2.2.2.I. Định tính các nhóm chất bằng phản ứng hóa học • Định tính glycosỉd tim:
Cho vào bình nón dung tích 50ml khoảng 5g bột dược liệu, thêm 25ml nước. Ngâm trong 24h, gạn lấy dịch chiết vào một cốc có mỏ. Thêm khoảng 3ml chì acetat 30%, khuấy đều. Lọc qua giấy lọc gấp nếp, thử dịch lọc vẫn còn tủa vód chì acetat, cho thêm 1 ml chì acetat nữa vào dịch chiết, khuấy và lọc lại. Tiếp tục thử đến khi dịch chiết không còn tủa với chì acetat. Cho toàn bộ dịch lọc vào bình gạn, lắc kỹ 2 lần với chloroform, mỗi lần 5m l Gạn lấy dịch chloroform vào cốc có mỏ khô sạch. Chia dịch chiết vào các ống nghiệm nhỏ khô. Đặt các ống nghiệm lên giá và bốc hci trên nồi cách thủy đến khô. Cắn còn lại được đem tiến hành các phản ứng:
- Phản útng Liberman- Bouchardat: Cho vào 1 ống nghiệm có chứa cắn 0,5ml anhydiid acetat, lắc cho tan hết cắn. Để nghiêng ống nghiệm 45®,
thêm từ từ đồng lượng H2SO4 đặc (0,5 ml) theo thành ống nghiệm để dịch lỏng chia thành 2 lófp chất lỏng thấy xuất hiện vòng tím đỏ (Phản ứng dương tính).
- Phản ứng Legal: Cho vào ống nghiệm chứa cắn 0,5 ml cồn 90°, lắc đều cho cắn được hòa tan hết, thêm 1 giọt Natri Nitroprussiat 1% và 2 giọt dung dịch NaOH 10%, không thấy xuất hiện màu hồng (Phản ứng âm tính).
- Phản ứng Baljet: Cho vào ống nghiệm chứa cắn 0,5 ml ethanol 90°. Thêm thuốc thử Baljet mới pha vào (một phần dung dịch acid picric 1% và 9 phần dung dịch NaOH 10%). Không thấy xuất hiện màu vàng cam (Phản ứng âm tính).
Sơ bộ kết luận: Dược liệu không có glycosid tim. • Định tính saponin:
- Quan sát hiện tượng tạo bọt: Cho vào ống nghiệm to khoảng Ig
dược liệu, thêm 5 ml nước, lắc mạnh ống nghiệm theo chiều dọc trong 5 phút. Để yên, quan sát hiện tượng tạo bọt. Sau 15 phút, cột bọt vẫn bền vững.
- Phản ứng phân biệt hai loại saponin:
Cho vào ống nghiệm lớn 0,5g bột dược liệu, thêm 5ml cồn 90. Đun cách thuỷ đến sôi, lọc nóng, lấy dịch lọc làm các thí nghiệm:
+ Ống 1: Cho 5 ml d d. NaOH 0,1N+ 5 giọt dịch lọc trên. + Ống 2: Cho 5 ml d d. HCl 0,1N+ 5 giọt dịch lọc trên.
Lắc đều 2 ống nghiệm trong 1 phút. Để yên, thấy cột bọt ở ống 1 cao hơn ở ống 2.
- Phản ứng Salkowski: Cho vào ống nghiệm 2g bột dược liệu, thêm lOml cồn, đun cách thuỷ đến sôi, lọc nóng. Lấy Iml dịch chiết cho vào một ống nghiệm nhỏ, thêm vài giọt H2SO4 theo thành ống, mặt phân cách xuất hiện màu tím đỏ, lắc đồng nhất (Phản ứng dương tính).
Sơ bộ kết luận: Dược liệu có saponin steroid. • Định tính Aavonoid:
Cân khoảng 5g dược liệu cho vào bình nón dung tích lOOml, thêm 50 ml cồn 90°. Đun cách thủy 10 phút, lọc nóng, dùng dịch lọc làm các phản ứng sau:
- Phản ứng Cyanidin: Cho 1 ml dịch chiết vào ống nghiệm, thêm một ít bột Magie kim loại và 5 giọt HCl đặc, lắc đều thấy xuất hiện màu đỏ hồng (Phản ứng dương tính).
- Phản ứng vói kiềm:
+ Phản ứng với NH3: Nhỏ 1 giọt dịch chiết lên tờ giấy lọc, sấy khô, rồi hơ trên miệng lọ có chứa amoniac đặc đã mở nút, thấy màu vàng của vết đậm lên (phản ứng dương tính).
