Mẫu lúa được trồng ở huyện Tuy An, tỉnh Phú Yên
3.1.3. Hó chất
Môi trường phân lập vi khuẩn NFb và RMR, môi trường urk không đạm, môi trường NBRIP
Iod, Fushin, Crystal Violet, Ethanol (70%), nước cất hai lần vô trùng.
EDTA, phenol (C2H5OH), nitroprusside (Na2Fe(CN)5NO(2H2O)), NaOH,
Na2HPO4, NaOCl, ammonium molybdate ((NH4)6Mo7O24), aotassium antymonyl
tartrate (KSbOC4H4O6), acid ascorbic, acid sulfuric (H2SO4 đậm đặc, FeCl3, HgCl2,
H2O2, dung dịch NH4+ 1 mg/l, dung dịch P2O5 10 mg/l, dung dịch IAA chuẩn 10 mg/l.
Tris-HCl pH8, EDTA, 10% SDS, proteinase K, CTAB, chloroform, ethanol, isopropanol, nước cất hai lần vô trùng.
Taq DNA polymerase, bi H2O, buffer, MgCl2, dNTPs, primer, ethidium bromide,
3.2. Phương pháp nghiên cứu 3.2.1. Thu thập và xử lý mẫu 3.2.1. Thu thập và xử lý mẫu
Mẫu lúa nương đang ở giai đoạn tăng trưởng mạnh, có sự hiện diện của vi khuẩn nội sinh nhiều nhất được thu tại nhiều địa điểm khác nhau tại huyện Tuy An, tỉnh Phú Yên.
Rửa mẫu dưới vòi nước chảy mạnh cho sạch đất, loại bỏ những lá già, để ráo tự nhiên; cắt rời rễ, thân, lá và hạt thành từng đoạn nhỏ bằng dao bén, để riêng trong túi nylon sạch, bảo quản trong ngăn mát tủ lạnh nếu chưa phân lập.
Cho mẫu vào bình tam giác 100 ml và tiến hành khử trùng bề mặt lần lượt bằng các hóa chất sau: cồn 96%, HgCl2 0,1% và hydrogen peroxide (H2O2) 3%. Hóa chất phải vừa ngập mẫu và phải lắc nhẹ bình. Sau 3 phút khử trùng, mẫu phải được rửa sạch bằng nước cất vô trùng.
Để kiểm tra độ sạch của mẫu, dùng 200 µl nước rửa mẫu lần cuối chủng lên đĩa chứa môi trường Tryptone - Yeast extract - Glucose agar. Nếu sau 24 giờ đĩa môi trường này không xuất hiện khuẩn lạc nghĩa là mẫu đã đạt yêu cầu.
Cho khoảng 2 g mẫu rễ (hoặc thân, lá, cuống lá, hạt) vào cối vô trùng giã nhuyễn, thêm 0,5-1 ml nước cất cô trùng vào cối, trộn đều và hút phần dịch trích này cho vào tube 1,5 ml.
3.2.2. Ph n lập vi khuẩn
Môi trường NFb và RMR bán đặc được chuẩn bị, khử trùng nhiệt ướt và phân phối 3 ml môi trường cho vào ống nghiệm đặt trên giá ống nghiệm và để nguội.
Trộn đều dịch trích mẫu bằng máy vortex rồi hút 500 μl dịch trích mẫu lần lượt cho vào các ống nghiệm có chứa môi trường NFb và RMR bán đặc, mỗi nghiệm thức
lặp lại 3 lần, sau đó đậy nắp ống nghiệm lại và đem ủ ở 30oC khoảng 2-4 ngày.
Sau 2-4 ngày quan sát ống nghiệm, thấy có một lớp màng mỏng trên bề mặt môi trường, đó là dấu hiệu chứng tỏ sự hiện diện của vi khuẩn nội sinh.
Lần lượt cấy chuyển vi khuẩn sang môi trường NFb và RMR đặc và ủ ở 30oC;
sau 1-2 ngày, chọn những khuẩn lạc rời, đều nhau nằm trên đường cấy, cấy chuyển sang những đĩa môi trường khác cho tới khi quan sát dưới kính hiển vi thấy vi khuẩn đã ròng, chuyển mẫu ròng vào ống nghiệm chứa môi trường đặc trữ ở trong tủ lạnh và được xem là một dòng vi khuẩn.
