0,8 g p-dimethylaminobenzaldehyde (DMAB) pha trong 30 ml dung dịch HCl đậm đặc .
Thuốc thử acetyl aceton : pha 2,5 ml acetyl aceton trong 50ml dung dịch đệm carbonate Na2CO3/NaHCO3 0,2M , pH = 9,6
Dựng đường chuẩn Glucosamin
Cân chính xác 0,1g D-glucosamin, cho nước cất vào đủ 500ml. Từ dung dịch này, pha các dung dịch Glucosamin chuẩn có nồng độ từ 10-70 µg /ml.
Nồng độ Glucosamin (µg/ml) 0 10 20 30 40 50 60 70
Thể tích dungdịch Glucosamin(ml) 0 5 10 15 20 25 30 35 Thể tích nước cất (ml) 100 95 90 85 80 75 70 65 Dựng đường chuẩn biểu diễn sự tương quan giữa nồng độ Glucosamin và giá trị OD
Thí nghiệm
Chọn các ống nghiệm có cùng kích cỡ, cùng độ dày .
Cho vào ống nghiệm 1ml dịch thí nghiệm, 1ml thuốc thử aceton.
Lắc đều, đun cách thủy ở 100 °C trong 1giờ, sau đó làm mát đưới dòng nước. Thêm 1ml thuốc thử Erlich, lắc đều, đun cách thủy ở 70 °C trong 15 phút .
Để ống nghiệm nguội, cường độ màu đỏ xuất hiện trong ống được đo ở bước sóng 512nm.
3.2.5. Phương pháp định lượng Calci [ 17 ]
Nguyên tắc
Khi EDTA được cho vào nước chứa Ca và Mg, nó sẽ kết hợp đầu tiên với Ca. Ca được xác định trực tiếp bằng EDTA, khi pH tạo thành đủ cao thì Mg sẽ kết tủa tạo thành hydroxit và chất chỉ thị chỉ kết hợp duy nhất với Ca. Một vài loại chỉ thị cho màu biến đổi khi toàn bộ Ca chuyển thành phức khi kết hợp với EDTA ở pH = 12-13.
Chất phản ứng
+ NaOH 1N + Murexide
+ EDTA 0,01M : cân 3,723g EDTA, hòa tan trong nước cất và pha loãng đến 1000ml.
Quy trình
- Chuẩn bị mẫu : vì sử dụng pH cao nên thêm kiềm và chất chỉ thị vào trong mẫu và chuẩn độ ngay. Sử dụng 50ml mẫu, hoặc pha loãng một phần thể tích nhỏ hơn tới 50ml để hàm lượng Ca trong khoảng 5-10mg. Phân tích độ cứng của nước với kiềm cao hơn 300mg CaCO3/L bằng cách lấy một lượng mẫu nhỏ hơn 50ml đem pha loãng thành 50ml, hoặc bằng cách trung hòa kiềm bằng acid, đun sôi trong 1 phút và làm lạnh trước khi bắt đầu chuẩn độ.
Chuẩn độ
+ Thêm 2ml NaOH hoặc một thể tích vừa đủ để tạo thành pH = 12-13. + Lắc đều
+ Thêm 0,1- 0,2g murexide là chất chỉ thị được chọn ( hoặc 1-2 giọt nếu là dung dịch)
+ Thêm từ từ EDTA và lắc đều cho đến điểm dừng thích hợp.
Dùng murexide để kiểm tra điểm kết thúc bằng cách thêm chỉ 1-2 giọt để bảo đảm màu không biến đổi.
Tính toán kết quả
mg Ca/L = AmLmâu×B×400,8 Trong đó :
A : ml chất chuẩn độ mẫu
B : tương đương với 1,00ml EDTA chuẩn độ Ca tại điểm kết thúc
3.2.6. Phương pháp định lượng acid lactic [ 7 ] a) Nguyên tắc
Định lượng axit lactic bằng cách xác định độ Therner.