+ Phản ứng với NaOH: Cho vào ống nghiệm Iml dịch chiết, thêm vài giọt dd. NaOH 10%, thấy xuất hiện tủa và màu vàng của dịch chiết tăng lên rõ rệt (phản ứng dưofng tính).
- Phản ứng vói FeCl3: Cho 1 ml dịch chiết vào ống nghiệm, thêm 3 giọt PeQg 5% thấy màu dịch chiết chuyển từ xanh nhạt sang xanh đen (Phản ứng dương tính).
Sơ bộ kết luận : Dược liệu có Aavonoid. • Định tính coumarin:
- Vi thăng hoa:
Cho 1 g dược liệu vào một nắp chai bằng nhôm. Hơ trên đèn cồn đến khi bay hết hơi nước trong dược liệu. Đặt lên trên miệng nắp nhôm một lam kính, trên đó có để một miếng bông ướt. Đặt nắp nhôm trực tiếp trên nguồn nhiệt. Sau 5 phút lấy lam kính ra để nguội, soi dưới kính hiển vi. Thấy có tinh thể hình kim (Phản ứng dương tính).
- Chiết xuất coumarin;
Lấy khoảng 10 g dược liệu cho vào bình nón 100 ml, thêm 50 ml cồn 90°, đun cách thủy 5 phút, lọc nóng qua giấy lọc. Dịch lọc thu được dùng làm các phản ứng:
+ Phản ứng mở - đóng vòng lacton;
Cho vào 2 ống nghiệm mỗi ống 1 ml dịch chiết. Ống 1: thêm 0,5 ml dung dịch NaOH 10%. Ống 2: để nguyên.
Đun cả hai ống nghiệm trên nồi cách thủy đến sôi. Quan sát thấy: Ống 1: có tủa đục trắng.
ống 2: trong suốt.
Thêm vào cả 2 ống nghiệm mỗi ống 2 ml nước cất, lắc đều thấy: Ống 1: trong suốt.
Ống 2: có tủa đục.
Acid hóa ống 1 bằng vài giọt HCl đặc, ống 1 sẽ trở lại đục như ống 2. (Phản ứng dương tính).
+ Phản ứng chuyển dạng đồng phân cis-trans:
Nhỏ 1 giọt dịch chiết lên giấy thấm, nhỏ tiếp lên 1 giọt NaOH 5%, sấy nhẹ. Qie một nửa vết với đồng xu chiếu tử ngoại trong vài phút sau đó cất đồng xu đi, sẽ thấy nửa hình tròn không che thì sáng hơn nửa vòng tròn bị che. Nếu tiếp tục chiếu thì độ sáng của nửa bị che sẽ sáng dần lên bằng phần không bị che. (Phản ứng dương tính).
+ Phản ứng diazo hóa:
Cho 1 ml dịch chiết vào ống nghiệm nhỏ, thêm 2 ml NaOH 10%. Đun cách thủy đến sôi, để nguội. Thêm vài giọt thuốc thử Diazo mới pha, thấy trong ống nghiệm xuất hiện kết tủa đỏ gạch (Phản ứng dưoỉng tính).
Sơ bộ kết luận : Dược liệu có coumarin. • Định tính alcaloid:
Cho khoảng 2 g dược liệu vào bình nón dung tích 50 ml, thêm 15 ml dung tích H2SO4 1 N. Đun đến sôi, để nguội. Lọc lấy dịch cho vào bình gạn dung tích 100 ml. Kiềm hóa dịch lọc bằng dung dịch NH36N (khoảng 8 ml) đến phản ứng kiềm (thử bằng giấy quỳ). Chiết tiếp bằng choroíorm 3 lần, mỗi lần 5 ml. Gộp dịch chiết choroíorm vào bình gạn, lắc với dung dịch H2SO4 1 N hai lần, mỗi lần 5 ml. Gạn lấy dịch chiết acid, cho vào 3 ống nghiệm, mỗi ống
Iml dịch chiết.
- Ống 1: Nhỏ 2-3 giọt thuốc thử Dragendoff, thấy có xuất hiện tủa da cam (Phản ứng dương tính).
- Ống 2: Nhỏ 2-3 giọt thuốc thử Mayer, không thấy xuất hiện kết tủa trắng (Phản ứng âm tính).
- Ống 3 : Nhỏ 2-3 giọt thuốc thử Bouchardat, không thấy xuất hiện tủa nâu đỏ (Phản ứng âm tính).