3.3.3. Qu n sát hình thái, đo kích thước khuẩn lạc
Khi cấy chuyển vi khuẩn trên đĩa môi trường phân lập đặc ta đồng thời tiến hành đo kích thước và quan sát hình thái các dạng khuẩn lạc bao gồm các chỉ tiêu: màu sắc, hình dạng, độ nổi và dạng bìa khuẩn lạc bằng mắt thường. Tuy nhiên, đối với những khuẩn lạc có kích thước quá nhỏ thì sử dụng kính lúp để quan sát.
3.3.4. Qu n sát hình dạng và khả năng chuyển động củ vi khuẩn
Sau khi phân lập, tiến hành quan sát hình dạng và sự chuyển động của vi khuẩn bằng phương pháp nhỏ giọt ép dưới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 400 lần. Chuẩn bị mẫu vi khuẩn:
- Nhỏ 15 μl nước cất vô trùng lên kính mang vật (lame) - Khử trùng kim cấy trên ngọn lửa đèn cồn, để nguội
- Dùng kim cấy lấy một ít khuẩn lạc rồi trải đều lên giọt nước cất vô trùng trên kính mang vật.
- Đậy kính đậy vật (lammelle) lên giọt huyền phù vi khuẩn bằng cách để một cạnh của
kính đậy vật tiếp xúc với lame một góc 45o rồi hạ kính đậy vật xuống từ từ và nhẹ
nhàng sao cho trong mẫu không có bọt khí.
Quan sát hình dạng và khả năng chuyển động của vi khuẩn ở độ phóng đại 400 lần.
3.3.5. Nhuộm Gr m tế bào vi khuẩn
Nhuộm Gram là một phương pháp thực nghiệm nhằm phân biệt các loài vi khuẩn thành 2 nhóm ram dương ( ram positive và ram âm ( ram negative dựa trên các đặc tính hoá lý của thành tế bào. Sau khi quan sát hình dạng và sự chuyển động của vi khuẩn, tiến hành nhuộm ram theo các bước sau:
- Dùng que cấy vô trùng lấy một ít vi khuẩn từ ống giống thạch nghiêng hoà vào 20µl nước cất ở giữa kính mang vật.
- Hơ nhanh mẫu vật trên ngọn lửa đèn cồn 2-3 lần để gắn chặt vi khuẩn vào kính mang vật.
- Nhuộm bằng dung dịch Crystal Violet (1-2 giọt) trong 2 phút, rửa lại bằng nước cất vô trùng, chậm nhẹ cho khô;
- Nhỏ 1-2 giọt dung dịch Iod trải đều và để trong 1 phút, rửa lại bằng nước cất vô trùng, chậm nhẹ cho khô;
- Rửa lại bằng ethanol ( 0 để tẩy màu, giữ khoảng 30 giây (cho đến khi vừa thấy mất màu), rửa lại bằng nước cất vô trùng, chậm nhẹ cho khô;
- Nhuộm tiếp bằng dung dịch Fuchsin (1-2 giọt) trong 1 phút, rửa lại bằng nước cất vô trùng, chậm nhẹ cho khô.
- Tiến hành quan sát mẫu trên kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 400 lần. Vi khuẩn ram dương có màu tím xanh của Crystal Violet, trong khi vi khuẩn Gram âm trở thành màu hồng đỏ của Fuchsin.
3.3.6. Khảo sát khả năng cố định đạm
Do có khả năng tổng hợp đạm từ không khí, các vi khuẩn có khả năng cố định đạm có thể phát triển trên môi trường không đạm. Cấy chuyển các dòng vi khuẩn phân
lập được trên môi trường urk không đạm đặc, ủ ở 30oC, theo dõi sự phát triển trong
1-2 ngày. Những dòng phát triển được là những dòng có khả năng cố định đạm.
Những dòng vi khuẩn này được nuôi tăng sinh trong môi trường NFb và RMR lỏng trong 1-2 ngày trước khi chủng vào môi trường urk không đạm lỏng để tiến
hành khảo sát hàm lượng NH4+ hình thành trong dung dịch sau 2, 4, 6 và 8 ngày bằng
phương pháp so màu. Lượng NH4+
được vi khuẩn tạo ra trong dung dịch phản ứng với
thuốc thử tạo thành dung dịch màu xanh, lượng NH4+ càng nhiều thì màu xanh của
dung dịch càng đậm.
