Cấy chuyển các dòng vi khuẩn nội sinh trên môi trường Nfb và RMR đặc có bổ
sung tryptophan (100 μl/100 ml) và ủ ở 30oC, theo dõi sự phát triển của chúng từ 1-2
ngày, dòng nào phát triển thì có khả năng tổng hợp IAA. Chọn những dòng phát triển trên môi trường này đồng thời phát triển trên môi trường urk không đạm và NBRIP đặc để tiến hành khảo sát khả năng tổng hợp IAA trên môi trường NFb và RMR lỏng có bổ sung tryptophan sau 2, 4, 6 và 8 ngày.
Chủng 150 μl vi khuẩn gốc lần lượt vào các tube eppendorf có chứa 1,5 ml môi trường Nfb và RMR lỏng có bổ sung tryptophan và ủ trong tối trong 8 ngày tiến hành thí nghiệm. Mỗi nghiệm thức lập lại ba lần.
Chuẩn bị thuốc thử: đong 44 ml nước khử khoáng cho vào cốc có thể tích lớn hơn 1l,
đặt cốc này trong thau nước lạnh, cho từ từ 553 ml H2SO4 đậm đặc vào cốc trên, để
nguội; cân 4,5g FeCl3 trong cốc khác cũng có thể tích lớn hơn 1l; rót từ từ dung dịch
H2SO4 đã được pha loãng vào cốc chứa 4,5g FeCl3, khuấy đều, để nguội; bảo quản trong chai tối màu.
Xây dựng đường chuẩn:
Bảng 3. Đường chuẩn IAA
0 1 2 3 4 5
Nước khử khoáng (ml) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
IAA chuẩn 10 mg/l (μl) 0 10 20 30 40 50
Thuốc thử (ml) 1 1 1 1 1 1
Tổng thể tích (μl) 1500 1510 1520 1530 1540 1550
Mẫu: ly tâm mẫu 12000 vòng/phút trong 5 phút; ống nghiệm được lần lượt thêm vào 0,5 ml mẫu đã ly tâm và 1 ml thuốc thử rồi được khuấy đều bằng máy vortex, ổn định 15-20 phút ở nhiệt độ phòng rồi đo lượng IAA tổng hợp được bằng phương pháp quang phổ ở bước sóng 530 nm. Dung dịch có màu hồng hay đỏ tùy thuộc vào lượng IAA có trong mẫu. Các bước trên đều phải được thực hiện trong tối.
Xử lý số liệu: Số liệu thu thập được xử lý với mức độ tin cậy 99%.