22 2.2 Xác định độ ẩm của dược liệu
2.2.4. Nghiên cứu về coumarin
2.2.4.I. Chiết xuất coumarin
Cân chính xác một lượng khoảng 30g bột dược liệu, cho vào túi làm bằng giấy lọc, đặt túi vào bình Soxhlet. Chiết bằng chloroform đến khi dịch chiết trong bình trong suốt (thử phản ứng đóng mở vòng lacton và phản ứng với thuốc thử Diazo).Thu lấy dịch chiết chloroform, cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm dến còn khoảng 50 ml, đem lắc nhiều lần với dung dịch NaOH IM, mỗi lần khoảng 10 ml gạn lấy phần nước. Tập trung dịch chiết nước, acid hóa bằng HCl đậm đặc đến pH = 3 - 4, cô cách thủy cho cạn bớt, làm nguội. Lắc phần dịch này với chloroform nhiều lần, mỗi lần khoảng 10 ml cho đến kiệt coumarin (kiểm tra bằng phản ứng với thuốc thử Diazo). Gộp dịch chiết chloroform rửa nhiều lần bằng nước cất cho đến khi phần nước có pH trung tính (thử bằng giấy chỉ thị màu vạn năng). Cô cạn dịch chloroform trên nồi cách thủy đến khô thu được cắn coumarin (cắn C). (Hình 2.11).
2.2A.2.Định tính coumarin bằng SKLM
- Dịch chấm sắc ký: Coumarin được chiết xuất theo qui trình mô tả ở mục 2.2.4.1 thu được cắn c. Hòa tan cắn c trong methanol để chấm sắc ký.
- Bản mỏng: Silicagel GF254(MERCK) tráng sẵn, được hoạt hóa ở 110° c
trong Ih. Để nguội và bảo quản trong bình hút ẩm.
- Hệ dung môi khai triển: Tiến hành thăm dò với các hệ dung môi:
Hệ I: Qiloroform: Ethyl acetat: Methanol (9:1,5: 1)
Hệ II: Chloroform: Ethyl acetat: Methanol (9: 1,5: 0,5) Hệ III: Cloroform: Ethyl acetat: Acid formic (3: 3; 1) Hệ IV: Benzen: Ethyl acetat (9: 1)
HệV: Benzen: Aceton (9:1)
Hệ VI: Benzen: Aceton: Methanol (9: 1,5: 0,5)
- Thuốc thử hiện màu: Soi dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 365 nm.
- Tiến hành: Chấm dịch chiết methanol ở trên lên bản mỏng. Sấy nhẹ cho khô, đặt vào bình sắc ký đã bão hòa dung môi. Sau khi triển khai lấy bản mỏng ra khỏi bình sắc ký, sấy nhẹ 15 phút cho bay hết dung môi. Soi dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 365 nm.
Sau nhiều lần triển khai cho thấy hệ III tách tốt nhất. (Hình 2.8).
Kết quả định tính coumariĩi bằng SKLM chạy với hệ dung môi III được trình bày ở bảng 2.5.
Vết M àu sắc (ưv- 365 nm) RfXlOO Độ đậm 1 Xanh sáng 20,55 + 2 Vàng chanh 21,67 + 3 Vàng chanh 46,67 + 4 Xanh sáng 60,00 + 5 Hồng 66,67 ++ 6 Xanh sáng 83,33 + 7 Nâu đậm 90,00 +++ 8 Xanh sáng 91,67 ++ 9 Hồng 92,45 +++ 10 Xanh sáng 93,57 ++ 11 Hồng 96,67 +++ Ghi chú: (+): mờ. (++): đậm. (+++); rất đậm.
Nhận xét: Qua thăm dò 6 hệ dung môi khác nhau, thấy hệ III cho kết quả tách tốt nhất. Trên bản mỏng Silicagel, cắn coumarin xuất hiện 11 vết với màu sắc, Rf và độ đậm khác nhau.
2.2A.3. Định lượng coum arin
Coumarin trong lá bạch đồng nữ được định lượng bằng phương pháp cân.
Tiến hành chiết xuất theo qui trình ở mục 2.2.4.1 thu được cắn coumarin. Sấy cắn ở 50°Cđến khối lượng không đổi, để nguội trong bình hút ẩm 30 phút thu được coumarin toàn phần sấy khô và cân ngay. Kết quả hàm lượng coumarin được tính theo công thức
m x% = •xioo Trong đó: X m M a M x ( l - a ) '
Hàm lượng % cắn thu được (%). Khối lượng cắn (g).
