A. Ly trích DNA của vi khuẩn
Nuôi vi khuẩn trong 3ml môi trường LB lỏng và lắc ủ qua đêm.
Chuyển 2 ml dung dịch vi khuẩn vào tube eppendoft 2,2 ml, ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút để phá vỡ màng tế bào, giải phóng DNA vào môi trường và tủa vi khuẩn.
Loại bỏ phần dung dịch trong có trong tube, giữ lại phần cặn.
Cho 250µl dung dịch TE pH8 vào phần cặn của tube, và đánh tan sinh khối. Thêm 50µl dung dịch 10% SDS. Bổ sung thêm 5µl proteinase K (20 mg/ml) và ủ
bằng water-bath trong 20 phút ở 65oC, cứ mỗi 5 phút đảo ngược tube 1 lần.
Thêm 400µl 10% CTAB/0,7M NaCl, trộn đều và ủ tiếp ở 65oC trong 20 phút.
Bổ sung 600µl chloroform: isoamyl alcohol (24/1) (thực hiện trong tủ hút) vào tube và trộn đều, ly tâm ở 12000 vòng/phút trong 10 phút.
Chuyển 500µl phần trong DNA phía trên vào tube mới, thêm 500µl isopropanol
vào tube và lắc đều, giữ ở -20oC ít nhất 30 phút.
Rửa với 500µl ethanol 70%, ly tâm ở 12000 vòng/phút trong 5 phút, lặp lại 2 lần.
Sấy DNA trong máy ly tâm chân không ở 45oC trong 15 phút để loại bỏ ethanol.
Hòa tan trong 30µl nước cất hai lần để trữ DNA.
B. Nhận diện các dòng vi khuẩn nội sinh bằng kỹ thuật PCR
- Pha mix trong tube 1,5 ml.
Bảng 4. Thành phần một phản ứng PCR Thành phần một phản ứng Nồng độ sau cùng Thể tích (μl) Bi H2O 13,25 Buffer (+K) 3 mM 2 MgCl2 3 mM 2 dNTP 1,6 mM 4 Primer p515FPL 10 pM 1 Primer p13B 10 pM 1 DMSO 0,05 µg 0,5 Taq 1,25 u 0,25 DNA vi khuẩn 50 ng 1
- Chu kỳ gia nhiệt khi thực hiện
Phản ứng PCR được thực hiện trong chu kỳ nhiệt. Máy gia nhiệt là máy đun nóng và làm nguội trong ống phản ứng ở nhiệt độ chính xác cho mỗi phản ứng. Để ngăn ngừa sự bay hơi của hỗn hợp phản ứng, phần nắp đậy của máy PCR cũng được đun nóng, trường hợp lượng dung dịch phản ứng quá ít, người ta cho một lớp dầu (natural oil) lên trên bề mặt hỗn hợp phản ứng.
Quy trình PCR gồm 35 chu kỳ. Mỗi chu kỳ gồm 3 bước: (1 iai đoạn tách: nhiệt độ tăng lên 4°C, thời gian: 45 giây. (2 iai đoạn gắn mồi: 55°C, thời gian: 45 giây.
(3 iai đoạn tổng hợp: 72°C, thời gian: 1 phút.
Primer 16S rRNA (Zinniel et al., 2002) dùng để nhận dạng vi khuẩn nội sinh có trình tự sau:
p515FPL 5’ -GTGCCAGCAGCCGCGGTAA- 3’
Hình 8. Chu trình PCR 16S rRNA
Sau đó, sản phẩm PCR được giữ ở 4°C. - Kiểm tra sản phẩm PCR trên gel agarose
Sau khi phản ứng PCR được thực hiện, sản phẩm PCR được điện di bằng gel agarose 1% có bổ sung ethidium bromide (EtBr).
Quy trình điện di như sau: - Chuẩn bị gel
hay điện di được đặt s n lược có số răng là 1 ở một đầu khay và được đặt ở nơi bằng ph ng.
Gel sử dụng chạy điện di: 40ml với nồng độ 1% agrarose.
Cân 0,40g agrarose cho vào chai thủy tinh có chứa 40ml bufer TBE 1X. Lắc chai cho agrarose hòa tan vào buffer TBE 1X.
