Tiêu bản được đánh giá theo ba mức độ
- Không đạt yêu cầu: không chẩn đoán được hoặc tiêu bản quá xấu do các lỗi như: mảnh cắt quá dày, rách nát hoặc nhăn nhúm, nhuộm quá đậm hoặc quá nhạt màu, tế bào nát,…
- Đạt yêu cầu: có thể nhận định được kết quả mặc dù còn có một số lỗi kỹ thuật như: bị xước, nhăn, bẩn, có phần bị bong,… nhưng vẫn còn nguyên vẹn cấu trúc và màu sắc rõ ràng tương phản.
- Tốt: tiêu bản cắt mỏng đều,không gấp, không rách xước, màu của nhân và bào tương rõ nét, tương phản…(Nguyễn Văn Minh, 2011).
Chương 4
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Trong quá trình thực hiện tiêu bản mô vi thể trên thỏ, vịt, gà tôi đã đúc được tất cả là 87 khối mẫu và có 21 khối mẫu hoàn chỉnh. Cắt và nhuộm được tất cả là 450 lame tiêu bản trong đó chọn ra 323 tiêu bản hoàn chỉnh theo yêu cầu. Trong đó tiêu bản mô: tuyến giáp trạng là 46 tiêu bản, tuyến thượng thận là 37 tiêu bản, lách là 49 tiêu bản, hạch lâm ba ruột là 43 tiêu bản, tụy tạng là 33 tiêu bản, buồng trứng là 63 tiêu bản, tuyến Fabricius là 52 tiêu bản.
4.1. TUYẾN GIÁP TRẠNG
Hình 8. Tiêu bản vi thể của tuyến giáp trạng cắt ngang (X40)
Hình 9. Tiêu bản mao mạch quanh nang tuyến của tuyến giáp trạng (X40) Quan sát tiêu bản mô tuyến giáp trạng từ ngoài vào trong ta nhận thấy: - Tổ chức liên kết: bao quanh nang tuyến.
- Nang tuyến có hình trứng hoặc tròn, được bao bọc bởi lớp biểu mô đơn hộp.
Tế bào chính
Chất keo
Đám tế bào quanh tuyến Tổ chức
liên kêt
Nang tuyến
- Tế bào chính chiếm tỉ lệ lớn trong nang tuyến. - Chất keo được chứa đầy trong nang tuyến.
- Đám tế bào quanh tuyến: do đám tế bào nang tuyến tiết hết chất keo và bị xẹp xuống.
4.2. LÁCH
Hình 10. Tiêu bản vi thể của lách cắt ngang (X4)
Hình 11. Tiêu bản vi thể của lách cắt ngan (X10) Quan sát tiêu bản vi thể lách từ ngoài vào trong ta nhận thấy: - Tổ chức liên kết: bao bọc bên ngoài lách.
- Bè tổ chức liên kết: là tổ chức liên kết từ ngoài tiến vào trong lách. - Tủy trắng: gồm các tế bào lympho tập trung thành đám như hạt lâm ba, và có động mạch trung tâm.
- Tủy đỏ: gồm nhiều tế bào máu và xoang tĩnh mạch
Động mạch trung tâm Tủy trắng Tủy đỏ Tổ chức liên kết Bè tổ chức liên kết Mao mạch Bè tổ chức liên kết Tổ chức liên kết Tủy đỏ Động mạch trung tâm Tủy trắng
4.3. TUYẾN THƯỢNG THẬN
Hình 12. Tiêu bản tuyến thượng thận cắt ngang (X10)
Hình 13. Tiêu bản vi thể vùng cung của tuyến thượng thận cắt ngang (X40)
Hình 14. Tiêu bản vi thể vùng dậu của tuyến thượng thận cắt ngang (X40)
Tế bào vùng cung Mao mạch Mao mạch Cột tế bào Vùng cung Vùng dậu Vùng lưới Lớp vỏ Lớp tủy Tổ chức liên kết Xoang tĩnh mạch
Hình 15. Tiêu bản vi thể vùng lưới của tuyến thượng thận cắt ngang (X40)
Hình 16. Tiêu bản vi thể của tủy thượng thận cắt ngang (X10)
Quan sát tiêu bản vi thể từ ngoài vào trong ta thấy: - Tổ chức liên kết: bao bọc bên ngoài tuyến. - Lớp vỏ thượng thận:
+ Vùng cung: do những tế bào hình trụ được xếp thành hình cung, xen vào là các mao mạch.
