2.3.1 Cấu tạo máy quang phổ
Hình 2.3: Sơ đồ cấu tạo máy quang phổ
Những bộ phận chính của máy:[9]
1. Nguồn sáng (nguồn phát bức xạ) 2. Bộ phận tạo tia đơn sắc
3. Bộ phận chia chùm sáng 4. Khoang chứa cuvet
5. Đầu dò (detector) 6. Bộ phận hiển thị kết quả
2.3.2 Nguyên tắc hoạt động của máy UV - Vis
Để phát bức xạ tử ngoại khả kiến, người ta dùng đèn phát ra ánh sáng đến bộ tạo đơn sắc, thường dùng là lăng kính thạch anh hay cách tử, có nhiệm vụ tách riêng từng dãy sóng hẹp (đơn sắc). Bộ phận chia chùm sáng sẽ hướng
chùm tia đơn sắc liên tục đi tới cuvet đựng dung dịch mẫu và tới cuvet đựng dung môi.[10]
Bộ phận đầu dò (detector) sẽ so sánh cường độ chùm ánh sáng đi qua
dung dịch (I) và đi qua dung môi (I0). Tín hiệu quang được chuyển thành tín hiệu điện. Sau khi được phóng đại, tín hiệu sẽ chuyển sang bộ phận ghi để vẽ đường cong sự phụ thuộc của log (I0/I) vào bước sóng. Nhờ sử dụng máy tính, bộ tự ghi còn có thể ghi ra cho ta những số liệu cần thiết như giá trị λmax cùng với giá trị độ hấp thụ A.[10]
Phạm Thị Phương Thảo Chương 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
Cường độ của tia tới đơn sắc trước và sau khi đi qua môi trường hấp thụ được liên hệ với nhau bởi định luật Lambert - Beer:[10]
A = -log(T) = log(I0/I) = lC
Trong đó:
A: Độ hấp thụ
C: Nồng độ (mol/L) l: chiều dài lớp dung dịch
ɛ: Hệ số hấp thụ phân tử gam
Chú ý: Dung môi dùng để đo phổ UV - Vis phải không hấp thụ ở
vùng cần đo và cần được tinh chế một cách cẩn thận, vì một lượng nhỏ tạp chất trong đó cũng làm sai lệch kết quả nghiên cứu.[10]
2.3.3 Ưu điểm của phương pháp quang phổ tử ngoại khả kiến
Phương pháp quang phổ khả kiến có các ưu điểm:[9]
- Phương pháp có độ nhạy cao, cho phép xác định nồng độ trong khoảng 10-2 đến 10-6 mol/L (1-10%).
- Phân tích thuận tiện: không đòi hỏi thiết bị, hóa chất quá đắt tiền, có thể phân tích nhiều đối tượng mẫu khác nhau.
- Dễ tự động hóa: tất cả các thao tác từ đưa mẫu phân tích vào, đưa các
hóa chất cần thiết, vẽ phổ, xử lý phổ, xử lý kết quả, xử lý thống kê đều được thực hiện một cách tự động hóa trên các máy móc, thiết bị hiện đại.
- Phương pháp này rất thuận lợi cho việc nghiên cứu các cơ chế tạo phức,
xác định các dạng tồn tại của ion trung tâm, các ligand nằm trong phức đơn và đa ligand trong pha nước cũng như pha hữu cơ.
2.3.4 Các yêu cầu đối với hợp chất cần phân tích
Hợp chất phân tích cần đáp ứng các yêu cầu sau: [10] - Có độ bền cao, ít phân ly. Hằng số bền K > 108. - Có thành phần xác định.
- Ổn định theo thời gian, phải ổn định ít nhất là 15 phút. - Hệ số ɛ càng lớn càng tốt.