Sơ bộ kết luận: Dược liệu không có aỉcaloid. • Định tính Tanin:
Cho vào ống nghiệm 1 g dược liệu, thêm 5 ml nước cất, đun sôi trực tiếp trong 5 phút, lọc lấy dịch lọc để làm phản ứng:
- Vói dung dịch FeCl35%: Cho 1 ml dịch lọc vào ống nghiệm, thêm 5 giọt FeClj 5%, lắc đều, dung dịch chuyển từ màu xanh nhạt sang xanh tím (Phản ứng dương tính).
- Với dung dịch gelatin 5% : Cho 1 ml dịch lọc vào ống nghiệm, thêm 5 giọt dung dịch gelatin 5%, lắc đều, thấy xuất hiện tủa bông trắng (Phản ứng dương tính).
- Vói dung dịch chì acetat 10%: Cho 1 ml dịch lọc vào ống nghiệm,
thêm 5 giọt dung dịch đồng acetat 10%, lắc đều, thấy xuất hiện tủa bông (Phản ứng dương tính).
Sơ bộ kết luận : Dược liệu có tanin. • Định tính anthranoid:
Phản ứng B orntrager: Lấy khoảng 3 g dược liệu cho vào bình nón 50 ml, thêm 30 ml H2SO4 IN, đun sôi cách thủy trong 15 phút. Để nguội rồi lọc. Cho dịch lọc vào bình gạn, lắc với 5ml chloroform, gạn lấy phần chloroform để tiến hành phản ứng:
Lấy 1 ml dịch chiết cho vào ống nghiệm, thêm 1 ml NH4OH 10%, lắc đều không thấy xuất hiện màu hồng. Tiếp tục cho từng giọt NaOH 10% vào, lắc nhẹ, không thấy lớp nước có màu hồng (Phản ứng âm tính).
Sơ bộ kết luận: Dược liệu không có anthranoid. • Định tính acid hữu cơ:
- Cho 1 g dược liệu vào ống nghiệm, thêm 5 ml nước cất, đun sôi trực tiếp trong 10 phút, để nguội rồi lọc. Thêm vào dịch lọc một ít tinh thể Na2CƠ3, không thấy có bọt khí bay lên (Phản ứng âm tính).
- Cho khoảng 1 g dược liệu vào ống nghiệm, thêm 5 ml cồn 90°, đun sôi nhẹ trong vài phút, để nguội rồi lọc. Thêm vào dịch lọc một ít tinh thể Na2SƠ3, không thấy có bọt khí bay ra (Phản ứng âm tính).
Sơ bộ kết luận: Dược liệu không có acid hữu cơ. • Định tính đường khử:
Lấy khoảng 2 g dược liệu cho vào ống nghiệm to, thêm 5 ml cồn 90°, đun cách thủy 10 phút, lọc lấy dịch. Cho 1 ml dịch lọc vào ống nghiệm, thêm 3 giọt thuốc thử Fehling A và 3 giọt thuốc thử Fehling B, thấy xuất hiện màu xanh lá. Đun cách thủy 10 phút thấy có tủa đỏ gạch dưới đáy ống nghiêm (Phản ứng dương tính).
Sơ bộ kết luận: Dược liệu có đường khử. • Định tính acid amin:
Qio khoảng 2g dược liệu vào ống nghiệm to, thêm 10 ml nước cất, đun sôi 5 phút, lọc nóng. Lấy 2 ml dịch chiết cho vào một ống nghiệm khác, thêm 3 giọt thuốc thử Ninhydrin 3%, đun cách thủy sôi 10 phút, thấy xuất hiện màu tím đậm (Phản ứng dương tính).
Sơ bộ kết luận: Dược liệu có acid amin. • Định tính chất béo:
Lấy khoảng 5 g dược liệu vào bình nón có nút mài dung tích 50 ml, đổ ngập ether dầu hỏa, đun cách thủy 15 phút, lọc lấy dịch lọc để làm phản ứng. Nhỏ 1 giọt dịch chiết lên miếng giấy lọc, hơ nóng cho bay hết hơi dung môi, không thấy để lại vết mờ trên giấy lọc (Phản ứng âm tính).
Sơ bộ kết luận: Dược liệu không có chất béo. • Định tính caroten:
Cho vào ống nghiệm to 2 ml dịch chiết ether dầu hỏa, bốc hơi trên nồi
cách thủy đến cắn, thêm v à i giọ t H2SO4 đặc vào cắn, dịch lỏ n g không chuyển
màu xanh (Phản ứng âm tính).
