Cơ sở cần thiết cho việc thẩm định phương pháp phân tích để định lượng những thành phần chủ yếu trong nguyên liệu làm thuốc, hoạt chất trong các chế phẩm cần dựa vào các tiêu chuẩn sau: [10]
- Tính tuyến tính. - Độ lặp lại. - Giới hạn phát hiện. - Giới hạn định lượng. - Độ đúng. 2.4.3.1 Tính tuyến tính
Tính tuyến tính của một phương pháp phân tích là khả năng luận ra các kết quả thử của phương pháp hoặc bằng phép biến đổi toán học hay trực tiếp dựa vào tương quan tỉ lệ giữa đại lượng đo được và nồng độ. Tính tuyến tính trong một miền giá trị được xác định bằng hệ số tương quan. [12]
Cách thực hiện
Tiến hành thực nghiệm để xác định ứng với các nồng độ x biết trước, các giá trị định lượng được y. Như ta đã biết nếu y phụ thuộc tuyến tính vào x có nghĩa là trong khoảng nồng độ cần khảo sát đường biểu diễn của y theo x là một đường thẳng (đoạn thẳng) theo phương trình sau: [12]
y = ax + b
Dựa vào kết quả thu được từ thực nghiệm của x và y tương ứng ta tính hệ
số tương quan R. R = 2 2 ) ( ) ( ) ).( ( y y x x y y x x
Phạm Thị Phương Thảo Chương 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
14
Yêu cầu: tùy theo hoạch định mà chọn giá trị R. Thông thường chọn 0,99 ≤ R≤ 1 thì có sự tương quan tuyến tính. [12]
2.4.3.2 Độ lặp lại
Độ lặp lại (hay độ chính xác) là mức độ sát gần giữa các kết quả thử
riêng lẻ với giá trị trung bình thu được khi áp dụng phương pháp đề xuất cho cùng một mẫu thử đồng nhất trong cùng điều kiện xác định. Độ lặp lại bị ảnh
hưởng bởi sai số ngẫu nhiên. [12]
Độ lặp lại thường được thể hiện bằng độ lệch chuẩn (SD) hay độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của một loạt các lần thử ngiệm. [12]
Cách thực hiện
Với cùng một mẫu được làm đồng nhất, tiến hành xác định bằng phương pháp đề xuất n lần (n = 6–10 hay nhiều hơn). Sau đó áp dụng công thức tính SD và RSD của phương pháp. SD = 1 ) ( 2 n x xi x: là giá trị trung bình RSD = 100% x SD n x x i
Yêu cầu:RSD càng nhỏ, phương pháp phân tích càng chính xác, RSD do mỗi phòng thí nghiệm đưa ra. Thông thường ta chọn RSD ≤ 2%. [10]
2.4.2.3 Độ đúng
Độ đúng của một phương pháp phân tích là mức độ gần sát của các giá trị tìm thấy trong phân tích so với giá trị thực. Độ đúng sẽ được tính bằng tỷ lệ
phần trăm giữa lượng chất chuẩn tìm thấy so với chất chuẩn thêm vào. [10]
Cách thực hiện
- Xác định hàm lượng của hoạt chất cần đem thử bằng phương pháp đã
đề xuất.
- Thêm một lượng chất chuẩn của hoạt chất cần thử với hàm lượng bằng với hàm lượng trung bình ±20% của chất đó trong mẫu đem thử.
- Tiến hành định lượng bằng phương pháp đề xuất để tìm hàm lượng của phần thêm vào chất cần thử.
Phạm Thị Phương Thảo Chương 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
- Từ kết quả thu được xác định tỷ lệ % hồi phục của chất đem thử.
Đ = 100% 3 2 1 S S S Trong đó: Đ: độ đúng S1: tổng lượng tìm thấy S2: lượng có sẵn trong chế phẩm S3: lượng chất chuẩn thêm vào
Yêu cầu:
Phương pháp thử nghiệm được chấp nhận khi độ đúng trung bình có giá trị thuộc khoảng 98% ≤ Σ ĐTB ≤ 102%. [10]
Phạm Thị Phương Thảo Chương 3: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
16
Chương 3: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Thời gian, địa điểm, thiết bị và hóa chất thí nghiệm 3.1.1 Thời gian, địa điểm
Đề tài được thực hiện tại phòng thí nghiệm Hóa sinh 1, Bộ môn Hóa học, Khoa Khoa học Tự nhiên, Trường Đại Học Cần Thơ. Thời gian thực hiện từ
tháng 8/2013 đến tháng 11/2013.