Nung hỗn hợp trong microwave ở mức medium trong 5 phút cho agarose tan hoàn toàn. Để nguội (có thể cầm bằng tay được , sau đó thêm 0, µl ethidium bromide vào, lắc đều và đổ nhẹ dung dịch vào một đầu khay. Dung dịch sẽ tự trải đều khay. Sau khoảng 45 phút gel đặc lại có thể sử dụng được.
Đặt khay vào bể điện di, thêm dung dịch điện di (bufer TBE 1X) phủ mặt gel khoảng 2 mm.
Sau khi gel chuẩn bị xong, ta tiến hành load mẫu vào các giếng của gel. - Load mẫu:
Dùng micropipette hút dung dịch loading buffer và nhỏ thành từng giọt nhỏ khoảng 2µl ra giấy parafilm. Trộn đều 10µl dung dịch mẫu với dung dịch loading buffer rồi nhỏ hổn hợp vào giếng của gel. Tiến hành chạy điện di trên gel ở hiệu điện thế 95 volt trong 45 phút.
- Quan sát và chụp hình:
Bản gel được quan sát dưới ánh sáng tử ngoại trên hệ thống máy đọc gel và chụp hình gel Bio-Rad UV 2000 (Hoa Kỳ).
C. Giải trình tự DNA để nhận diện các dòng vi khuẩn nội sinh
Sử dụng sản phẩm PCR để giải trình tự bằng máy giải trình tự tự động ABI3130 thông qua công ty MACROGEN, Hàn Quốc. Sử dụng chương trình LAST N (Nucleotide asic Local Alignment Search Tool để so sánh trình tự đoạn gen 16S rRNA của các dòng vi khuẩn với trình tự gen 16S rRNA của các loài vi khuẩn có trong ngân hàng dữ liệu của NCBI (National Center for Biotechnology Information) và vẽ cây phả hệ bằng phần mềm MEGA 5.1.
CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Kết quả ph n lập
Sau các giai đoạn phân lập và tách ròng vi khuẩn trên hai môi trường Nfb và RMR, thu được 20 dòng vi khuẩn từ cây lúa nương trồng ở huyện Tuy An, tỉnh Phú Yên. Trong đó 10 dòng (AN1-AN10) phân lập trên môi trường Nfb và 10 dòng (AN11-AN20) phân lập trên môi trường RMR.
Trong 20 dòng vi khuẩn phân lập được, có 6 dòng vi khuẩn phân lập từ thân, chiếm 30 và 14 dòng phân lập từ rễ , chiếm 0
Bảng 5. Nguồn gốc các dòng vi khuẩn phân lập được trên môi trường Nfb và RMR
STT Dòng vi khuẩn Giống lú Vị trí ph n lập Đị điểm thu mẫu
1 AN1 Tàu cúc Thân Xã An Hòa
2 AN2 Tàu cúc Rễ Xã An Hòa
3 AN3 Tàu cúc Thân Xã An Hòa
4 AN4 Tàu cúc Thân Xã An Hiệp
5 AN5 Tàu cúc Thân Xã An Hiệp
6 AN6 Tàu cúc Rễ Xã An Hòa
7 AN7 Tàu cúc Rễ Xã An Hòa
8 AN8 Tàu cúc Rễ Xã An Hiệp
9 AN9 Tàu cúc Rễ Xã An Hòa
10 AN10 Tàu cúc Rễ Xã An Hiệp
11 AN11 Tàu cúc Thân Xã An Hiệp
12 AN12 Tàu cúc Rễ Xã An Hiệp
13 AN13 Tàu cúc Rễ Xã An Hòa
14 AN14 Tàu cúc Rễ Xã An Hiệp
15 AN15 Tàu cúc Rễ Xã An Hòa
16 AN16 Tàu cúc Rễ Xã An Hòa
17 AN17 Tàu cúc Thân Xã An Hiệp
18 AN18 Tàu cúc Rễ Xã An Hòa
19 AN19 Tàu cúc Rễ Xã An Hiệp
20 AN20 Tàu cúc Rễ Xã An Hiệp
Các dòng vi khuẩn có khả năng phát triển trong môi trường bán đặc, tạo thành màng mỏng (pellicle) sau 2-4 ngày.