Chủng 1 ml vi khuẩn gốc vào 20 ml môi trường urk không đạm lỏng trong ống Falcon và lắc trên máy lắc với tốc độ 120 vòng/phút ở điều kiện nhiệt độ phòng trong 8 ngày tiến hành thí nghiệm. Mỗi nghiệm thức lập lại ba lần.
Hóa chất cần chuẩn bị:
- Dung dịch mẹ EDTA: cân g EDTA cho vào 0 ml nước khử khoáng, thêm nước cho đủ 100 ml, chỉnh pH về 7.
- Dung dịch mẹ phenol-nitroprusside: cân 7 g phenol (C2H5OH) và 0,034 g
nitroprusside (Na2Fe(CN)5NO(2H2 , thêm nước khử khoáng cho đến 100 ml.
- Dung dịch mẹ Sodium hypochlorise: cân 1,48 g NaOH và 4,98 g Na2HPO4, chuẩn bị s n 0 ml nước và 20 ml dung dịch Na Cl, khi thêm Na Cl xong thì thêm nước ngay sau đó cho đủ 100 ml.
Bảng 1. Đường chuẩn NH4+ 0 1 2 3 4 5 NH4+ 1 mg/l (ml) 0 0,5 1 1,5 2 2,5 Nước khử khoáng (ml) 2,5 2 1,5 1 0,5 0 Dung dịch mẹ EDTA (ml) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 Dung dịch mẹ phenol-nitroprusside (ml) 1 1 1 1 1 1
Dung dịch mẹ sodium hypochloride
(ml) 2 2 2 2 2 2
Tổng thể tích (ml) 6 6 6 6 6 6
Mẫu: ly tâm mẫu (2ml dịch vi khuẩn) 12000 vòng/phút trong 5 phút; ống nghiệm được lần lượt thêm vào: 2 ml nước khử khoáng, 0,5 ml mẫu đã ly tâm, 0,5 ml dung dịch mẹ EDTA, 1 ml dung dịch mẹ phenol-nitroprusside, 2 ml dung dịch mẹ sodium hypochloride; trộn đều bằng máy vortex, để ổn định ở nhiệt độ phòng trong 15-20 phút và tiến hành đo lượng đạm tổng hợp được bằng phương pháp quang phổ ở bước sóng 636 nm.
3.3.7. Khảo sát khả năng hò t n l n khó t n
Tương tự khảo sát năng cố định đạm, sau khi được cấy chuyển trên môi trường
N RIP đặc trong 1-2 ngày ở 30o
C, các dòng vi khuẩn nội sinh phát triển tốt trên cả môi trường này và môi trường urk không đạm được nhân sinh khối trong môi trường NFb và RMR rồi chủng vảo môi trường NBRIP lỏng. Khả năng hòa tan lân khó tan được định lượng sau 5, 10, 15 và 20 ngày.
Chủng 1 ml vi khuẩn gốc vào 25 ml môi trường NBRIP lỏng trong bình tam giác và lắc trên máy lắc với tốc độ 120 vòng/phút ở điều kiện nhiệt độ phòng trong 20 ngày tiến hành thí nghiệm. Mỗi nghiệm thức lập lại ba lần.
Chuẩn bị hóa chất:
- Dung dịch A: chuẩn bị s n 1 l nước khử khoáng được đặt trong thau nước lạnh, cho
từ từ 140 ml H2SO4 đậm đặc vào, để nguội; cân 12 g ammonium molybdate
((NH4)6Mo7O24 cho vào 100 ml nước khử khoáng; cân 0,2908 g potassium antymonyl
tartrate (KSbOC4H4O6 cho vào 100 ml nước khử khoáng; trộn ba dung dịch trên lại
rồi thêm nước cho đủ 2 l.
