Vì cồn có độ hòa tan paraffin thấp nên cần có dung dịch hòa tan paraffin cao hơn và tan trong cồn để paraffin ngấm vào tổ chức hoàn toàn, dung dịch trung gian này là xylen. Vì xylen loại cồn trong mẫu, làm tan paraffin để paraffin ngấm vào trong mẫu dễ dàng và làm trong mẫu. Tuy nhiên nó có thể làm cứng mẫu nếu không giới hạn thời gian ngâm mẫu.
Chuyển mẫu qua 2 lọ xylen, mỗi lọ ngâm trong 45 phút. Ngoài xylen ra ta có thể sử dụng benzen, chloroform, toluen và dầu thông nhưng không sử dụng do benzen rất độc, chloroform ngấm chậm và làm trong mẫu kém, toluen và dầu thông thì rất hiếm.
3.2.7. Tẩm paraffin
Mục đích công đoạn này giúp cắt mẫu thành những lát cắt rất mỏng, có thể quan sát được dưới kính hiển vi vì lát cắt càng mỏng thì số lớp tế bào càng ít giúp chúng ta quan sát cấu trúc tổ chức dễ dàng hơn. Do đó, ta cần phải tẩm paraffin vì sự cố định mẫu chỉ mới giết chết tế bào và giữ cho những thành phần của nó bất động trong tình trạng tĩnh. Nếu mẫu cố định xong mang đi cắt mỏng ngay thì mối liên quan giữa những tế bào và tổ chức cũng như cơ cấu của tế bào cũng sẽ bị thay đổi, biến dạng do tác động của lưỡi dao. Vì vậy, cần phải có một chất làm nền cho mẫu, vừa như cái khuôn giữ vững mẫu vừa thâm nhập được vào gian bào giữ cho thành phần tế bào cũng như tổ chức được yên vị trí khi cắt mỏng.
Trước hết cần chọn loại paraffin tốt thích hợp tan trong các dung môi trung gian. Paraffin là loại paralass thuần nhất, đặc, chắc, trắng đục, óng ánh, nóng chảy đều, dẻo và dễ cắt. Paraffin xấu là loại không thuần khiết, có nhiều bọt khí tạo thành những đốm trắng, tinh thể to, tan chảy không đều và giòn khi cắt. Paraffin thích hợp nhất là điểm nóng chảy 56- 580C. Không nên tiết kiệm trộn lẫn paraffin thừa vào nhau sẽ làm cho paraffin không thuần khiết. Paraffin chỉ có thể ngắm hoàn toàn vào mẫu và loại thải xylen ra khỏi mẫu khi nó ở trạng thái lỏng trong suốt quá trình tẩm, vì thế nên giai đoạn tẩm paraffin phải được tiền hành trong tủ sấy.
Chuyển mẫu từ lọ xylen cuối cùng vào các cốc có chứa paraffin đang lỏng đặt trong tủ sấy ở nhiệt độ 600C. Chuyển mẫu qua 2 cốc paraffin khác nhau, mỗi cốc tẩm trong 2 giờ.
3.2.7. Đúc khuôn.
3.2.8.1. Chuẩn bị
Khuôn Leuckart gồm thanh và bản kim loại hay hộp chữ nhật được gấp bằng khuôn giấy dày không cho paraffin lỏng ngấm qua.
Lọc sạch paraffin bằng giấy lọc để loại tạp chất trong paraffin. Paraffin phải được lọc trong tủ sấy ở nhiệt độ 600C.
Chuẩn bị đèn cồn và kẹp gắp mẫu.
3.2.8.2. Tiến hành
Lấy lọ paraffin đang lỏng đổ đầy khuôn. Dùng kẹp hơ nóng trên ngọn đèn cồn, gắp mẫu vào khuôn và định vị cấu trúc không gian của mẫu. Sau 15 phút paraffin sẽ chắc và thuần nhất toàn bộ tiến hành tách khối paraffin ra khỏi thanh kim loại và đúc mẫu khác.
Dán mẫu, ghi kí hiệu mẫu vào khối mẫu, sau 24 giờ tiến hành cắt mẫu.
3.2.9 Cắt mẫu
3.2.9.1. Chuẩn bị
Dao cắt vi mẫu: phải sắc vì nếu dao không bén hay răng cưa, dơ bẩn,… đều gây hư tổn cho lát cắt, làm tổ chức bị rách nát, biến dạng,…. Nên chuẩn bị dao mới hoặc dao đã được làm bén trước khi cắt.
3.2.9.2. Tiến hành
Trước khi cắt mẫu kiểm tra lại máy cắt chặt chẽ. Gắn mẫu lên trục mang mẫu, siết chặt ốc.
Gắn dao nghiêng khoảng 150 đến 200.
Định hướng khối và dao trên máy cắt cho thích hợp, chú ý nếu muốn các mảnh cắt thành dãy thì phải làm cho hai mặt trên và dưới của mặt cắt song song nhau.
Điều chỉnh ốc vi cấp của máy cắt, cắt mẫu thử ở 10µm sau đó giảm dần đến độ mỏng cho phép từ 3 - 5µm (mẫu không rách).
Hình 6. Máy cắt vi mẫu
3.2.10. Tải – hấp mẫu
3.2.10.1. Chuẩn bị
Lấy nước sạch cho vào chậu thủy tinh đặt trên bếp tải. Do nhiệt độ nóng chảy của paraffin trong phòng thí nghiệm là 560C nên nhiệt độ trong chậu thủy tinh ở 41- 420C là thích hợp nhất, paraffin căng ra từ từ. Cần lưu ý đến nhiệt độ nước trong chậu thủy tinh nếu nhiệt độ quá cao thì mẫu dễ tải nhưng khi bị gấp nếp thì khó can thiệp vì paraffin sẽ dính chặt vào kim mũi giáo, nếu nước không đủ nóng thì mẫu ít căng nhưng dễ xử lý nếu mẫu bị gấp, nên bỏ hai mẫu đầu của băng do nó có độ dày hơn những mẫu sau.
Lame sạch, kim mũi giáo.
3.2.10.2. Tiến hành
Dùng kim mũi giáo đỡ băng mẫu vừa được cắt cho vào chậu nước ấm. Trên dãy băng cắt xong, dùng kim mũi giáo tách nhẹ những lát cắt từ băng cắt cho rời ra. Có thể chọn mẫu thông qua việc quan sát, khi thấy mẫu được cắt thành dãy băng, không bị rách mẫu, gấp nếp và có độ mỏng thích hợp.
Nếu mẫu bị nếp gấp thì dùng ngón tay tùy một bên nếp gấp, bên kia dùng kim mũi giáo tách nhẹ ra, thao tác phải nhẹ nhàng nếu không dễ dẫn đến rách mẫu.
Khi paraffin đã căng, lấy lame nghiêng nhẹ luồn bên dưới sao cho mẫu đã chọn đúng vị trí giữa lame, sau đó cho lame vào tủ hấp, ở 600C trong 30 phút.
Thời gian tải mãnh cắt phải nhanh để tránh sự tiếp xúc của tổ chức với nước sẽ làm cho tế bào trương phồng thì mẫu sẽ khó bắt màu, các nhân tế bào sẽ biến đổi hình dạng.
3.2.11. Nhuộm mẫu