Sơ bộ kết luận : Dược liệu không có caroten. • Định tính sterol:
Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết ether dầu hỏa, bốc hơi trên nồi cách thủy đến cắn. Thêm vào ống nghiêm 1 ml anhydrid acetic. Lắc kỹ cho tan hết cắn. Để ống nghiệm nghiêng 45®, thêm từ từ 1 ml H2SO4 đặc theo thành ống nghiệm, thấy mặt phân cách giữa hai lớp chất lỏng có màu xanh (Phản ứng dương tính).
Sơ bộ kết luận: Dược liệu có sterol. • Định tính polysaccharid:
Cho 2g bột dược liệu vào một cốc có mỏ, thêm 10 ml nước cất, đun cách thuỷ sôi 5 phút, lọc nóng. Cho vào 2 ống nghiệm:
+ Ống 1: 4 ml dịch chiết và 5 giọt TT. Lugol. + Ống 2: 4 ml nước cất và 5 giọt TT. Lugol. Quan sát thấy ống 1 có màu đỏ đậm hơn ống 2.
( TT. Lugol được pha như sau: Lấy 0,5 g I2 và l,Og KI pha trong lOOml nước cất. Đựng trong lọ màu).
Sơ bộ kết luận: Dược liệu có polysaccharid. • Định tính muối canxi:
Cho 2g bột dược liệu vào một ống nghiệm lớn, thêm 10 ml nước cất, đun cách thuỷ đến sôi, để nguội, lọc. Cho dịch lọc vào 2 ống nghiệm nhỏ, mỗi ống
2ml:
+ Ống 1: Thêm vào một ít tinh thể NajCOj, thấy xuất hiện tủa đục, trắng.
+ Ống 2:Thêm vào một ít tinh thể (NH4) C2O4, thấy xuất hiện tủa trắng, đục.
Sơ bộ kết luận: Dược liệu có ion Ca^^.
Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ trong lá cây bạch đồng nữ được tóm tắt ở bảng 2.1.
STT Nhóm chất Phản ứng định tính Kết quả Sơ bộ kết luạn 1 Glycosid tim Phản ứng Liebermann- Bouchardat ++ Không có Phản ứng Legal - Phản ứng Baijet - 2. Flavonoid Phản ứng Cyanidin +++ Có Phản ứng vớiNaOH +++ Phản ứng với NH3 +++ Phản ứng với FeClj 5% +++ 3. Saponin
Quan sát hiện tượng tạo bọt ++
Saponin Steroid
Phản ứng Salkowski ++
Phản ứng phân biệt hai loại Saponin
4. Coumarin
Phản ứng mở- đóng vòng lactoĩi ++
Có Phản ứng chuyển dạng đồng
phân cis- trans. ++
Vi thăng hoa +
Phản ứng với thuốc thử Diazo +++
5. Anthranoid Phản ứng Bomtrager - Không có
6. Acid hữu cơ Phản ứng với NajSOg - Không có
Phản ứng với NajCOj - 7. Tanin Phản ứng với FeClj 5% + ++ Có Phản ứng với gelatin 5% +++ Phản ứng với chì acetat +++
8. Đường khử Phản ứng với TT Fehling A và
Fehling B +++ Có 9. Alcaloid Phản ứng với TT Mayer - Không có Phản ứng vód TT Dragendoff + Phản ứng với TT Bouchardat -
1 1. Chất béo Tạo vết mờ trên giấy - Không có
1 2. Caroten Phản ứng với H2SO4 đặc - Không có
13. Sterol Phản ứng Liebermann ++ Có
14. Polysaccharid Phản ứng với r r . Lugol ++ Có
15. Ion Ca^"^ Phản ứng với NajCOj +++ Có
Phản ứng với (NĨỈ4)2C204 +++ Ghi chú: (-): Phản ứng âm tính.
(+): Phản ứng dương tính. (++): Phản ứng rõ.
(+++): Phản ứng rất rõ.
Nhận xét: Qua các phản ứng định tính, thấy trong lá cây bạch đồng nữ có chứa: flavonoid, coumarin, saponin, đường khử, tanin, sterol, acid amin, polysaccharid, muối canxi và không có glycosid tim, alcaloid, anthranoid, acid hữu cơ, caroten, chất béo. Trong đó flavonoid, coumarin, saponin là các nhóm chất được tập trung nghiên cứu.