3.1.2 Thiết bị và hóa chất thí nghiệm
Bảng 3.1: Thiết bị và hóa chất thí nghiệm
Thiết bị Hóa chất
- Máy quang phổ UV-Vis model 6800 Jenway và cuvet thạch anh 1cm
- Máy siêu âm hòa tan - Cân phân tích - Bình định mức - Pipet - Phễu lọc - Meloxicam chuẩn - Methanol - Dung dịch NaOH 1 N - Dung dịch FeCl3 0,09% - Dung dịch K3[Fe(CN)6] 0,06% - Dung dịch HCl 2 N - Bình tam giác
Tiến hành định lượng trên 4 mẫu thuốc của các công ty dược Hậu Giang, Centerpharco, Stada, Eurolife Healthcare.
Phạm Thị Phương Thảo Chương 3: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.2 Định lượng meloxicam bằng phương pháp quang phổ tử ngoại 3.2.1 Nguyên tắc 3.2.1 Nguyên tắc
Dùng dung dịch NaOH 1 N như một dung môi để hòa tan meloxicam, tạo thành dung dịch có hấp thụ cực đại trong vùng tử ngoại. Dựa trên tính chất này, có thể dùng phương pháp quang phổ tử ngoại để định lượng meloxicam.[13]
3.2.2 Hoạch định thí nghiệm
Bảng 3.2: Hoạch định thí nghiệm
3.2.3 Tiến hành thí nghiệm
Pha dung dịch meloxicam chuẩn 100 ppm
Cân chính xác 0,05 g meloxicam cho vào becher 50 mL, thêm 30 mL dung dịch NaOH 1 N. Dùng đũa thủy tinh khuấy nhẹ. Sau đó chuyển toàn bộ
dung dịch vào bình định mức 500 mL. Định mức tới vạch bằng dung dịch NaOH 1 N, được dung dịch meloxicam chuẩn 100 ppm. Dung dịch này được bảo quản trong tối ở 4°C.
Pha dung dịch NaOH 1 N
Cân chính xác 20 g NaOH khan cho vào becher 100 mL, thêm 40 mL
nước cất, dùng đũa thủy tinh khuấy nhẹ. Sau đó chuyển toàn bộ dung dịch vào bình định mức 500 mL. Định mức tới vạch bằng nước cất.
3.2.3.1 Xác định bước sóng cực đại
Dùng pipet hút chính xác 15 mL dung dịch meloxicam chuẩn 100 ppm cho vào bình định mức 50 mL. Định mức tới vạch với nước cất, ta thu được dung dịch meloxicam có nồng độ 30 ppm.
STT Tên thí nghiệm Mục đích
1 Khảo sát λmax Tìm λmax
2 Lập đường chuẩn Tìm khoảng tuyến tính
3 Khảo sát giới hạn phát hiện, giới hạn đo
Tìm giới hạn phát hiện, giới hạn đo
4 Định lượng mẫu Xác định hàm lượng meloxicam
5 Khảo sát độ đúng Tìm độ đúng của phương pháp
Phạm Thị Phương Thảo Chương 3: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
18
Tiến hành quét phổ dung dịch đã pha trong vùng từ 250-450 nm với mẫu trắng là dung dịch NaOH 1 N, xác định bước sóng hấp thụ cực đại của
meloxicam (λmax).
Quét phổ các dung dịch meloxicam với các nồng độ khác nhau
Tiến hành pha dãy chuẩn meloxicam có nồng độ như bảng sau: Bảng 3.3: Dãy nồng độ meloxicam Bình Dung dịch meloxicam 100 ppm (mL) Nước cất C (ppm) 1 2,5 5 2 5 10 3 7,5 15 4 10 20 5 12,5 25 6 15 Định mức tới vạch (50 mL) 30 Tiến hành quét phổ dãy các dung dịch trên trong vùng từ 250-450 nm với mẫu trắng là dung dịch NaOH 1 N, nhằm kiểm tra mức độ ổn định của phổ
hấp thụ dung dịch meloxicam ở các nồng độ khác nhau.