+ Vùng dậu: do những tế bào đa giác, xếp thành hàng như những cột dậu và chúng gần như song song nhau. Xen giữa các cột tế bào là các mao quản.
+ Vùng lưới: do những tế bào đa giác, xen giữa các đám tế bào là mao mạch. Tế bào vùng lưới Mao mạch Hồng cầu Xoang tĩnh mạch Tĩnh mạch
- Tủy thượng thận: có những tĩnh mạch được tập trung lại thành xoang tĩnh mạch.
4.4. TỤY TẠNG
Hình 17. Tiêu bản vi thể tụy tạng cắt ngang (X40)
Hình 18. Tiêu bản vi thể ống dẫn lớn của tụy tạng cắt ngang (X40)
Hình 19. Tiêu bản vi thể động mạch và tĩnh mạch của tụy tạng (X40)
Nang tuyến ngoại tiết Ống bài xuất Tổ chức liên kết Vỏ bọc Nang tuyến ngoại tiết Đảo Langerhans Động mạch Tĩnh mạch
Hình 20. Tiêu bản vi thể của tụy tạng cắt ngang (X40) Quan sát tiêu bản vi thể tụy tạng từ ngoài vào trong ta nhận thấy: - Vỏ bọc bao lấy tuyến: là tổ chức liên kết mềm.
- Ống dẫn được bao lấy bởi tổ chức liên kết.
- Nang tuyến ngoại tiết: có hình chùm nho, bao quanh tuyến là cơ trơn. - Ống Boll được nối với nang tuyến ngoại tiết.
- Đảo langerhans: là tập hợp của các tế bào và được bao quanh bởi nang tuyến ngoại tiết.
- Mỗi tuyến đều có động mạch và tĩnh mạch.
4.5. HẠCH LÂM BA
Hình 21. Tiêu bản vi thể của hạch lâm ba cắt ngang (X10)
Thừng nang Xoang miền vỏ
Xoang miền tủy Hạt lâm ba
Tĩnh mạch Tổ chức liên kết
Hạt lâm ba Trung tâm sinh trưởng
Ống Boll
Cơ trơn Nang tuyến ngoại tiết
Hình 22. Tiêu bản vi thể của hạt lâm ba của hạch lâm ba (X40)
Hình 23. Tiêu thể vi thể miền tủy của hạch lâm ba (X40) Quan sát từ ngoài vào trong có cấu tạo:
- Bên ngoài được bao bọc bởi tổ chức liên kết. - Vỏ có lẫn cơ trơn
- Hạch lâm ba gồm 2 miền là miền vỏ và miền tủy:
+ Miền vỏ: có nhiều hạt lâm ba sắp xếp thành hàng to nhỏ khác nhau.
+ Miền tủy: chứa nhiều thừng nang.
- Hạt lâm ba có thể ở riêng lẻ hoặc tụ thành đám.
- Phần lâm ba tụ tập thừa ít xen với tổ chức lưới của hạch có màu sáng gọi là xoang lâm ba. Có hai loại xoang: xoang miền vỏ và xoang miền tủy.
Hạt lâm ba
Xoang miền vỏ Trung tâm sinh trưởng
Miền vỏ
Miền tủy
Thừng nang Xoang miền tủy
4.6. BUỒNG TRỨNG
Hình 24. Tiêu bản vi thể của buồng trứng cắt dọc (X4)
Hình 25. Tiêu bản vi thể nang noãn sơ cấp đang phát triển (X40)
Hình 26. Tiêu bản nang noãn chín của buồng trứng cắt dọc (X4) Lớp biểu mô phủ
Nang noãn nguyên thủy Nang noãn thứ cấp Miền tủy Miền vỏ của buồng trứng Mạch quản Nang noãn thứ cấp Noãn
Lớp vỏ của nang noãn
Màng phóng xạ
Dịch nang Tế bào nang
Hình 27. Tiêu bản vi thể lớp vỏ nang trứng chín (X10) Quan sát tiên bản từ ngoài vào trong có cấu tạo như sau:
- Bên ngoài: là lớp biểu mô mầm, gồm những tế bào hình hộp.