2.2.2.2. Xác định độ ẩm của dược liệu
Lấy khoảng 2g bột dựơc liệu để xác định độ ẩm. Bật máy đo độ ẩm Sartorius, điều chỉnh nhiệt độ 110°c. Đổ dược liệu lên đĩa cân và trải đều, đậy nắp cân và đợi máy tự động hiện kết quả lên màn hình, sau 5 phút đọc kết quả. Độ ẩm của dược liệu là 11,79%.
2.2.2.3. Định tính dịch chiết toàn phần bằng SKLM
- Dịch chấm sắc ký: Cân khoảng 5g dược liệu cho vào bình nón dung tích lOOml, thêm 50 ml cồn 90°. Đun cách thủy 10 phút, lọc nóng. Dịch lọc đem cô cách thuỷ thu được dịch chiết đậm đặc để chấm sắc ký.
- Bản mỏng: Silicagel GF254(MERCK) tráng sẵn, được hoạt hóa ở 110® c
trong Ih. Để nguội và bảo quản trong bình hút ẩm.
- Hệ dung môi k h a i triển: Tiến hành thăm dò trên các hệ dung môi: Hệ I:
Hệ II: Hệ III: Hệ IV: Hệ V:
Ethylacetat: Acid formic: HjO (8:1:1)
Ethyl acetat: Qiloroform: Acid formic (3:3:1) Toluen: Ethyl acetat: Aceton: Acid formic (5:2:2:1) Toluen: Ethyl acetat: Acid formic (5: 6:1)
Hệ VI: Toluen: Ethyl acetat: Acid formic (5:4:1)
Hệ VII: Benzen: Aceton (9:1)
-Thuốc thử hiện màu: Hơi amoniac và soi dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm và 365nm.
-Tiến hành: Chấm dịch chiết methanol ờ trên lên bản mỏng. Sấy nhẹ cho khô, đặt vào bình sắc ký đã bão hòa dung môi. Sau khi triển khai lấy bản mỏng ra khỏi bình sắc ký, sấy nhẹ 15 phút cho bay hết dung môi. Phát hiện vết dưới ánh tử ngoại. Sau đó hơ trên miệng lọ amoniac mở nút rồi quan sát dưới ánh sáng thường. Sau nhiều lần triển khai cho thấy hệ VII tách tốt nhất.
Kết quả định tính dịch chiết toàn phần bằng SKLM được trình bày ở bảng
2.2 v à h m h2.6.
Bảng 2.2: Kết quả định tính dịch chiết toàn phần với hệ dung môi v n
TT Rf X 100 M àu sắc vết u v (254 nm) u v (365 nm) 1 5,56 Hồng đậm 2 16,67 Nâu đ ậ m Nâu đậm 3 2 2 ,2 2 Hồng nhạt 4 27,78 Hồng nhạt 5 38,89 Nâu đậm Hồng đậm 6 44,44 Hồng nhạt 7 50,00 Nâu đậm Hồng đ ậ m 8 61,11 Hồng nhạt 9 77,78 Hồng đậm 1 0 88,89 Nâu đậm Hồng đậm
Nhận xét: Sau khi thăm dò 7 hệ dung môi, thấy hệ VII cho kết quả tách tốt nhất. Trên bản mỏng Silicagel dịch chiết toàn phần xuất hiện 10 vết với màu sắc, Rf và độ đậm khác nhau.
Hình 2.6. Ảnh SK đồ của dịch chiết toàn phần và
ƯV234ln) (hệ vn)
Hình 2.7. Ảnh Hình 2.8. Ảnh Hình 2.9. Ảnh SKĐAavonoid SKĐ coumarỉn SKĐ saponin
toàn phần toàn phần toàn phẩn (hệ II) (hệ UI) (hệ VI)
2.2.3. Nghiên cứu về flavonoid
2.13.1, Chiết xuất flavonoid
Cân chính xác khoảng 20g dược liệu đã xác định độ ẩm, cho vào túi làm bằng giấy lọc, đặt túi vào bình Soxhlet. Chiết bằng chloroform đến khi dịch chiết không còn màu xanh. Lấy túi dược liệu ra khỏi bình Soxhlet, để bay hết hcd chloroform tới khô rồi đặt lại vào bình, chiết tiếp bằng MeOH đến khi dịch chiết trong suốt (thử không cho màu vàng với NaOH IN). Tập trung dịch chiết MeOH, đem cất thu hồi dưới áp suất giảm, tiếp tục bay hoi trên nồi cách thủy đến khô thu được cắn B. Hòa tan cắn B vào nước nóng, đun cách thủy 30