3.2.3.2 Khảo sát giới hạn phát hiện, giới hạn đo
Tiến hành pha dãy các dung dịch meloxicam như bảng sau: Bảng 3.4: Dãy nồng độ giới hạn phát hiện, giới hạn đo Bình Dung dịch meloxicam 100 ppm (mL) Nước cất (mL) C (ppm) 1 0,5 1 2 1,5 3 3 3 6 4 6 12 5 9 18 6 12 24 7 15 30 8 18 36 9 21 42 10 24 48 11 27 54 12 30 Định mức tới vạch (50 mL) 60 Tiến hành đo độ hấp thụ của dãy các dung dịch meloxicam ở λmax khảo sát với mẫu trắng là dung dịch NaOH 1 N.
Phạm Thị Phương Thảo Chương 3: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.2.3.3 Thiết lập đường chuẩn
Tiến hành pha dãy chuẩn meloxicam có nồng độ như bảng sau: Bảng 3.5: Dãy đường chuẩn meloxicam
Bình Dung dịch meloxicam 100 ppm (mL) Nước cất Cmeloxicam (ppm) 1 2,5 5 2 5 10 3 7,5 15 4 10 20 5 12,5 25 6 15 Định mức tới vạch (50 mL) 30 Tiến hành đo độ hấp thụ của dãy các dung dịch meloxicam ở λmax khảo sát với mẫu trắng là dung dịch NaOH 1 N.
3.2.3.4 Định luợng mẫu
Tiến hành định lượng với 4 mẫu thuốc meloxicam 7,5 mg. Bảng 3.6: Mẫu meloxicam 7,5 mg
Nhãn hiệu Công ty Hàm lượng
Mebilax 7,5 Dược Hậu Giang
Meloxicam 7,5 mg Centerpharco
Meloxicam Stada Stada
Eurocam Eurolife Healthcare
7,5 mg/viên
Pha dung dịch mẫu thử
Cân 20 viên meloxicam 7,5 mg, tính khối lượng trung bình cho mỗi viên, dùng cối sứ nghiền thành bột mịn. Cân lượng bột tương đương với khối lượng một viên cho vào becher 50 mL, thêm 20 mL dung dịch NaOH 1 N, dùng đũa
thủy tinh khuấy nhẹ. Sau đó, chuyển toàn bộ dung dịch sang bình định mức
100 mL, định mức tới vạch bằng dung dịch NaOH 1 N. Lắc đều, lọc qua giấy lọc khô, bỏ 20 mL dịch lọc đầu.
Hút chính xác 10 mL dịch lọc cho vào bình định mức 50 mL, định mức tới vạch bằng nước cất.
Tiến hành định lượng dung dịch mẫu thử bằng đường chuẩn đã thiết lập với mẫu trắng là dung dịch NaOH 1 N. Thực hiện trên 3 mẫu, mỗi mẫu đo 3
Phạm Thị Phương Thảo Chương 3: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
20
3.2.3.5 Khảo sát độ đúng
Chuẩn bị mẫu thử và mẫu chuẩn
Mẫu thử: Cân 20 viên meloxicam 7,5 mg, tính khối lượng trung bình cho mỗi viên, dùng cối sứ nghiền thành bột mịn. Cân lượng bột tương đương
với khối lượng một viên, cho vào becher 50 ml thêm 20 ml NaOH 1 N, dùng
đũa thủy tinh khuấy nhẹ. Sau đó chuyển toàn bộ dung dịch sang bình định mức 100 mL, định mức tới vạch bằng dung dịch NaOH 1 N. Lắc đều, lọc qua giấy lọc khô, bỏ 20 mL dịch lọc đầu.
Mẫu chuẩn: Hút chính xác 37,5 mL dung dịch meloxicam 100 ppm cho vào bình định mức 50 mL, định mức tới vạch bằng dung dịch NaOH 1 N,
được dung dịch meloxicam chuẩn có nồng độ 75 ppm.