Độ Therner là số ml dung dịch NaOH 0,1N dùng để chuẩn độ 100ml mẫu.
b) Cách tiến hành
Lấy 10ml dung dịch lên men, thêm 20ml nước cất, thêm 1-2 giọt phenolphtalein 1%. Sau đó chuẩn độ bằng NaOH 0,1N cho đến khi thấy xuất hiện màu hồng và không đổi màu sau 1 phút.
c) Cách tính kết quả
Độ Therner = VNaOH . 10 10 Therner = 9mg acid lactic
KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 4.1. Thu nhận Chitin từ mai Cua
Khối lượng mai Cua ban đầu là 100 g, xay nhỏ và tiến hành thu nhận Chitin theo các bước ở 3.2.1. Sau khi cân khối lượng Chitin ta xác định được phần trăm Chitin có trong mai Cua.
Bảng 4.1. Khối lượng Chitin thu được từ mai Cua
Số lần thí nghiệm Khối lượng Chitin thu được (g)
1 18,4
2 19,6
3 19,4
Trung bình 19,1
Hình 4.2. Hiệu suất thu nhận Chitin
Nhận xét :
Khối lượng Chitin thu được là 19,1 /100 g mai Cua, tỷ lệ này thấp hơn thực tế ( 20-50%), là do :
- Kỹ thuật tách chiết còn hạn chế : sự mất mát trong quá trình lọc, rửa,… - Nguyên liệu còn lẫn tạp chất,…
Chitin trong mai Cua là 19,1 %, nghĩa là khoảng 80,9 % thành phần còn lại trong mai Cua chủ yếu là khoáng và protein.
4.2. Xác định tỷ lệ Chitin tối ưu để nuôi cấy T.harzianum
Nuôi T.harzianum trong môi trường thạch Czapeck – Dox ( không Cacbon ) có bổ sung 0.5% ; 1% ; 2% ; 3% ; 4% chitin.
Sau thời gian 2 ngày nuôi cấy, cho 10 ml thuốc thử Lugol vào, để trong tối từ 5 - 10 phút, ta thu được kết quả như sau :
Tỷ lệ chitin (%) Đường kính vòng phân giải ( cm )
0,5 2,5
1 3,5
4 3,2
Bảng 4.2. Đường kính vòng tròn phân giải
Hình 4.3. Đường tròn phân giải Chitin 1%
Nhận xét :
Qua bảng trên ta nhận thấy rằng : đường kính vòng tròn phân giải ở tỷ lệ Chitin 1% ( 3,5 cm )lớn hơn so với đường kính vòng tròn phân giải của các tỷ lệ Chitin khác.
Như vậy khả năng sinh enzym Chitinase của T.harzianum ở tỷ lệ Chitin 1% là tốt nhất. Vì vậy ta chọn tỷ lệ Chitin 1% để nuôi cấy T.harzianum.
4.3. Nuôi lắc T.harzianum trong môi trường dịch thể để thu nhận sinh khối
T.harzianum có hoạt tính enzyme Chitinase mạnh nhất
Tiến hành nuôi cấy T.harzianum trong môi trường nước chiết giá có bổ sung 2% đường kính và 1% huyền phù Chitin . Sau đó đem nuôi lắc trong 7 ngày, ta thu được kết quả :
Hệ số pha loãng : n = 10
Thời gian nuôi cấy
OD Hàm lượng
Glucosamin
Tổng hoạt tính (đvht)
1 0,026 7,63 114,45 2 0,032 9,4 141 3 0,049 14,39 215,85 4 0,033 9,69 145,35 5 0,028 8,22 123,3 6 0,014 4,11 61,65 7 0,012 3,52 52,8
Bảng 4.3. Hoạt tính của enzyme Chitinase theo thời gian nuôi cấy
Nhận xét :
Từ kết quả trên ta nhận thấy rằng : khi nuôi lắc T.harzianum trong môi trường nước chiết giá có bổ sung 2% đường và 1% chitin thì hoạt tính của enzyme Chitinase
cao nhất ở ngày nuôi cấy thứ 3, vì lúc này hàm lượng Glucosamin được tạo ra là nhiều nhất ( 14,39µg/ml ). Sau ngày thứ 3 thì hoạt tính của enzyme Chitinase bắt đầu giảm.