Khối lượng dược liệu dùng để chiết xuất (g). Độ ẩm của dược liệu (%).
Khối lượng
dược liệu (g) Độ ẩm a(%)
Khối lượng cắn coumarin(g) Hàm lượng coumarin (%) 1 30,14 11,79 0,4006 1,51 2 30,11 11,79 0,3806 1,43 3 31,48 11,79 0,3953 1,42 4 30,49 11,79 0,3794 1,41 5 30,89 11,79 0,4105 1,51 TB 30,62 0,3933 1,46± 0,06
Nhận xét: Bằng phương pháp cân, sơ bộ định lượng coumarin trong lá bạch đồng nữ có hàm lượng là 1,46± 0,06%.
2.2.5. Nghiên cứu về saponin2.2.5.I. Chiết xuất saponin 2.2.5.I. Chiết xuất saponin
Cân chính xác khoảng 20g bột dược liệu vào túi giấy lọc, đặt túi giấy lọc vào bình Soxhlet, chiết bằng ether dầu hoả cho đến khi dịch chiết trong bình trong suốt. Túi bã dược liệu được lấy ra và để cho bay hết ether dầu hoả. Sau đó tiếp tục chiết bằng methanol 80% trong bình Soxhlet cho tới khi dịch chiết trong suốt và không cho phản ứng với acid sulfuric đặc. Dịch chiết methanol đem cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm được dịch chiết methanol đậm đặc (cao lỏng), sau đó lắc kĩ với ether dầu hoả để loại tạp. Phần cao lỏng đem lắc với n- butanol (đồng thể tích) cho đến hết saponin (thử với phản ứng Salkowski). Cất thu hồi n- butanol dưới áp suất giảm đến dạng cao đặc. Hoà cao trong một lượng methanol vừa đủ sau đó thêm một lượng ether ethylic gấp 10 lần, saponin toàn phần kết tủa. Gạn lọc phần ether ethylic ra, tủa tiếp tục làm lại như trên 1 -2 lần. Lọc lấy tủa, để cho bay hơi hết ether, sấy nhẹ tủa ở 40-50°C, thu được saponin toàn phần ( cắn S). (Hình2.12 ).
2.2.S.2. Định tính saponin bằng SKLM
- Dịch chấm sắc ký: Saponin được chiết xuất theo qui trình mô tả ở mục 2.2.5.1 thu được cắn s. Hòa tan cắn s trong methanol để chấm sắc ký.
- Bản mỏng: Silicagel GF254(MERCK) tráng sẵn, được hoạt hóa ở 110° c trong Ih. Để nguội và bảo quản trong bình hút ẩm.
- Hệ dung môi khai triển:
Hệ I: Chloroform: Methanol: H2O (64: 50: 10)
Hệ II: Toluen: Ethylacetat: Acid Formic: H2O (6: 5: 1,5: 1) Hệ III: Chloroform: Ethyl acetat: Methanol (9: 1,5: 0,5) Hệ IV: n-Butanol: Ethyl acetat: H2O (4:1:1)
Hệ V : Ethylacetat: Acid acetic: HjO (3: 1: 3) Hệ VI: n-Butanol: Acid acetic: H2O (4; 1: 5) - Thuốc thử hiện màu: Soi dưới đèn tử ngoại.
- Tiến hành: Chấm dịch chiết methanol ở trên lên bản mỏng. Sấy nhẹ cho khô, đặt vào bình sắc ký đã bão hòa dung môi. Sau khi triển khai lấy bản mỏng ra khỏi bình sắc ký, sấy nhẹ 15 phút cho bay hết dung môi. Quan sát dưới ánh sáng thường.
Sau nhiều lần triển khai cho thấy hệ VI tách tốt nhất. (Hình2.9). Kết quả định tính saponin bằng SKLM được trình bày ở bảng 2.7.
Bảng 2.7: Kết quả định tính saponin bằng SKLM với hệ dung môi VI
Vết Màu (ánh sáng thường) Rf X 100 Độ đậm 1 Xanh nâu 25,00 ++ 2 Hồng 37,50 ++ 3 Vàng nâu 68,75 +++ 4 Vàng 81,25 ++ Ghi chú: (++): đậm. (+++): rất đậm.
Nhận xét: Qua thăm dò 6 hệ dung môi khác nhau, thấy hệ VI cho kết quả tách tốt nhất. Trên bản mỏng Silicagel, cắn saponin xuất hiện 4 vết với màu sắc, Rf và độ đậm khác nhau.