Pha mẫu thử thêm chuẩn
Pha dãy dung dịch gồm 1 mẫu thử không thêm chuẩn và các mẫu thử được thêm lượng chất chuẩn tương ứng 80%, 100%, 120% lượng chất cần xác
định đã có trong mẫu thử theo bảng sau: Bảng 3.7: Pha mẫu thử thêm chuẩn
Mẫu Dung dịch mẫu thử (mL) Dung dịch mẫu chuẩn (mL) Nước cất Thử 10 0 Thêm chuẩn 80% 10 8 Thêm chuẩn 100% 10 10 Thêm chuẩn 120% 10 12 Định mức đến vạch (100 mL)
Tiến hành đo độ hấp thụ của dãy các dung dịch meloxicam ở λmax khảo sát với mẫu trắng là dung dịch NaOH 1 N. Mỗi mẫu được đo 3 lần, lấy kết quả trung bình.
3.2.3.6 Khảo sát độ lặp lại
Pha dung dịch mẫu thử
Cân 20 viên meloxicam 7,5 mg, tính khối lượng trung bình cho mỗi viên, dùng cối sứ nghiền thành bột mịn. Cân lượng bột tương đương với khối lượng một viên cho vào becher 50 mL, thêm 20 mL dung dịch NaOH 1 N, dùng đũa
thủy tinh khuấy nhẹ. Sau đó, chuyển toàn bộ dung dịch sang bình định mức
100 mL, định mức tới vạch bằng dung dịch NaOH 1 N. Lắc đều, lọc qua giấy lọc khô, bỏ 20 mL dịch lọc đầu.
Phạm Thị Phương Thảo Chương 3: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Hút chính xác 10 mL dịch lọc cho vào bình định mức 50 mL, định mức tới vạch bằng nước cất.
Tiến hành định lượng dung dịch mẫu thử bằng đường chuẩn đã thiết lập với mẫu trắng là dung dịch NaOH 1 N. Thực hiện trên 6 mẫu, mỗi mẫu đo 3
lần, lấy kết quả trung bình.
3.3 Định lượng meloxicam bằng phương pháp quang phổ khả kiến 3.3.1 Nguyên tắc 3.3.1 Nguyên tắc
Dung dịch meloxicam khử K3[Fe(CN)6] thành K4[Fe(CN)6], sau đó ion Fe3+ kết hợp với ion [Fe(CN)6]4- trong môi trường acid hình thành hợp chất Fe4[Fe(CN)6]3 màu xanh lục, có hấp thụ cực đại trong vùng khả kiến (Vis). Dựa trên nguyên tắc này, có thể sử dụng phương pháp quang phổ khả kiến để định lượng meloxicam trong dược phẩm. [3]
Quá trình phản ứng:
[Fe(CN)6]3- + e - → [Fe(CN)6]4- 3[Fe(CN)6]4- + 4Fe3+ → Fe4[Fe(CN)6]3
Hình 3.2: Sơ đồ phản ứng
3.3.2 Hoạch định thí nghiệm
Bảng 3.8: Hoạch định thí nghiệm
STT Tên thí nghiệm Mục đích
1 Khảo sát λmax Tìm λmax
2 Lập đường chuẩn Tìm khoảng tuyến tính
3 Khảo sát giới hạn phát hiện, giới hạn đo
Tìm giới hạn phát hiện, giới hạn đo
4 Định lượng mẫu Xác định hàm lượng meloxicam
5 Khảo sát độ đúng Tìm độ đúng của phương pháp
6 Khảo sát độ lặp lại Kiểm tra độ lặp lại của phương pháp
S N O O OH CH3 N O H N S CH3 S N C O O O CH3 N O H N S CH3 H, e
Phạm Thị Phương Thảo Chương 3: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
22
3.3.3 Tiến hành thí nghiệm
Pha dung dịch meloxicam chuẩn 50 ppm
Cân chính xác 0,025 g meloxicam cho vào becher 50 mL, thêm 20 mL
methanol, dùng đũa thủy tinh khuấy nhẹ. Sau đó chuyển toàn bộ dung dịch vào bình định mức 500 mL, định mức tới vạch bằng methanol, được dung dịch meloxicam chuẩn 100 ppm. Dung dịch được bảo quản trong tối ở 4°C.
Pha dung dịch FeCl3 0,09%
Cân chính xác 0,7491 g FeCl3.6H2O cho vào becher 50 mL, thêm 20 mL
nước cất, dùng đũa thủy tinh khuấy nhẹ, sau đó chuyển toàn bộ dung dịch sang bình định mức 500 mL. Định mức tới vạch bằng nước cất.