- Miền vỏ chiếm phần lớn buồng trứng, gồm: đám nang noãn nguyên thủy, nang noãn sơ cấp, nang noãn thứ cấp, nang noãn chín.
- Nang noãn chín có 2 lớp vỏ: lớp hạt và lớp vỏ ngoài. - Miền tủy: gồm những mao quản, là tổ chức liên kết.
4.7 TUYẾN FABRICIUS
Hình 28. Tiêu bản vi thể của tuyến Fabricius (X4)
Hình 29. Tiêu bản vi thể của tuyến Fabricius (X40) Quan sát tiêu bản từ trong ra ngoài ta thấy:
Biểu mô phủ đơn trụ Hạt lâm ba Lớp cơ Vùng trung tâm sinh trưởng Noãn bào Màng phóng xạ Lớp hạt Lớp vỏ ngoài Mao quản Vùng vỏ túi tuyến Lớp đệm Biểu mô phủ đơn Vùng tủy túi tuyến
- Biểu mô phủ: là biểu mô đơn trụ.
- Các hạt lâm ba nằm dưới biểu mô và xen vào là các mao quản. - Lớp đệm bao quanh lấy hạt lâm ba, là tổ chức liên kết.
- Lớp cơ: bao bọc ở ngoài là lớp cơ trơn.
MỘT SỐ NGUYÊN NHÂN LÀM TIÊU BẢN KHÔNG ĐẠT YÊU CẦU:
Tiêu bản bị rách: do dao không sắc, mẻ, dơ hay do nước trong chậu tải quá nóng.
Tiêu bản bị nếp gấp: do nước trong chậu tải không đủ nóng. Tiêu bản bị sọc: do tốc độ cắt không đều hay do dao không sắc. Ăn màu không tương phản giữa màu nhân với màu tế bào chất.
MỘT SỐ LƯU Ý KHI THỰC HIỆN TIÊU BẢN
Tùy vào tổ chức mà ta có thời gian ngâm hóa chất khác nhau:
- Thời gian ngâm formol: những mẫu có tổ chức dai và dày thì thời gian ngâm formol lâu hơn bình thường. Ta có thể ngâm từ 24-48 giờ.
- Thời gian ngâm xylen: những mẫu có tổ chức dai và dày thì thời gian ngâm xylen cũng lâu hơn bình thường. Ta có thể ngâm hơn 90 phút đến 120 phút thì xylen mới ngấm vào tổ chức hoàn toàn và loại bỏ hết cồn.
Đối với giai đoạn khử nước thì chúng ta có thể lưu mẫu ở cồn 700 đến 12 giờ.
Đối với việc lọc paraffin: do paraffin có lẫn nhiều tạp chất nên ta phải lọc nhiều lần (5-10 lần). Ta lọc paraffin càng nhiều lần càng tốt vì paraffin càng tinh khiết thì khả năng loại hoàn toàn xylen ra khỏi mẫu càng cao. Mặt khác khi đúc mẫu, paraffin sẽ trong và không bị rạn nức.
Khi tẩm paraffin thì ta chọn paraffin non để tẩm là tốt nhất. Do tinh thể của paraffin non nhỏ hơn tinh thể của paraffin già nên dễ len vào các tổ chức hơn, làm cho mẫu được tẩm hoàn toàn bởi paraffin.
Đối với giai đoạn nhuộm mẫu: các tổ chức khác nhau cũng bắt màu khác nhau. Tùy theo tổ chức mà ta có thời gian ngâm khác nhau, không nhất thiết phải giống chính xác thời gian trong qui trình nhuộm.
Nếu tiêu bản bắt màu lợt thì ta nên tăng thời gian ngâm Hematoxylin hay Eosin sao cho tiêu bản có độ tương phản màu rõ nhất. Đối với màu Hematoxylin thì thời gian ngâm khoảng 1 phút 30 giây đến 2 phút 30 giây, còn Eosin thì thời gian ngâm nên từ 20 đến 25 phút là tốt nhất.