Phạm Thị Phương Thảo Chương 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
12
2.4.5 Sai số trong phép đo phổ hấp thu UV-Vis
Sai số trong phép đo quang phổ hấp thu UV-Vis có thể do các nguyên nhân sau: [10]
- Sự phụ thuộc giữa mật độ quang (A) và nồng độ chất hấp thụ ánh sáng (C) không tuân theo định luật Lambert-Beer. Những yếu tố gây ra sự sai lệch này là: bước sóng của ánh sáng tới (ánh sáng không đơn sắc) và các yếu tốảnh
hưởng tới nồng độ (sự pha loãng dung dịch, nồng độ ion H+, các ion lạ trong dung dịch,…).
- Nguồn bức xạ điện từ có cường độ (I0) không ổn định (do hiệu điện thế
nguồn không ổn định). Do vậy, cường độ dòng bức xạ điện từ đơn sắc chiếu qua dung dịch ở các thời điểm khác nhau không giống nhau.
- Để cuvet đựng mẫu không đúng vị trí hoặc vị trí không ổn định trong
lúc đo.
- Sai số chủ quan do người thực hiện phép đo phạm phải khi đo các giá
trị mật độ quang hay độ truyền quang.
2.4 Quy trình phân tích
2.4.1 Các yêu cầu đối với quy trình phân tích
Các yêu cầu chính đối với quy trình phân tích bao gồm: [10]
- Có tính tiên tiến: thể hiện ở độ đúng, độ chính xác, tính đặc hiệu.
- Có tính thực tế: phương pháp thử đưa ra phải phù hợp với điều kiện thực tế, có tính khả thi cao (phù hợp với trang thiết bị, hóa chất, thuốc thử, trình độ con người,...).
- Có tính kinh tế: phương pháp thử đưa ra ít tốn kém mà vẫn đáp ứng
được các yêu cầu nêu trên.
- Có tính an toàn cao: an toàn lao động và bảo vệ sức khỏe (hạn chế sử
dụng hóa chất độc hại, tránh được các thao tác kỹ thuật phức tạp, nguy hiểm,...).
2.4.2 Tầm quan trọng của việc thẩm định quy trình phân tích
Thẩm định quy trình phân tích là một quá trình tiến hành thiết lập bảng thực nghiệm các thông số đặc trưng của phương pháp để chứng minh phương pháp đáp ứng yêu cầu phân tích dự kiến. Nói cách khác, việc thẩm định một
Phạm Thị Phương Thảo Chương 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
quy trình phân tích yêu cầu chúng ta phải chứng minh một cách khoa học rằng khi tiến hành thí nghiệm các sai số mắc phải là rất nhỏ và chấp nhận được. [11]
Trong các tiêu chuẩn chúng ta phải xây dựng phương pháp phân tích hay
cũng gọi là quy trình thử nghiệm để giúp cho việc thực hiện kiểm tra chất
lượng cũng như các tiêu chí đề ra cho các tiêu chuẩn đó. [11]
Mục tiêu của việc thẩm định các phương pháp phân tích là để chứng tỏ
rằng quy trình đáp ứng với yêu cầu dự kiến. [11]
2.4.3 Nội dung thẩm định
Cơ sở cần thiết cho việc thẩm định phương pháp phân tích để định lượng những thành phần chủ yếu trong nguyên liệu làm thuốc, hoạt chất trong các chế phẩm cần dựa vào các tiêu chuẩn sau: [10]
- Tính tuyến tính. - Độ lặp lại. - Giới hạn phát hiện. - Giới hạn định lượng. - Độ đúng. 2.4.3.1 Tính tuyến tính
Tính tuyến tính của một phương pháp phân tích là khả năng luận ra các kết quả thử của phương pháp hoặc bằng phép biến đổi toán học hay trực tiếp dựa vào tương quan tỉ lệ giữa đại lượng đo được và nồng độ. Tính tuyến tính trong một miền giá trị được xác định bằng hệ số tương quan. [12]
Cách thực hiện