Pha dung dịch K3[Fe(CN)6] 0,06%
Cân chính xác 0,3 g K3[Fe(CN)6] cho vào becher 50 mL, thêm 20 mL
nước cất, dùng đũa thủy tinh khuấy nhẹ, sau đó chuyển toàn bộ dung dịch sang bình định mức 500 mL. Định mức tới vạch bằng nước cất.
Pha dung dịch HCl 2 N
Cho 50 mL nước cất vào bình định mức 250 mL, dùng ống đong 100 mL
lấy 43 mL dung dịch HCl đậm đặc cho từ từ vào bình định mức 250 mL, lắc
đều, định mức tới vạch bằng nước cất.
3.3.3.1 Xác định bước sóng cực đại
Pha dung dịch meloxicam chuẩn 30 ppm
Dùng pipet hút chính xác 25 mL dung dịch meloxicam chuẩn 50 ppm cho vào bình định mức 50 mL. Định mức tới vạch bằng dung dịch methanol,
được dung dịch meloxicam chuẩn 25 ppm.
Pha dung dịch mẫu đo
Dùng pipet hút chính xác 6 mL dung dịch meloxicam chuẩn 30 ppm trên cho vào bình định mức 50 mL. Thêm 10 mL dung dịch K3[Fe(CN)6] 0,06%.
Đặt ở nhiệt độ phòng trong 30 phút. Sau đó cho vào tiếp 10 mL dung dịch FeCl3 0,09%, acid hóa bằng 10 mL dung dịch HCl 2 N. Định mức tới vạch bằng dung dịch methanol, lắc đều. Đặt ở nhiệt độ phòng trong 30 phút, thu
Phạm Thị Phương Thảo Chương 3: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
được dung dịch đo phổ có nồng độ meloxicam là 3 ppm. Sản phẩm phản ứng bền trong 30 phút.
Tiến hành quét phổ dung dịch trên trong vùng từ 600-950 nm với mẫu trắng là dung dịch chứa các chất giống như mẫu đo nhưng không chứa dung dịch meloxicam.
Quét phổ với các dung dịch meloxicam có nồng độ khác nhau
Tiến hành pha dãy các dung dịch meloxicam có nồng độ như bảng sau: Bảng 3.9: Dãy nồng độ meloxicam Bình 1 2 3 4 5 C (ppm) 1 1,5 2 2,5 3 Dung dịch meloxicam 25 ppm (mL) 2 3 4 5 6 Dung dịch K3[Fe(CN)6] 0,06% (mL) 10 10 10 10 10 Đặt ở nhiệt độ phòng trong 30 phút Dung dịch FeCl3 0,09% (mL) 10 10 10 10 10 Dung dịch HCl 2 N (mL) 10 10 10 10 10 Methanol (mL) Định mức tới vạch (50 mL) Đặt ở nhiệt độ phòng trong 30 phút
Tiến hành quét phổ các dung dịch trên trong vùng từ 600-950 nm với mẫu trắng là dung dịch chứa các chất giống như mẫu đo nhưng không chứa dung dịch meloxicam, nhằm kiểm tra mức độ ổn định của phổ hấp thụ dung dịch meloxicam ở các nồng độ khác nhau.
3.3.3.2 Khảo sát giới hạn phát hiện, giới hạn đo
Pha dung dịch meloxicam chuẩn 20 ppm
Dùng pipet hút chính xác 20 mL dung dịch meloxicam chuẩn 50 ppm cho vào bình định mức 50 mL. Định mức tới vạch bằng dung dịch methanol,
Phạm Thị Phương Thảo Chương 3: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
24
Tiến hành pha dãy các dung dịch meloxicam như bảng sau:
Bảng 3.10: Dãy nồng độ giới hạn phát hiện, giới hạn đo Bình 1 2 3 4 5 6 7 C (ppm) 0,2 0,4 1 2 3 4 5 Dung dịch meloxicam 20 ppm (mL) 0,5 1 2,5 5 7,5 10 12,5 Dung dịch K3[Fe(CN)6] 0,06% (mL) 10 10 10 10 10 10 10