Hình 9. Vi khuẩn sau 36 giờ nuôi cấy trên môi trường bán đặc Nfb (trái) và RMR (phải) tạo màng mỏng trên bề mặt môi trường
4.2. Đặc điểm khuẩn lạc của vi khuẩn
Hình 10. Khuẩn lạc của vi khuẩn nội sinh cấy trên môi trường Nfb và RMR
Trong 20 dòng vi khuẩn, có 12 dòng có khuẩn lạc màu trắng đục, chiếm 60%, 40% còn lại có khuẩn lạc màu trắng trong (8 dòng).
Chỉ có hai dòng vi khuẩn có dạng không đều, độ nổi lài và bìa cưa là AN1 và AN18, 18 dòng vi khuẩn còn lại có dạng tròn, độ nổi mô và bìa nguyên, chiếm 90%. Đường kính của 20 dòng khuẩn lạc dao động từ 1,0-2,5 mm sau khi cấy trên môi trường đặc và ủ trong tủ ủ 24h.
Bảng 6. Đặc điểm khuẩn lạc của vi khuẩn phân lập được trên môi trường Nfb và RMR
STT Dòng vi khuẩn khuẩn lạc Màu sắc khuẩn lạc Dạng khuẩn lạc Độ nổi khuẩn lạc Dạng bì Đường kính (mm)
1 AN1 Trắng đục Tròn Mô Nguyên 1,5
2 AN2 Trắng đục Tròn Mô Nguyên 1,5
3 AN3 Trắng đục Tròn Mô Nguyên 1
4 AN4 Trắng trong Tròn Mô Nguyên 2
6 AN6 Trắng trong Tròn Mô Nguyên 2
7 AN7 Trắng trong Tròn Mô Nguyên 2
8 AN8 Trắng đục Tròn Mô Nguyên 1
9 AN9 Trắng đục Tròn Mô Nguyên 1,5
10 AN10 Trắng đục Tròn Mô Nguyên 1,5
11 AN11 Trắng trong Tròn Mô Nguyên 1,5
12 AN12 Trắng đục Tròn Mô Nguyên 1,5
13 AN13 Trắng trong Tròn Mô Nguyên 2
14 AN14 Trắng trong Tròn Mô Nguyên 2
15 AN15 Trắng trong Tròn Mô Nguyên 2,5
16 AN16 Trắng đục hông đều Lài ìa cưa 2,5
17 AN17 Trắng đục Tròn Mô Nguyên 2
18 AN18 Trắng đục hông đều Lài ìa cưa 2,5
19 AN19 Trắng đục Tròn Mô Nguyên 1,5
20 AN20 Trắng đục Tròn Mô Nguyên 1,5
4.3. Đặc điểm củ tế bào vi khuẩn
Hình thái và sự chuyển động của vi khuẩn được kiểm tra bằng phương pháp giọt ép, dưới kính hiển vi quang học với độ phóng đại 400 lần.
Tất cả vi khuẩn phân lập được đều có dạng hình que ngắn phù hợp với kết quả của Nguyễn Ái Chi (2009) và Phan Thị Nhã (2009). Hai mươi dòng vi khuẩn này đều có khả năng di chuyển chậm trong môi trường lỏng. Khi nhuộm Gram, tất cả 20 dòng vi khuẩn đều có màu đỏ của thuốc nhuộm fuchsin chứng tỏ chúng là vi khuẩn Gram âm.
Bảng 7. Đặc điểm tế bào của 20 dòng vi khuẩn đã ph n lập được
STT Dòng vi khuẩn Gram Chuyển động Hình dạng vi khuẩn
1 AN1 - + Que ngắn 2 AN2 - + Que ngắn 3 AN3 - + Que ngắn 4 AN4 - + Que ngắn 5 AN5 - + Que ngắn 6 AN6 - + Que ngắn 7 AN7 - + Que ngắn 8 AN8 - + Que ngắn
9 AN9 - + Que ngắn 10 AN10 - + Que ngắn 11 AN11 - + Que ngắn 12 AN12 - + Que ngắn 13 AN13 - + Que ngắn 14 AN14 - + Que ngắn 15 AN15 - + Que ngắn 16 AN16 - + Que ngắn 17 AN17 - + Que ngắn 18 AN18 - + Que ngắn 19 AN19 - + Que ngắn 20 AN20 - + Que ngắn 4.4. Khả năng cố định đạm
Cấy 20 dòng vi khuẩn trên môi trường urk’s không đạm đặc và ủ ở 30oC, theo
dõi sự phát triển trong 1-2 ngày.