2.2.S.3. Định lượng saponin
Saponin trong lá bạch đồng nữ được định lượng theo phương pháp cân. Tiến hành chiết xuất theo qui trình ở mục 2.2.5.1, thu được cắn saponin toàn phần. Sấy cắn ờ 40- 50® c đến khối lượng không đổi, để nguội trong bình hút ẩm 30 phút, sấy khô và cân ngay. Kết quả hàm lượng saponin được tính theo công thức: m x% = -xioo Trong đó: X m M a M X ( l - a )
Hàm lượng % cắn thu được (%). Khối lượng cắn (g).
Khối lượng dược liệu dùng để chiết xuất (g). Độ ẩm của dược liệu (%).
Bảng 2.8: Kết quả xác định hàm lượng saponin toàn phần
TT Khối lượng
dược liệu(g) Độ ẩm a(% )
Khối lượng cắn saponin (g) Hàm lượng saponin (% ) 1 20,54 11,79 0,2046 1,13 2 20,34 11,79 0,1895 1,06 3 20,05 11,79 0,2045 1,16 4 20,29 11,79 0,1950 1,09 5 20,15 11,79 0,2235 1,26 TB 20,28 11,79 0,2154 1,14± 0,09
Nhận xét: Bằng pliương pháp cân, sơ bộ định lượng saponin toàn phần trong lá bạch đồng nữ có hàm lượng là 1,14± 0,09%.
2.2.6. Thử độc tính cấp
Cao chiết bằng nước từ lá bạch đồng nữ (Cỉerodendrum chínense var. simplex (Moldenke)S.L.Chen ) được khảo sát về độc tính cấp nhằm xác định độ an toàn của dược liệu để phục vụ việc nghiên cứu tác dụng sinh học và điều trị.
2.2.6.I. Chế phẩm thử
Dịch nước sắc lá khô bạch đồng nữ {Clerodendrum chínense var. simplex (Moldenke) S.L.Chen ) dạng cao lỏn g có tỉ lệ là (4:1).
2.2.Ó.2. Tiến hành
Thử độc tính cấp của dịch nước sắc lá khô bạch đồng nữ theo phương pháp của Behrens - Karber. Qiuột nhắt trắng có trọng lượng 20 ± 2 gam, khoẻ mạnh, không phân biệt giống do Viện Vệ sinh Dịch tễ cung cấp được chia ngẫu nhiên thành lô, mỗi lô 6 con. Trước khi thí nghiệm, để chuột nhịn đói 16 giờ. Cho chuột uống chế phẩm thử bằng kim cong đầu tù đủ mức liều quy định cho từng lô, thể tích 0,2 ml/lOg chuột, với các mức liều tăng dần (có thể làm đậm đặc thuốc để giảm thể tích thuốc nếu cần). Sau khi cho uống thuốc, chuột được nhốt riêng từng lô, theo dõi, quan sát các biểu hiện của chuột và ghi số chuột chết trong 72 giờ. Chuột chết được mổ để kiểm tra đại thể.
2.2.Ố.3. Kết quả
Bảng 2.9. Kết quả thử độc tính cấp trên các lô chuột
Nhóm Liều (g/kg) Số chuột thử (n¡) Số chuột chết (r¡) Hiệu 2 liều kế tiếp (d) Số chuột chết trung bình 2 lần kế tiếp (a) Tích a.d Tỷ lệ % chuột chết (%) 1 120 6 0 0 0 0 2 140 6 1 20 0,5 10 17 3 160 6 2 20 1,5 30 33 4 180 6 3 20 2,5 50 50 5 200 6 5 20 4 80 83 6 220 6 6 20 5,5 110 100 Tổng 36 280
Liều LD50 được tính theo công thức sau: LD =LD ^ ^ 5 0 - ^ M o o n,b = 173(g/kg) Trong đó: = ỉ ^ = 6 LD50 : Liều chết 50% số chuột. LDioo : Liều chết 100% số chuột. K : Số nhóm thí nghiệm.
Kết luận: Sau khi tiến hành thử độc tính cấp trên chuột nhắt bằng phương pháp Behrens- Karber, chúng tôi đã xác định được dịch nước sắc của lá bạch đồng nữ có độc tính với LD50= 173 g/kg.
PHẦN 3
KẾT LUẬN VÀ ĐỂ XUẤT
3.1. KẾT LUẬN
Sau thời gian thực nghiệm, chúng tôi đã thu được những kết quả sau:
Về thực vật:
❖ Đã mô tả và phân tích đặc điểm thực vật của cây nghiên cứu. Căn cứ vào các đặc điểm cành, lá, hoa, mẫu nghiên cứu đã được kiểm định tên khoa học là:
Clerodendrum chínense var. simplex (Moldenke) S.L.Chen =
Cỉerodendrum philippinum var. simplex Moldenke, thuộc họ c ỏ roi ngựa
(Verbenaceae).