Điều này có thể được giải thích như sau: trong quá trình tăng sinh khối, ở giai đoạn đầu, tế bào vi nấm tổng hợp các hệ enzyme Chitinase nhằm phân giải cơ chất Chitin có trong môi trường nuối cấy, tạo thành các hợp chất đơn giản và nhờ đó tăng cường quá trình trao đổi chất giữa tế bào với môi trường. Sau thời điểm hệ enzyme
Chitinase hoạt động ở mức cao nhất, hoạt tính enzyme có xu hướng giảm do trong quá trình thủy phân tạo ra nhiều sản phẩm trung gian hay sản phẩm cuối (Glucosamin) có thể gây ức chế quá trình sinh tổng hợp enzyme Chitinase hoặc gây kiềm chế dị hoá với các phân tử enzyme.
4.4. Định lượng Calci bằng phương pháp hóa học4.4.1. Khi ngâm Cua Đồng trong acid acêtic 15%4.4.1. Khi ngâm Cua Đồng trong acid acêtic 15% 4.4.1. Khi ngâm Cua Đồng trong acid acêtic 15%
Thực hiện ngâm Cua ở các nồng độ acid acetic khác nhau, ta thấy ở nồng độ acid acetic 15% là thích hợp nhất.
a) Hàm lượng Calci có trong dịch ngâm Số ngày ngâm ( ngày ) Vmẫu ( ml) VNaOH 1N ( ml ) V EDTA 0,1M ( ml ) % Ca ( %) 1 2 8 2,7 5,86 2 2 8 3,6 10,41 3 2 8 4,8 18,51 4 2 8 5,5 24,3 5 2 8 6,2 30,88 6 2 8 7 39,36 7 2 8 7 39,36
Bảng 4.4. Hàm lượng Calci có trong dịch ngâm acid acetic 15%
Hình 4.4. Hàm lượng Calcium có trong dịch ngâm acid acetic 15%
Nhận xét
Hàm lượng Ca2+ tăng nhanh trong 6 ngày đầu, sau ngày thứ 6 thì hàm lượng Ca2+ không tăng nữa.
Nguyên nhân là do lúc đầu nồng độ [H+] còn cao, khi tiếp xúc với cua đồng, phản ứng giữa Calcicacbonate và acid acetic diễn ra mạnh mẽ, Calci tan vào dịch nhiều. Sau đó, khi nồng độ [H+] giảm, không còn khả năng hoà tan lượng Calcicacnonat còn lại
Hình 4.5. Cua Đồng ngâm trong acid acetic 15% b) Sự biến thiên pH
Thời gian ngâm ( ngày ) pH
0 2,36 1 4,13 2 4,37 3 4,45 4 4,48 5 4,50 6 4,51
Bảng 4.5. Sự biến thiên pH khi ngâm cua trong acid acetic 15%
pH dịch ngâm Cua Đồng tăng nhanh trong ba ngày đầu, những ngày sau tăng chậm. Đến ngày thứ 7 và thứ 8 thì pH không tăng nữa. Điều này chứng tỏ rằng trong 3 ngày đầu, [H+] cao nên đã hòa tan Calci trong Cua Đồng khá nhiều, sau 3 ngày thì [H+] giảm, khả năng rút Calci ra ngoài là rất ít.
c) Đánh giá cảm quan Thời gian ngâm
( ngày) Đánh giá cảm quan
1 Cả con còn rất cứng 2 Cả con còn rất cứng
3 Phần mai và càng còn cứng, phần chân và bụng hơi mềm 4 Phần mai và càng còn cứng, phần chân và bụng hơi mềm 5 Phần giữa mai hơi mềm, phần chân và bụng mềm,càng
còn cứng
6 Phần giữa mai và càng hơi mềm, phần chân và bụng mềm
7 Cả con mềm hết
Bảng 4.6. Đánh giá cảm quan khi ngâm cua trong acid acetic 15%
Nhận xét
Qua bảng trên ta thấy : sau 7 ngày ngâm cua trong nồng độ acid acetic 15% thì độ mềm của cua biến đổi dần dần, đến ngày thứ 7 thì hầu hết cả con cua đã mềm và có mùi vị chua dịu.
4.4.2. Khi ngâm Cua Đồng trong acid lactic với các nồng độ khác nhau
Tiến hành thí nghiệm với các nồng độ acid lactic khác nhau : 10% , 15% , 20% , 25% , 30% , 35% , 40%.