Xây dựng đường chuẩn P2O5: chuẩn bị 6 ống nghiệm như sau Bảng 2. Đường chuẩn P2O5 0 1 2 3 4 5 Nước khử khoáng (ml) 4 4 4 4 4 4 P2O5 10 mg/l (ml) 0 0,5 1 1,5 2 2,5 Dung dịch B (ml) 4 4 4 4 4 4 Nước khử khoáng (ml) 4,5 4 3,5 3 2,5 2 Tổng thể tích (ml) 12,5 12,5 12,5 12,5 12,5 12,5
Mẫu: lấy mẫu được nuôi ở thời điểm 5, 10, 15, 20 ngày ly tâm mẫu 12000 vòng/phút trong 5 phút; ống nghiệm được lần lượt thêm vào: 4 ml nước khử khoáng, 0,5 ml mẫu đã ly tâm, 4 ml dung dịch , 4 ml nước khử khoáng; trộn đều bằng máy vortex, để ổn định ở nhiệt độ phòng trong 15-20 phút và tiến hành đo lượng lân được hòa tan bằng phương pháp quang phổ ở bước sóng 880 nm.
3.3.8. Khảo sát khả năng tổng hợp Indole-3-acetic acid (IAA)
Cấy chuyển các dòng vi khuẩn nội sinh trên môi trường Nfb và RMR đặc có bổ
sung tryptophan (100 μl/100 ml) và ủ ở 30oC, theo dõi sự phát triển của chúng từ 1-2
ngày, dòng nào phát triển thì có khả năng tổng hợp IAA. Chọn những dòng phát triển trên môi trường này đồng thời phát triển trên môi trường urk không đạm và NBRIP đặc để tiến hành khảo sát khả năng tổng hợp IAA trên môi trường NFb và RMR lỏng có bổ sung tryptophan sau 2, 4, 6 và 8 ngày.
Chủng 150 μl vi khuẩn gốc lần lượt vào các tube eppendorf có chứa 1,5 ml môi trường Nfb và RMR lỏng có bổ sung tryptophan và ủ trong tối trong 8 ngày tiến hành thí nghiệm. Mỗi nghiệm thức lập lại ba lần.
Chuẩn bị thuốc thử: đong 44 ml nước khử khoáng cho vào cốc có thể tích lớn hơn 1l,
đặt cốc này trong thau nước lạnh, cho từ từ 553 ml H2SO4 đậm đặc vào cốc trên, để
nguội; cân 4,5g FeCl3 trong cốc khác cũng có thể tích lớn hơn 1l; rót từ từ dung dịch
H2SO4 đã được pha loãng vào cốc chứa 4,5g FeCl3, khuấy đều, để nguội; bảo quản trong chai tối màu.
Xây dựng đường chuẩn:
Bảng 3. Đường chuẩn IAA
0 1 2 3 4 5
Nước khử khoáng (ml) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
IAA chuẩn 10 mg/l (μl) 0 10 20 30 40 50
Thuốc thử (ml) 1 1 1 1 1 1
Tổng thể tích (μl) 1500 1510 1520 1530 1540 1550
Mẫu: ly tâm mẫu 12000 vòng/phút trong 5 phút; ống nghiệm được lần lượt thêm vào 0,5 ml mẫu đã ly tâm và 1 ml thuốc thử rồi được khuấy đều bằng máy vortex, ổn định 15-20 phút ở nhiệt độ phòng rồi đo lượng IAA tổng hợp được bằng phương pháp quang phổ ở bước sóng 530 nm. Dung dịch có màu hồng hay đỏ tùy thuộc vào lượng IAA có trong mẫu. Các bước trên đều phải được thực hiện trong tối.
Xử lý số liệu: Số liệu thu thập được xử lý với mức độ tin cậy 99%.
3.3.9. Nhận diện vi khuẩn nội sinh bằng kỹ thuật PCR A. Ly trích DNA của vi khuẩn A. Ly trích DNA của vi khuẩn
Nuôi vi khuẩn trong 3ml môi trường LB lỏng và lắc ủ qua đêm.
Chuyển 2 ml dung dịch vi khuẩn vào tube eppendoft 2,2 ml, ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút để phá vỡ màng tế bào, giải phóng DNA vào môi trường và tủa vi khuẩn.
Loại bỏ phần dung dịch trong có trong tube, giữ lại phần cặn.
Cho 250µl dung dịch TE pH8 vào phần cặn của tube, và đánh tan sinh khối. Thêm 50µl dung dịch 10% SDS. Bổ sung thêm 5µl proteinase K (20 mg/ml) và ủ
bằng water-bath trong 20 phút ở 65oC, cứ mỗi 5 phút đảo ngược tube 1 lần.