*1* Đã xác định đặc điểm vi phẫu lá, vi phẫu thân, đặc điểm bột lá, tiến hành giải phẫu hoa, lá, cành góp phần tiêu chuẩn hoá và kiểm nghiệm dược liệu, chống nhầm lẫn khi sử dụng.
Vê thành phần hóa học:
Kết quả định tính các nhóm chất bằng phản ứng hóa học cho thấy trong lá bạch đồng nữ (Cỉerodendrum chínense var. simplex (Moldenke) S.L.Ơien) có flavonoid, coumarin, saponin, đường khử, tanin, sterol, acid amin, polysaccharid, muối canxi; không có glycosid tim, alcaloid, anthranoid, acid
hữu cơ, caroten , chất béo.
♦> Đã định tính dịch chiết toàn phần bằng SKLM thấy xuất hiện 10 vết với
màu sắc, Rf và độ đậm nhạt khác nhau trong hệ dung môi VII (Benzen: Aceton (9:1)).
♦♦♦ Đã định tính flavonoid bằng SKLM thấy xuất hiện 7 vết với màu sắc, Rf và độ đậm nhạt khác nhau trong hệ dung môi II (Ethylacetat: Acid formic:
H P (8:1:1)).
Đã định tính coumarin bằng SKLM thấy xuất hiện 11 vết với màu sắc, Rf và độ đậm khác nhau trong hệ III (Cloroform: Ethyl acetat: Acid formic (3: 3: D).
*t* Đã định tính saponin toàn phần bằng SKLM thấy xuất hiện 4 vết với màu sắc, Rf và độ đậm nhạt khác nhau trong hệ dung môi VI (n-Butanol: Acid acetic: H2O (4 :1 :5 )).
♦♦♦ Đã xác định hàm lượng flavonoid toàn phần trong lá bạch đồng nữ
(Cỉerodendrum chínense var. simplex (Moldenke) S.L.Ơien) là 1,77± 0,10%. ♦♦♦ Đã xác định hàm lượng coumarin toàn phần trong lá bạch đồng nữ
(Clerodendrum chínense var. simplex (Moldenke) S.L.Chen) là 1,46± 0,06%. Đã xác định hàm lượng saponin toàn phần trong lá bạch đồng nữ
(Cỉerodendrum chínense var. simplex (Moldenke) S.L.Ơien) là 1,14± 0,09%.
Về sinh học:
♦t* Đã xác định được độc tính cấp của lá bạch đồng nữ {Clerodendrum chínense var. simplex (Moldenke) S.L.Qien) với LD50=173 g/kg.
3.2. ĐỂ XUẤT
Do thời gian có hạn, những nghiên cứu trên đây của chúng tôi mới chỉ là bước đầu, nên một số nghiên cứu sau đề nghị được tiếp tục thực hiện;
+ Nghiên cứu kỹ hơn về thành phẩn hóa học và phân lập các chất flavonoid, coumarin và saponin.
+ Tiếp tục nghiên cứu về tác dụng sinh học và dạng bào chế để có thể đưa vào thử lâm sàng góp phần làm phong phú thêm kho tàng cây thuốc Việt Nam.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng Việt:
1. Bộ môn Dược liệu- Trường Đại học Dược Hà Nội (1998), Bài giảng Dược liệu, Tập I, và II.
2. Bộ môn Dược liệu- Trường Đại học Dược Hà Nội (1999), Thực tập Dược liệu- Phần hoá học.
3. Bộ môn Dược liệu- Trường Đại học Dược Hà Nội (1999), Thực tập Dược liệu- Phần vi học.
4. Bộ môn Thực vật- Trường Đại học Dược Hà Nội (2004), Thực tập thực vật và nhận biết cây thuốc.
5. Bộ môn Thực vật- Trưòỉng Đại học Dược Hà Nội (1997), Thực vật dược- Phân loại thực vật, 108-109.
6. Bộ Y Tế (2002), Dược điển Việt Nam HI, NXB Y học, 416- 417.
7. Võ Văn Chi (1997), Từ điển cây thuốc Việt Nam, NXB Y học, 61-62, 748-
749.
8. Võ Văn Chi (2002), Từ điển thực vật thông dụng, NXB Khoa học và Kĩ thuật, Tập I, 713-719.
9. Đỗ Trung Đàm (1996), Phương pháp xác định độc tính cấp của thuốc, NXB Yhọc.
