22 2.2 Xác định độ ẩm của dược liệu
2.2.2.3. Định tính dịch chiết toàn phần bằng SKLM
- Dịch chấm sắc ký: Cân khoảng 5g dược liệu cho vào bình nón dung tích lOOml, thêm 50 ml cồn 90°. Đun cách thủy 10 phút, lọc nóng. Dịch lọc đem cô cách thuỷ thu được dịch chiết đậm đặc để chấm sắc ký.
- Bản mỏng: Silicagel GF254(MERCK) tráng sẵn, được hoạt hóa ở 110® c
trong Ih. Để nguội và bảo quản trong bình hút ẩm.
- Hệ dung môi k h a i triển: Tiến hành thăm dò trên các hệ dung môi: Hệ I:
Hệ II: Hệ III: Hệ IV: Hệ V:
Ethylacetat: Acid formic: HjO (8:1:1)
Ethyl acetat: Qiloroform: Acid formic (3:3:1) Toluen: Ethyl acetat: Aceton: Acid formic (5:2:2:1) Toluen: Ethyl acetat: Acid formic (5: 6:1)
Hệ VI: Toluen: Ethyl acetat: Acid formic (5:4:1)
Hệ VII: Benzen: Aceton (9:1)
-Thuốc thử hiện màu: Hơi amoniac và soi dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm và 365nm.
-Tiến hành: Chấm dịch chiết methanol ờ trên lên bản mỏng. Sấy nhẹ cho khô, đặt vào bình sắc ký đã bão hòa dung môi. Sau khi triển khai lấy bản mỏng ra khỏi bình sắc ký, sấy nhẹ 15 phút cho bay hết dung môi. Phát hiện vết dưới ánh tử ngoại. Sau đó hơ trên miệng lọ amoniac mở nút rồi quan sát dưới ánh sáng thường. Sau nhiều lần triển khai cho thấy hệ VII tách tốt nhất.
Kết quả định tính dịch chiết toàn phần bằng SKLM được trình bày ở bảng
2.2 v à h m h2.6.
Bảng 2.2: Kết quả định tính dịch chiết toàn phần với hệ dung môi v n
TT Rf X 100 M àu sắc vết u v (254 nm) u v (365 nm) 1 5,56 Hồng đậm 2 16,67 Nâu đ ậ m Nâu đậm 3 2 2 ,2 2 Hồng nhạt 4 27,78 Hồng nhạt 5 38,89 Nâu đậm Hồng đậm 6 44,44 Hồng nhạt 7 50,00 Nâu đậm Hồng đ ậ m 8 61,11 Hồng nhạt 9 77,78 Hồng đậm 1 0 88,89 Nâu đậm Hồng đậm
Nhận xét: Sau khi thăm dò 7 hệ dung môi, thấy hệ VII cho kết quả tách tốt nhất. Trên bản mỏng Silicagel dịch chiết toàn phần xuất hiện 10 vết với màu sắc, Rf và độ đậm khác nhau.
Hình 2.6. Ảnh SK đồ của dịch chiết toàn phần và
ƯV234ln) (hệ vn)
Hình 2.7. Ảnh Hình 2.8. Ảnh Hình 2.9. Ảnh SKĐAavonoid SKĐ coumarỉn SKĐ saponin
toàn phần toàn phần toàn phẩn (hệ II) (hệ UI) (hệ VI)
2.2.3. Nghiên cứu về flavonoid
2.13.1, Chiết xuất flavonoid
Cân chính xác khoảng 20g dược liệu đã xác định độ ẩm, cho vào túi làm bằng giấy lọc, đặt túi vào bình Soxhlet. Chiết bằng chloroform đến khi dịch chiết không còn màu xanh. Lấy túi dược liệu ra khỏi bình Soxhlet, để bay hết hcd chloroform tới khô rồi đặt lại vào bình, chiết tiếp bằng MeOH đến khi dịch chiết trong suốt (thử không cho màu vàng với NaOH IN). Tập trung dịch chiết MeOH, đem cất thu hồi dưới áp suất giảm, tiếp tục bay hoi trên nồi cách thủy đến khô thu được cắn B. Hòa tan cắn B vào nước nóng, đun cách thủy 30 phút, lọc nóng lần lượt qua một phễu có lót bông sau đó lọc qua giấy lọc gấp nếp. Lọc và tráng nhiều lần như vậy để loại tạp. Để nguội, gộp dịch lọc vào bình gạn, lắc với ethylacetat nhiều lần cho tới khi phần ethylacetat trong suốt không màu (thử không cho màu hồng vổi phản ứng Cyanidin). Gộp dịch chiết ethylacetat, cất thu hồi đung môi dưód áp suất giảm thu được cắn flavonoid (cắn F).( Hình 2.10).