Thêm 400µl 10% CTAB/0,7M NaCl, trộn đều và ủ tiếp ở 65oC trong 20 phút.
Bổ sung 600µl chloroform: isoamyl alcohol (24/1) (thực hiện trong tủ hút) vào tube và trộn đều, ly tâm ở 12000 vòng/phút trong 10 phút.
Chuyển 500µl phần trong DNA phía trên vào tube mới, thêm 500µl isopropanol
vào tube và lắc đều, giữ ở -20oC ít nhất 30 phút.
Rửa với 500µl ethanol 70%, ly tâm ở 12000 vòng/phút trong 5 phút, lặp lại 2 lần.
Sấy DNA trong máy ly tâm chân không ở 45oC trong 15 phút để loại bỏ ethanol.
Hòa tan trong 30µl nước cất hai lần để trữ DNA.
B. Nhận diện các dòng vi khuẩn nội sinh bằng kỹ thuật PCR
- Pha mix trong tube 1,5 ml.
Bảng 4. Thành phần một phản ứng PCR Thành phần một phản ứng Nồng độ sau cùng Thể tích (μl) Bi H2O 13,25 Buffer (+K) 3 mM 2 MgCl2 3 mM 2 dNTP 1,6 mM 4 Primer p515FPL 10 pM 1 Primer p13B 10 pM 1 DMSO 0,05 µg 0,5 Taq 1,25 u 0,25 DNA vi khuẩn 50 ng 1
- Chu kỳ gia nhiệt khi thực hiện
Phản ứng PCR được thực hiện trong chu kỳ nhiệt. Máy gia nhiệt là máy đun nóng và làm nguội trong ống phản ứng ở nhiệt độ chính xác cho mỗi phản ứng. Để ngăn ngừa sự bay hơi của hỗn hợp phản ứng, phần nắp đậy của máy PCR cũng được đun nóng, trường hợp lượng dung dịch phản ứng quá ít, người ta cho một lớp dầu (natural oil) lên trên bề mặt hỗn hợp phản ứng.
Quy trình PCR gồm 35 chu kỳ. Mỗi chu kỳ gồm 3 bước: (1 iai đoạn tách: nhiệt độ tăng lên 4°C, thời gian: 45 giây. (2 iai đoạn gắn mồi: 55°C, thời gian: 45 giây.
(3 iai đoạn tổng hợp: 72°C, thời gian: 1 phút.
Primer 16S rRNA (Zinniel et al., 2002) dùng để nhận dạng vi khuẩn nội sinh có trình tự sau:
p515FPL 5’ -GTGCCAGCAGCCGCGGTAA- 3’
Hình 8. Chu trình PCR 16S rRNA
Sau đó, sản phẩm PCR được giữ ở 4°C. - Kiểm tra sản phẩm PCR trên gel agarose
Sau khi phản ứng PCR được thực hiện, sản phẩm PCR được điện di bằng gel agarose 1% có bổ sung ethidium bromide (EtBr).
Quy trình điện di như sau: - Chuẩn bị gel
hay điện di được đặt s n lược có số răng là 1 ở một đầu khay và được đặt ở nơi bằng ph ng.
Gel sử dụng chạy điện di: 40ml với nồng độ 1% agrarose.
Cân 0,40g agrarose cho vào chai thủy tinh có chứa 40ml bufer TBE 1X. Lắc chai cho agrarose hòa tan vào buffer TBE 1X.
Nung hỗn hợp trong microwave ở mức medium trong 5 phút cho agarose tan hoàn toàn. Để nguội (có thể cầm bằng tay được , sau đó thêm 0, µl ethidium bromide vào, lắc đều và đổ nhẹ dung dịch vào một đầu khay. Dung dịch sẽ tự trải đều khay. Sau khoảng 45 phút gel đặc lại có thể sử dụng được.
Đặt khay vào bể điện di, thêm dung dịch điện di (bufer TBE 1X) phủ mặt gel khoảng 2 mm.
Sau khi gel chuẩn bị xong, ta tiến hành load mẫu vào các giếng của gel. - Load mẫu:
Dùng micropipette hút dung dịch loading buffer và nhỏ thành từng giọt nhỏ khoảng 2µl ra giấy parafilm. Trộn đều 10µl dung dịch mẫu với dung dịch loading