10. Nguyễn Văn Đàn- Nguyễn Viết Tựu (1985), Phương pháp nghiên cứu hoá học cây thuốc, NXB Y học.
11. Lê Trần Đức (1997), Cây thuốc Việt Nam, NXB Nông nghiệp, 843-844. 12. Hà Việt Hải-Hoàng Thanh Hương- Nguyễn Hữu Khôi- Stephen G. Pyne (2 0 0 0), ‘V ề thành phần có hoạt tính sinh học mới chiết xuất từ lá bạch đồng nữịClerodendronỷragrans)”, Tạp chí Dược học, Số 3, 10-12.
13. Hà Việt Hải- Hoàng Thanh Hương- Nguyễn Hữu Khôi (2000), '‘'’Nghiên cứu khả năng chống ung thư của thành phần ỷlavonoid chiết xuất từ một số cây thuộc chi Clerodendron của Việt N a m ”, Tạp chí Dược học, Số 8, 10-13.
14. Hà Việt Hải- Hoàng Thanh Hương- Nguyễn Danh Thục (1999), ''Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn của /lavonoid trong lá một số loài Clerodendron thuộc họ Cỏ roi ngựa của Việt N am ”, Tạp chí Dược học, Số 9, 12-14.
15. Phạm Hoàng Hộ (2001), Cây cỏ Việt Nam, NXB Trẻ, Tập II, 832-840.
16. Trần Hợp (1968), Phân loại thực vật, NXB Đại học và trung học chuyên nghiệp, 208.
17. Trần Công Khánh (1980), Kỹ thuật kính hiển vi dùng trong nghiên cứu thực vật và dược liệu, NXB Y học.
18. Trần Công Khánh (1987), Thực tập hình thái và giải phẫu, NXB Đại học và trung học ch u yên nghiệp .
19. Đỗ Tất Lợi (2003), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Y học, 37- 40.
20. Nguyễn Viết Thân (2003), Kiểm nghiệm dược liệu bằng phương pháp hiển vi, NXB Khoa học và Kĩ thuật, Tập I.
21. Ngô Văn Thu (1990), Hoá học saponin, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh, 173-181.
22. Viện Dược liệu (2004), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, NXB Khoa học và Kĩ thuật, Tập I, 143-145.
23. Viện Dược liệu (1993), Tài nguyên cây thuốc Việt Nam, NXB Khoa học và Kĩ thuật, 63-67.
Tài liệu tiếng Anh:
24. Nguyễn Văn Dưofng (1993), Medical Plants of Viet Nam, Cambodia and Laos, Mekong Printing, pp. 423.
25. WuZheng- yi, Peter.H.Raven (2003), Flora o f China, vol.17, Missori Botanical Garden, pp. 47- 59.
Tài liệu tiếng Pháp:
26. M.H. Lecomte (1912-1936), Flore Générale de L ’indo- chine. Tome quatrième, Publiée sous la Direction De H. Humbert, p. 849-884.
Tài liêu tiếng Trung:
27. (1977), m n m , 24-25
28. (1977), 470-47]
Tài liêu tra trên mạng Internet:
http://www.pubmed. gov
TRƯỜNG ĐẠI HỌC D ược HÀ NỘI
Bộ môn thực vật
PHIÉU GIÁM ĐỊNH TÊN KHOA HỌC
Sấ: m m n v D
Mâu cây do: Nguyễn Thị Kim Thoa Địa chỉ: Bộ mổn Dược học cổ truyén Lẩy ngày: 19/4/2006
Mang đến: mẫu cành tươi Gồm có: cành mang lá. hoa. Yêu cầu: giám định tên khoa học
Kết quả giám định: Căn cứ vào các tài liệu hiện có tại Trường đại học Dược và cảc đặc điểm của mẫu, đõ xác định mẫu trên có:
- Tên khoa học: Clerodenrum chínense var. simplex (Moldenke) s. L. Chen. (Tôn đồng nghĩa: Clerodendmm philippitìum var. simplex
Moldenke)
- Họ: Verbenaceae
- Tên thường gọi: Mò hoa trắng; Bạch đồng nữ.
Các tiêu bản trên được lưu tại; Phòng tiêu bản Bộ môn Thực vật Trường đại học Dược Hà nội (HNIP. Mã tiêu bản: 15017 HNIP 06)
Hà nội, ngày 17 tháng 5 năm 2006
TRUỒNG ĐẠI HỌC DUỢC HÀ NỘI BỘ MÔN THỤC VẬT
Người giám định