Cả 20 dòng vi khuẩn được cấy trên môi trường urk’s không đạm đặc đều phát triển được ngay sau 1 ngày ủ. Như vậy có 20/20 dòng vi khuẩn phát triển được trên môi trường không đạm. Trong đó dòng AN6 và AN15 là phát triển mạnh nhất.
Qua kiểm tra, tất cả 20 dòng vi khuẩn đều có khả năng hình thành NH4+. Kết quả
thống kê của các dòng vi khuẩn được phân lập từ hai môi trường Nfb và RMR cụ thể như sau:
Trong số 10 dòng vi khuẩn cố định đạm được phân lập trên môi trường Nfb thì
dòng AN6 cho hàm lượng NH4+ cao nhất (4,23 mg/l , đối với 10 dòng vi khuẩn được
phân lập trên môi trường RMR thì dòng AN15 có hàm lượng NH4+ được tạo ra cao
nhất (5,39 mg/l).
Các dòng vi khuẩn được phân lập từ môi trường Nfb: khả năng cố định đạm của các dòng vi khuẩn này là tương đối cao và các dòng này khác biệt nhau có nghĩa thống kê ở mức 1% trừ hai dòng là AN6 và AN9 không khác biệt nhau về nghĩa thống kê.
Theo kết quả nhận được 7 dòng vi khuẩn có khả năng cố định đạm cao nhất vào ngày 4 là AN1, AN3, AN6 AN7, AN8, AN9 và AN10 với tổng hàm lượng đạm trung
bình là 4,53 mg/l, riêng ba dòng AN2, AN4, AN5 cố định đạm cao nhất vào ngày 6 (hàm lượng đạm trung bình 4,63 mg/l) và đều giảm ở ngày 8.
Trong đó dòng AN6 và dòng AN9 tổng hợp NH4+ trung bình cao nhất (lần lượt là
4,23 và 4,20 mg/l) và có khác biệt thống kê so với các dòng còn lại, sau bốn ngày nuôi dòng AN9 cố định được 6,47 mg/l. Kế đến là dòng AN6 cố định được 6,14 mg/l. Dòng AN10 có khả năng cố định đạm thấp nhất chỉ tổng hợp được 1,47 mg/l (Hình 11).
Hình 11. Khả năng tổng hợp NH4+ (mg/l) trung bình của 10 dòng vi khuẩn được phân lập từ môi trường Nfb
Hình 12. Khả năng tổng hợp NH4+ (mg/l) của 10 dòng vi khuẩn được phân lập từ môi trường Nfb theo thời gian
Các dòng vi khuẩn được phân lập từ môi trường RMR: hầu hết các dòng vi
LSD0.01 = 0,040 CV (%) = 1,44
dòng vi khuẩn được phân lập từ môi trường Nfb. Phần lớn các dòng vi khuẩn đều có khả năng cố định đạm cao nhất vào ngày hai (trung bình 4,76 mg/l) và giảm dần vào các ngày kế.
Trong số 10 dòng khảo sát thì dòng AN15 có khả năng cố định đạm cao nhất 7,24 mg/l và đạt đỉnh vào ngày thứ 4 sau đó giảm dần theo thời gian, và khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 1% so với các dòng còn lại. Ngược lại dòng AN11 có khả năng cố định đạm trung bình thấp nhất 1,34 mg/l (Hình 13).
Hình 13. Khả năng tổng hợp NH4+ (mg/l) trung bình của 10 dòng vi khuẩn được phân lập từ môi trường RMR
Hình 14. Khả năng tổng hợp NH4+ (mg/l) của 10 dòng vi khuẩn được phân lập từ môi trường RMR theo thời gian
Kết quả cho thấy 10/20 dòng vi khuẩn có khả năng cố định đạm tốt, cao hơn lượng đạm trung bình của tất cả các dòng vi khuẩn là 3,13 mg/l. Trong đó có 3 dòng vi khuẩn
LSD0.01 = 0,040 CV (%) = 1,16
được phân lập từ môi trường Nfb (AN6, AN9, AN1) và 7 dòng vi khuẩn được phân lập từ môi trường RMR (AN15, AN17, AN19, AN18, AN20, AN12, AN16).