2.2.3.2. Định tính flavonoid bằng SKLM
- Dịch chấm sắc ký: Flavonoid được chiết xuất theo qui trình mô tả ở mục 2.2.3.1 thu được cắn F. Hòa tan cắn F trong methanol để chấm sắc ký.
- Bản mỏng: Silicagel GF254 (MERCK) tráng sẵn, được hoạt hóa ở 110° c
trong Ih. Để nguội và bảo quản trong bình hút ẩm.
- Hệ dung môi khai triển: Tiến hành thăm dò trên các hệ dung môi: Hệ I: Chloroform: Methanol (9:1)
Hệ II: Ethylacetat: Acid formic: HjO (8:1:1)
Hệ III: Ethyl acetat: Chloroform: Acid formic (3:3:1) Hệ IV: Toluen: Ethyl acetat: Aceton: Acid formic (5:2:2:1) Hệ V: Toluen: Ethyl acetat: Acid formic (5: 6:1)
Hệ VI: Toluen: Ethyl acetat: Acid formic (5:6:1,5) Hệ VII: Toluen: Ethyl acetat: Acid formic (5:4:1)
- Thuốc thử hiện màu: hơi amoniac và soi dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm và 365nm.
- Tiến hành: ơ iấ m dịch chiết methanol ở trên lên bản mỏng. Sấy nhẹ cho khô, đặt vào bình sắc ký đã bão hòa dung môi. Sau khi triển khai lấy bản mỏng ra khỏi bình sắc ký, sấy nhẹ 15 phút cho bay hết dung môi. Phát hiện vết dưới ánh sáng tử ngoại. Sau đó hơ trên miệng lọ amoniac mở nút rồi quan sát dưới ánh sáng thường. Sau nhiều lần triển khai cho thấy hệ II tách tốt nhất.( Hình 2.7).
Kết quả định tính flavonoid toàn phần bằng SKLM chạy với hệ dung môi II sau khi hơ amoniac được trình bày ở bảng 2.3.
Vết M àu (NH3+ ánh sáng thường) Rf X 100 Độ đậm 1 Hồng 35,21 + 2 Vàng nâu 42,25 +++ 3 Nâu vàng 56,34 ++ 4 Nâu 63,38 ++ 5 Vàng 70,42 + 6 Vàng chanh 77,46 + 7 Nâu 88,73 +++ Ghi chú: (+): mờ. (++): đậm. (+++): rất đậm.
Nhận xét: Qua thăm dò 7 hệ dung môi, nhận thấy hệ II cho kết quả tách tốt nhất. Trên bản mỏng Silicagel, cắn flavonoid xuất hiện 7 vết với màu sắc, Rf và độ đậm nhạt khác nhau. Trong đó, vết 2 và vết 7 to và đậm nhất.
2.2.3.3. Định lượng flavonoid trong lá bạch đồng nữ
Flavonoid trong lá bạch đồng nữ được định lượng bằng phương pháp cân.
Tiến hành quy trình chiết xuất như ở mục 2.2.3.1 thu được cắn flavonoid toàn phần . Sấy cắn ở 70°c đến khối lượng không đổi, để nguội trong bình hút ẩm 30 phút rồi đem cân ngay. Kết quả xác định hàm lượng các phân đoạn được trình bày ở bảng 2.4.
Hàm lượng flavonoid được tính theo công thức:
m
x % = -xioo
M x ( l - a ) '
Trong đó : X : Hàm lượng % cắn thu được (%). m : Khối lượng cắn (g).
M : Khối lượng dược liệu dùng để chiết xuất (g). a : Độ ẩm của dược liệu (%).
TT Khối lượng Độ ẩm Khối lượng cắn Hàm lượng dược liệu(g) a(%) flavonoid(g) flavonoid(%)
1 20,01 11,79 0,3502 1,98 2 21,38 11,79 0,3005 1,59 3 20,54 11,79 0,3125 1,72 4 20,73 11,79 0,3239 1,78 5 21,04 11,79 0,3327 1,79 TB 20,74 11,79 0,3239 1,77± 0,10
Bằng phương pháp cân, sơ bộ định lượng flavonoid toàn phần trong lá bạch đồng nữ có hàm lượng là: 1,77 ± 0,10%.