Tiến hành thực nghiệm để xác định ứng với các nồng độ x biết trước, các giá trị định lượng được y. Như ta đã biết nếu y phụ thuộc tuyến tính vào x có nghĩa là trong khoảng nồng độ cần khảo sát đường biểu diễn của y theo x là một đường thẳng (đoạn thẳng) theo phương trình sau: [12]
y = ax + b
Dựa vào kết quả thu được từ thực nghiệm của x và y tương ứng ta tính hệ
số tương quan R. R = 2 2 ) ( ) ( ) ).( ( y y x x y y x x
Phạm Thị Phương Thảo Chương 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
14
Yêu cầu: tùy theo hoạch định mà chọn giá trị R. Thông thường chọn 0,99 ≤ R≤ 1 thì có sự tương quan tuyến tính. [12]
2.4.3.2 Độ lặp lại
Độ lặp lại (hay độ chính xác) là mức độ sát gần giữa các kết quả thử
riêng lẻ với giá trị trung bình thu được khi áp dụng phương pháp đề xuất cho cùng một mẫu thử đồng nhất trong cùng điều kiện xác định. Độ lặp lại bị ảnh
hưởng bởi sai số ngẫu nhiên. [12]
Độ lặp lại thường được thể hiện bằng độ lệch chuẩn (SD) hay độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của một loạt các lần thử ngiệm. [12]
Cách thực hiện
Với cùng một mẫu được làm đồng nhất, tiến hành xác định bằng phương pháp đề xuất n lần (n = 6–10 hay nhiều hơn). Sau đó áp dụng công thức tính SD và RSD của phương pháp. SD = 1 ) ( 2 n x xi x: là giá trị trung bình RSD = 100% x SD n x x i
Yêu cầu:RSD càng nhỏ, phương pháp phân tích càng chính xác, RSD do mỗi phòng thí nghiệm đưa ra. Thông thường ta chọn RSD ≤ 2%. [10]
2.4.2.3 Độ đúng
Độ đúng của một phương pháp phân tích là mức độ gần sát của các giá trị tìm thấy trong phân tích so với giá trị thực. Độ đúng sẽ được tính bằng tỷ lệ
phần trăm giữa lượng chất chuẩn tìm thấy so với chất chuẩn thêm vào. [10]
Cách thực hiện
- Xác định hàm lượng của hoạt chất cần đem thử bằng phương pháp đã
đề xuất.
- Thêm một lượng chất chuẩn của hoạt chất cần thử với hàm lượng bằng với hàm lượng trung bình ±20% của chất đó trong mẫu đem thử.
- Tiến hành định lượng bằng phương pháp đề xuất để tìm hàm lượng của phần thêm vào chất cần thử.
Phạm Thị Phương Thảo Chương 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
- Từ kết quả thu được xác định tỷ lệ % hồi phục của chất đem thử.
Đ = 100% 3 2 1 S S S Trong đó: Đ: độ đúng S1: tổng lượng tìm thấy S2: lượng có sẵn trong chế phẩm S3: lượng chất chuẩn thêm vào
Yêu cầu:
Phương pháp thử nghiệm được chấp nhận khi độ đúng trung bình có giá trị thuộc khoảng 98% ≤ Σ ĐTB ≤ 102%. [10]
Phạm Thị Phương Thảo Chương 3: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
16
Chương 3: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Thời gian, địa điểm, thiết bị và hóa chất thí nghiệm 3.1.1 Thời gian, địa điểm
Đề tài được thực hiện tại phòng thí nghiệm Hóa sinh 1, Bộ môn Hóa học, Khoa Khoa học Tự nhiên, Trường Đại Học Cần Thơ. Thời gian thực hiện từ
tháng 8/2013 đến tháng 11/2013.
3.1.2 Thiết bị và hóa chất thí nghiệm
Bảng 3.1: Thiết bị và hóa chất thí nghiệm
Thiết bị Hóa chất
- Máy quang phổ UV-Vis model 6800 Jenway và cuvet thạch anh 1cm
- Máy siêu âm hòa tan - Cân phân tích - Bình định mức - Pipet - Phễu lọc - Meloxicam chuẩn - Methanol - Dung dịch NaOH 1 N - Dung dịch FeCl3 0,09% - Dung dịch K3[Fe(CN)6] 0,06% - Dung dịch HCl 2 N - Bình tam giác
Tiến hành định lượng trên 4 mẫu thuốc của các công ty dược Hậu Giang, Centerpharco, Stada, Eurolife Healthcare.