4.5. Khả năng hò t n l n khó t n
Qua kiểm tra, tất cả 20 dòng vi khuẩn đều có khả năng hòa tan lân khó tan. Kết quả thống kê của các dòng vi khuẩn được phân lập từ hai môi trường Nfb và RMR cụ thể như sau:
Nhìn chung hàm lượng lân hòa tan tăng dần và đạt đỉnh vào ngày 10 và giảm đều vào các ngày kế tiếp. Trong số 10 dòng vi khuẩn được phân lập trên môi trường Nfb
thì dòng AN6 hòa tan lân nhiều nhất (224,86 mg P2O5/l) vào ngày đo thứ 10. Đối với
10 dòng vi khuẩn được phân lập trên môi trường RMR thì dòng AN15 có hàm lượng lân dễ tiêu được tạo ra cao nhất (270,37 mg/l).
Môi trường Nfb: Ngoại trừ dòng vi khuẩn AN6 có thể hòa tan lân nhiều nhất thì các dòng AN , AN5 và AN cũng được ghi nhận với giá trị khá cao và các dòng này đều khác biệt nhau có nghĩa thống kê (Hình 15). Mười dòng vi khuẩn được khảo sát
đều có khả năng hòa tan lân cao nhất vào ngày 10 (tổng hàm lượng P2O5 trung bình:
84,47 mg/l). Dòng AN3, AN4 và AN8 có khả năng hòa tan lân thấp chỉ tổng hợp được
Hình 15. Khả năng hò t n l n khó t n (mg P2O5/l) trung bình của 10 dòng vi khuẩn được phân lập từ môi trường Nfb
Hình 16. Khả năng hò t n l n khó t n (mg P2O5/l) của 10 dòng vi khuẩn được phân lập từ môi trường Nfb theo thời gian
Môi trường RMR: Trong số 10 dòng khảo sát thì dòng AN15 có khả năng hòa tan lân cao nhất. Hầu hết các dòng vi khuẩn còn lại hòa tan ít lân hơn nhiều (thấp hơn một nữa) so với dòng AN15.
Trong số 10 dòng vi khuẩn được phân lập trên môi trường RMR thì dòng AN12 có khả năng hòa tan lân thấp nhất 15,76 mg/l và không có dao động lớn trong suốt thời gian thí nghiệm. Dòng AN11, AN14 và AN19 không có khác biệt về nghĩa thống kê. (Hình 17 và hình 18).
LSD0.01 = 0,319 CV (%) = 0,38
Hình 17. Khả năng hò t n l n khó t n (mg P2O5/l) trung bình của 10 dòng vi khuẩn được phân lập từ môi trường RMR
Hình 18. Khả năng hòa tan lân (mg P2O5/l) của 10 dòng vi khuẩn được phân lập từ môi trường RMR theo thời gian
Kết quả cho thấy 7/20 dòng vi khuẩn có khả năng hòa tan lân tốt, cao hơn lượng
lân được hòa tan trung bình của tất cả các dòng vi khuẩn là 71,80 mg P2O5/l. Trong đó
có 5 dòng vi khuẩn được phân lập từ môi trường Nfb (AN6, AN7, AN5, AN9, AN10) và 2 dòng vi khuẩn được phân lập từ môi trường RMR (AN15 và AN17).
4.6. Khả năng tổng hợp IAA
Qua kiểm tra, tất cả 20 dòng vi khuẩn đều có khả năng tổng hợp IAA. Kết quả thống kê cụ thể như sau:
LSD0.01 = 3,368 CV (%) = 5,77
Các dòng vi khuẩn được nuôi trong môi trường Nfb: khả năng tổng hợp IAA cao nhất là dòng AN9 với giá trị là 29,19 mg/l ghi nhận vào ngày 2. Lượng IAA trung bình của dòng AN9 là 21,12 mg/l; khác biệt ở mức nghĩa 1% với 9 dòng còn lại. Các dòng AN3-AN7, AN8-AN10 và AN5-AN6 khác biệt không có nghĩa thống kê theo