Trong 15 ngày theo dõi , ta thu được kết quả như sau : Hàm lượng Calci ở các nồng độ khác nhau
Số ngày ngâm ( ngày ) Vmẫu ( ml) V EDTA 0,1M ( ml ) 10% 15% 20% 25% 30% 35% 40% 1 2 0,8 1,2 1,6 1,9 2,0 2,1 2,2 2 2 1,6 2,6 2,7 2,4 2,8 2,9 2,6 3 2 2,7 3,3 3,5 3,2 3,4 4 4,3 4 2 3,0 3,8 4,0 3,6 4,2 4,6 4,8 5 2 3,4 4,1 4,2 4,4 4,8 5,0 5,2 6 2 3,6 4,5 4,6 4,9 5,3 5,5 5,7 7 2 3,7 4,8 4,7 5,2 5,5 5,7 6 8 2 3,8 5 4,9 5,6 6,2 6,1 6,2 9 2 4 5,2 5,1 5,7 6,3 6,2 6,3 10 2 4,6 5,6 5,2 5,8 6,5 6,3 6,3 11 2 4,8 5,8 5,4 5,9 6,6 6,3 6,3 12 2 5,0 5,9 5,5 6,1 6,6 6,3 6,3 13 2 5,2 6 5,6 6,2 6,6 6,3 6,3 14 2 6 6,2 5,7 6,2 6,6 6,3 6,3 15 2 6 6,2 5,7 6,2 6,6 6,3 6,3
Bảng 4.7. Thể tích EDTA 0,1M theo các nồng độ acid lactic
Số ngày ngâm ( ngày ) %Ca 10% 15% 20% 25% 30% 35% 40% 1 0,5 1,2 2,1 2,9 3,2 3,5 3,9 2 2,1 5,4 5,9 4,6 6,3 6,8 5,4 3 5,9 8,8 9,8 8,2 9,3 12,8 14,8 4 7,2 11,6 12,8 10,4 14,2 17 18,5 5 9,3 13,5 14,2 15,6 18,5 20,1 21,7 6 10,4 16,3 17 19,3 22,6 24,3 26,1 7 11,0 18,5 19,3 21,7 24,3 26,1 28,9 8 11,6 20,1 20,9 25,2 30,9 29,9 31,4 9 12,9 21,7 21,7 26,1 31,9 30,9 31,9 10 17,0 25,2 23,4 27,0 35 31,9 31,9 11 18,5 27,0 24,3 28,0 35 31,9 31,9 12 20,08 27,9 25,2 29,9 35 31,9 31,9 13 21,72 28,9 26,1 30,9 35 31,9 31,9 14 28,92 30,9 26,1 30,9 35 31,9 31,9
Bảng 4.8. Hàm lượng Calci ở các nồng độ acid lactic khác nhau
Nhận xét:
Trong 15 ngày theo dõi ta nhận thấy :
+ Hàm lượng Calci càng ngày càng tăng lên. Ở các nồng độ acid lactic thấp như 10%, 15%, 20% thì lượng Calci được tách ra ít hơn so với các nồng độ cao 25%, 30%, 35%, 40%.
+ Ở tất cả các nồng độ, đến ngày thứ 14 và 15 thì lượng Calci không tăng lên nữa. Nhưng riêng ở các nồng độ 30%, 35%, 40% thì lượng Ca được tách ra rất nhiều và không tăng lên sau ngày thứ 10. Nguyên nhân này là do ở nồng độ acid cao thì nồng độ [H+] cao nên Calci tan vào dịch nhiều. Sau nhiều ngày ngâm thì nồng độ [H+] giảm, không còn khả năng hòa tan lượng Calcicacbonat còn lại trong Cua nữa thì lượng Calci gần như không hòa tan vào dịch ngâm nữa.
4.5. Xử lý Cua Đồng bằng phương pháp vi sinhQuy trình :Quy trình :Quy trình : Quy trình :
Bằng dịch và sinh khối T.harzianum nuôi trong môi trường nước chiết giá có bổ sung 2% đường và 1% huyền phù chitin, kết hợp với lên men lactic, ta có quy trình như