Phạm Thị Phương Thảo Chương 3: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.2 Định lượng meloxicam bằng phương pháp quang phổ tử ngoại 3.2.1 Nguyên tắc 3.2.1 Nguyên tắc
Dùng dung dịch NaOH 1 N như một dung môi để hòa tan meloxicam, tạo thành dung dịch có hấp thụ cực đại trong vùng tử ngoại. Dựa trên tính chất này, có thể dùng phương pháp quang phổ tử ngoại để định lượng meloxicam.[13]
3.2.2 Hoạch định thí nghiệm
Bảng 3.2: Hoạch định thí nghiệm
3.2.3 Tiến hành thí nghiệm
Pha dung dịch meloxicam chuẩn 100 ppm
Cân chính xác 0,05 g meloxicam cho vào becher 50 mL, thêm 30 mL dung dịch NaOH 1 N. Dùng đũa thủy tinh khuấy nhẹ. Sau đó chuyển toàn bộ
dung dịch vào bình định mức 500 mL. Định mức tới vạch bằng dung dịch NaOH 1 N, được dung dịch meloxicam chuẩn 100 ppm. Dung dịch này được bảo quản trong tối ở 4°C.
Pha dung dịch NaOH 1 N
Cân chính xác 20 g NaOH khan cho vào becher 100 mL, thêm 40 mL
nước cất, dùng đũa thủy tinh khuấy nhẹ. Sau đó chuyển toàn bộ dung dịch vào bình định mức 500 mL. Định mức tới vạch bằng nước cất.
3.2.3.1 Xác định bước sóng cực đại
Dùng pipet hút chính xác 15 mL dung dịch meloxicam chuẩn 100 ppm cho vào bình định mức 50 mL. Định mức tới vạch với nước cất, ta thu được dung dịch meloxicam có nồng độ 30 ppm.
STT Tên thí nghiệm Mục đích
1 Khảo sát λmax Tìm λmax
2 Lập đường chuẩn Tìm khoảng tuyến tính
3 Khảo sát giới hạn phát hiện, giới hạn đo
Tìm giới hạn phát hiện, giới hạn đo
4 Định lượng mẫu Xác định hàm lượng meloxicam
5 Khảo sát độ đúng Tìm độ đúng của phương pháp
Phạm Thị Phương Thảo Chương 3: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
18
Tiến hành quét phổ dung dịch đã pha trong vùng từ 250-450 nm với mẫu trắng là dung dịch NaOH 1 N, xác định bước sóng hấp thụ cực đại của
meloxicam (λmax).
Quét phổ các dung dịch meloxicam với các nồng độ khác nhau
Tiến hành pha dãy chuẩn meloxicam có nồng độ như bảng sau: Bảng 3.3: Dãy nồng độ meloxicam Bình Dung dịch meloxicam 100 ppm (mL) Nước cất C (ppm) 1 2,5 5 2 5 10 3 7,5 15 4 10 20 5 12,5 25 6 15 Định mức tới vạch (50 mL) 30 Tiến hành quét phổ dãy các dung dịch trên trong vùng từ 250-450 nm với mẫu trắng là dung dịch NaOH 1 N, nhằm kiểm tra mức độ ổn định của phổ
hấp thụ dung dịch meloxicam ở các nồng độ khác nhau.
3.2.3.2 Khảo sát giới hạn phát hiện, giới hạn đo
Tiến hành pha dãy các dung dịch meloxicam như bảng sau: Bảng 3.4: Dãy nồng độ giới hạn phát hiện, giới hạn đo Bình Dung dịch meloxicam 100 ppm (mL) Nước cất (mL) C (ppm) 1 0,5 1 2 1,5 3 3 3 6 4 6 12 5 9 18 6 12 24 7 15 30 8 18 36 9 21 42 10 24 48 11 27 54 12 30 Định mức tới vạch (50 mL) 60 Tiến hành đo độ hấp thụ của dãy các dung dịch meloxicam ở λmax khảo sát với mẫu trắng là dung dịch NaOH 1 N.