Nếu tiêu bản không ăn màu thuốc nhuộm, thì cần coi lại phẩm chất của thuốc nhuộm do để lâu ngày và cần phải pha thuốc nhuộm khác. Ngoài ra, nếu tiêu bản không ăn màu Eosin thì cần bổ xung thêm acid acetic vào, với lượng là 0,5ml vào 100ml Eosin nhuộm. Cần phải theo dõi và thường xuyên thay mới hóa chất nhưng tránh lãng phí. Trung bình khi nhuộm khoảng 50- 60 lame tiến hành thay hóa chất một lần
* Thuận lợi và khó khăn trong quá trình thực hiện tiêu bản:
Thuận lợi
Quy trình đơn giản và dễ thực hiện.
Mẫu bắt màu tốt, có sự tương phản màu rõ rệt: nhân màu tím và tế bào chất màu hồng.
Các lớp tổ chức có thể phân biệt được dưới kính hiển vi quang học.
Khó khăn
Thiếu nhiều thiết bị như máy tẩm và lọc paraffin, khử nước,… nên gặp nhiều khó khăn trong khi thực hiện.
CÁCH KHẮC PHỤC KHUYẾT ĐIỂM
Do thiếu máy lọc paraffin, nên trước khi lọc cần phải làm tan chảy paraffin trước. Bằng cách bỏ paraffin cần lọc vào cốc thủy tinh đun cách thủy trên bếp điện. Sau đó, đưa nó vào thùng carton được gắn đèn dây tóc loại 60 hoặc 100W, tùy theo kích thước của thùng mà có thể gắn 1 hay 2 bóng đèn hoặc nhiều hơn.
Hình 30. Làm tan paraffin trên bếp điện và lọc paraffin trong thùng carton.
Chú ý: khi làm tan chảy paraffin trên bếp điện và lọc paraffin trong thùng
carton:
- Nên để cốc paraffin vào nước trước khi đun. Vì nếu để cốc paraffin vào nước đang sôi thì cốc sẽ dễ bể.
- Ban đầu ta đun cho nước (đã bỏ cốc paraffin vào) thật sôi, sau đó mới giảm nhiệt độ nước lại, cho đến khi nhiệt độ trong nước khoảng 60 – 700C thì dừng lại.
- Khi đun cần phải để cho cốc paraffin nghiêng (bằng cách để cây kẹp dưới đáy cốc), vì khi đun thì lượng hơi sinh ra ở đáy nồi sẽ đẩy cốc paraffin lên và có thể làm ngã hoặc bể cốc. Cần phải để cốc paraffin sao cho đụng đáy nồi, như thế cốc paraffin sẽ không ngã.
- Thời gian tan chảy paraffin tùy thuộc vào bề mặt nước trong nồi và bề mặt paraffin trong cốc. Nếu bề mặt paraffin trong cốc cao hơn bề mặt nước trong nồi thì thời gian làm chảy paraffin trong cốc dài hơn là để bề mặt paraffin gần bằng với bề mặt nước trong nồi.
- Khi tẩm mẫu với paraffin trong thùng thì không được để gần bóng đèn vì ở đó nhiệt độ cao (trên 700C), sẽ làm chín mẫu và ảnh hưởng đến cắt mẫu về sau, cần phải để xa bóng đèn và ở đó có nhiệt độ trong cốc paraffin từ 55 – 600C là tốt nhất.
Chương 5
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ KẾT LUẬN
Bằng phương pháp tiêu bản cắt lát và nhuộm kép Hematoxylin và Eosin Y, các mục tiêu của đề tài “Thực hiện tiêu bản mô động vật: tuyến giáp trạng, lách, hạch lâm ba ruột, tuyến thượng thận và buồng trứng trên thỏ, tụy tạng trên vịt, tuyến Fabricius trên gà” đã được thực hiện hoàn chỉnh. Cắt và nhuộm được tất cả là 450 lame tiêu bản trong đó chọn ra 323 tiêu bản hoàn chỉnh theo yêu cầu. Trong đó tiêu bản mô: tuyến giáp trạng là 46 tiêu bản, tuyến thượng thận là 37 tiêu bản, lách là 49 tiêu bản, hạch lâm ba ruột là 43 tiêu bản, tụy tạng là 33 tiêu bản, buồng trứng là 63 tiêu bản, tuyến Fabricius là 52 tiêu bản.