Phạm Thị Phương Thảo Chương 3: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.2.3.3 Thiết lập đường chuẩn
Tiến hành pha dãy chuẩn meloxicam có nồng độ như bảng sau: Bảng 3.5: Dãy đường chuẩn meloxicam
Bình Dung dịch meloxicam 100 ppm (mL) Nước cất Cmeloxicam (ppm) 1 2,5 5 2 5 10 3 7,5 15 4 10 20 5 12,5 25 6 15 Định mức tới vạch (50 mL) 30 Tiến hành đo độ hấp thụ của dãy các dung dịch meloxicam ở λmax khảo sát với mẫu trắng là dung dịch NaOH 1 N.
3.2.3.4 Định luợng mẫu
Tiến hành định lượng với 4 mẫu thuốc meloxicam 7,5 mg. Bảng 3.6: Mẫu meloxicam 7,5 mg
Nhãn hiệu Công ty Hàm lượng
Mebilax 7,5 Dược Hậu Giang
Meloxicam 7,5 mg Centerpharco
Meloxicam Stada Stada
Eurocam Eurolife Healthcare
7,5 mg/viên
Pha dung dịch mẫu thử
Cân 20 viên meloxicam 7,5 mg, tính khối lượng trung bình cho mỗi viên, dùng cối sứ nghiền thành bột mịn. Cân lượng bột tương đương với khối lượng một viên cho vào becher 50 mL, thêm 20 mL dung dịch NaOH 1 N, dùng đũa
thủy tinh khuấy nhẹ. Sau đó, chuyển toàn bộ dung dịch sang bình định mức
100 mL, định mức tới vạch bằng dung dịch NaOH 1 N. Lắc đều, lọc qua giấy lọc khô, bỏ 20 mL dịch lọc đầu.
Hút chính xác 10 mL dịch lọc cho vào bình định mức 50 mL, định mức tới vạch bằng nước cất.
Tiến hành định lượng dung dịch mẫu thử bằng đường chuẩn đã thiết lập với mẫu trắng là dung dịch NaOH 1 N. Thực hiện trên 3 mẫu, mỗi mẫu đo 3
Phạm Thị Phương Thảo Chương 3: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
20
3.2.3.5 Khảo sát độ đúng
Chuẩn bị mẫu thử và mẫu chuẩn
Mẫu thử: Cân 20 viên meloxicam 7,5 mg, tính khối lượng trung bình cho mỗi viên, dùng cối sứ nghiền thành bột mịn. Cân lượng bột tương đương
với khối lượng một viên, cho vào becher 50 ml thêm 20 ml NaOH 1 N, dùng
đũa thủy tinh khuấy nhẹ. Sau đó chuyển toàn bộ dung dịch sang bình định mức 100 mL, định mức tới vạch bằng dung dịch NaOH 1 N. Lắc đều, lọc qua giấy lọc khô, bỏ 20 mL dịch lọc đầu.
Mẫu chuẩn: Hút chính xác 37,5 mL dung dịch meloxicam 100 ppm cho vào bình định mức 50 mL, định mức tới vạch bằng dung dịch NaOH 1 N,
được dung dịch meloxicam chuẩn có nồng độ 75 ppm.
Pha mẫu thử thêm chuẩn
Pha dãy dung dịch gồm 1 mẫu thử không thêm chuẩn và các mẫu thử được thêm lượng chất chuẩn tương ứng 80%, 100%, 120% lượng chất cần xác
định đã có trong mẫu thử theo bảng sau: Bảng 3.7: Pha mẫu thử thêm chuẩn
Mẫu Dung dịch mẫu thử (mL) Dung dịch mẫu chuẩn (mL) Nước cất Thử 10 0 Thêm chuẩn 80% 10 8 Thêm chuẩn 100% 10 10