Đã khảo sát phương pháp thực hiện tiêu bản hiển vi cố định mô động vật, gồm: tuyến giáp trạng, tuyến thượng thận, lách, hạch lâm ba ruột, buồng trứng trên thỏ, tụy tạng trên vịt, tuyến Fabricius trên gà.
Tiêu bản làm ra đáp ứng được các yêu cầu quan sát cấu trúc mô học, có thể phục vụ tốt cho nhu cầu học tập, giảng dạy và nghiên cứu.
ĐỀ NGHỊ
Thực hiện thêm tiêu bản vi thể của các mô giống nhau trên từng loài khác nhau để so sánh được sự giống và khác giữa các tiêu bản của mô.
Cần có thêm những thiết bị và quy trình tiên tiến để rút ngắn thời gian thực hiện tiêu bản.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Nguyễn Xuân Hoạt và Phạm Đức Lộ. 1980. Tổ chức học phôi thai học. Nhà xuất bản Đại học và trung học chuyên nghiệp. Hà Nội.
2. Phan Thanh Trúc. 2010. Thực hiện một số tiêu bản: hạch màng treo ruột, bàng quang, dịch hoàng, mào tinh và tuyến mang tay trên thỏ. Luận văn tốt nghiệp Đại học Cần Thơ.
3. Nguyễn Văn Minh. 2011. Đề tài đánh giá chất lượng kỷ thuật vi thể trên tiêu bản nhuộm Hematoxylin – Eosin ở một số cơ sở giải phẩu bệnh trên địa bàn Hà Nội. Luận văn tốt nghiệp trường Đại học Y Hà Nội.
4. Lâm Thị Thu Hương. 2005. Mô phôi gia súc. Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh.
5. Phạm Phan Địch và Trịnh Bình. 2002. Mô học. Nhà xuất bản Y học. Hà Nội.
6. Vũ Công Hòe. 1967. Kỹ thuật kính hiển vi thông thường. Nhà xuất bản Y học Hà Nội.
7. Mariano S.H.D Fiore. 1974. Atlas of human histoslogy. Leu & Febger Philadenphia.
PHỤ CHƯƠNG
Hình. Tiêu bản vi thể tuyến giáp trạng (X40)
Tủy đỏ Tủy trắng Tổ chức liên kêt Động mạch trung tâm Hình. Tiêu bản vi thể của lách (X4) Túi tuyến Chất keo Tổ chức liên kết Tế bào tuyến Mao quản
Hình. Tiêu bản vi thể của vỏ thượng thận (X40)
Hình. Tiêu bản vi thể của hạch lâm ba ruột (X4) Cột tế bào
Tế bào vùng cung
Mao mạch Vùng cung
Vùng dậu
Vùng lưới Tế bào vùng lưới
Miền vỏ
Miền tủy Hạt lâm ba
Hình. Tiêu bản vi thể của buông trứng (X4)
Hình. Vi thể tuyến Fabricius (X10) Biểu mô mầm
Nang noãn chín
Nang noãn sơ cấp
Nang noãn nguyên thủy Nang noãn thứ cấp
Lớp cơ
Biểu mô phủ đơn trụ
Túi tuyến
Trung tâm sinh trưởng
Bảng 1. Trở ngại, nguyên nhân và cách khắc phục khi đúc mẫu
Trở ngại Nguyên nhân Khắc phục
Block vỡ có nhiều hạt
Paraffin xấu, không tinh khiết Thay và lọc thật kỹ paraffin Mẫu bật ra khỏi block khi cắt, trong block có khí Thao tác đúc khuôn chậm
Đúc lại mẫu, thao tác nhanh hơn
Mẫu khó cắt hay vỡ ra từng mảnh
Paraffin quá cứng Thay paraffin khác mềm hơn Tổ chức bị co rúm lại Nhiệt độ tẩm Paraffin cao hơn 65oC Loại bỏ mẫu đó Khó cắt, tổ chức bị tước xơ
Paraffin chưa thấm hoàn toàn vào tổ chức, chưa loại hết cồn và xylen
Tẩm lại paraffin lâu hơn, hoặc loại bỏ mẫu đó nếu có mẫu dự trữ
Bảng 2. Trở ngại, nguyên nhân và cách khắc phục khi cắt mẫu