2.2.4. Nghiên cứu về coumarin2.2.4.I. Chiết xuất coumarin 2.2.4.I. Chiết xuất coumarin
Cân chính xác một lượng khoảng 30g bột dược liệu, cho vào túi làm bằng giấy lọc, đặt túi vào bình Soxhlet. Chiết bằng chloroform đến khi dịch chiết trong bình trong suốt (thử phản ứng đóng mở vòng lacton và phản ứng với thuốc thử Diazo).Thu lấy dịch chiết chloroform, cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm dến còn khoảng 50 ml, đem lắc nhiều lần với dung dịch NaOH IM, mỗi lần khoảng 10 ml gạn lấy phần nước. Tập trung dịch chiết nước, acid hóa bằng HCl đậm đặc đến pH = 3 - 4, cô cách thủy cho cạn bớt, làm nguội. Lắc phần dịch này với chloroform nhiều lần, mỗi lần khoảng 10 ml cho đến kiệt coumarin (kiểm tra bằng phản ứng với thuốc thử Diazo). Gộp dịch chiết chloroform rửa nhiều lần bằng nước cất cho đến khi phần nước có pH trung tính (thử bằng giấy chỉ thị màu vạn năng). Cô cạn dịch chloroform trên nồi cách thủy đến khô thu được cắn coumarin (cắn C). (Hình 2.11).
2.2A.2.Định tính coumarin bằng SKLM
- Dịch chấm sắc ký: Coumarin được chiết xuất theo qui trình mô tả ở mục 2.2.4.1 thu được cắn c. Hòa tan cắn c trong methanol để chấm sắc ký.
- Bản mỏng: Silicagel GF254(MERCK) tráng sẵn, được hoạt hóa ở 110° c
trong Ih. Để nguội và bảo quản trong bình hút ẩm.
- Hệ dung môi khai triển: Tiến hành thăm dò với các hệ dung môi:
Hệ I: Qiloroform: Ethyl acetat: Methanol (9:1,5: 1)
Hệ II: Chloroform: Ethyl acetat: Methanol (9: 1,5: 0,5) Hệ III: Cloroform: Ethyl acetat: Acid formic (3: 3; 1) Hệ IV: Benzen: Ethyl acetat (9: 1)
HệV: Benzen: Aceton (9:1)
Hệ VI: Benzen: Aceton: Methanol (9: 1,5: 0,5)
- Thuốc thử hiện màu: Soi dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 365 nm.
- Tiến hành: Chấm dịch chiết methanol ở trên lên bản mỏng. Sấy nhẹ cho khô, đặt vào bình sắc ký đã bão hòa dung môi. Sau khi triển khai lấy bản mỏng ra khỏi bình sắc ký, sấy nhẹ 15 phút cho bay hết dung môi. Soi dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 365 nm.
Sau nhiều lần triển khai cho thấy hệ III tách tốt nhất. (Hình 2.8).
Kết quả định tính coumariĩi bằng SKLM chạy với hệ dung môi III được trình bày ở bảng 2.5.
Vết M àu sắc (ưv- 365 nm) RfXlOO Độ đậm 1 Xanh sáng 20,55 + 2 Vàng chanh 21,67 + 3 Vàng chanh 46,67 + 4 Xanh sáng 60,00 + 5 Hồng 66,67 ++ 6 Xanh sáng 83,33 + 7 Nâu đậm 90,00 +++ 8 Xanh sáng 91,67 ++ 9 Hồng 92,45 +++ 10 Xanh sáng 93,57 ++ 11 Hồng 96,67 +++ Ghi chú: (+): mờ. (++): đậm. (+++); rất đậm.
Nhận xét: Qua thăm dò 6 hệ dung môi khác nhau, thấy hệ III cho kết quả tách tốt nhất. Trên bản mỏng Silicagel, cắn coumarin xuất hiện 11 vết với màu sắc, Rf và độ đậm khác nhau.
2.2A.3. Định lượng coum arin
Coumarin trong lá bạch đồng nữ được định lượng bằng phương pháp cân.
Tiến hành chiết xuất theo qui trình ở mục 2.2.4.1 thu được cắn coumarin. Sấy cắn ở 50°Cđến khối lượng không đổi, để nguội trong bình hút ẩm 30 phút thu được coumarin toàn phần sấy khô và cân ngay. Kết quả hàm lượng coumarin được tính theo công thức
m x% = •xioo Trong đó: X m M a M x ( l - a ) '
Hàm lượng % cắn thu được (%). Khối lượng cắn (g).
Khối lượng dược liệu dùng để chiết xuất (g). Độ ẩm của dược liệu (%).
Khối lượng
dược liệu (g) Độ ẩm a(%)
Khối lượng cắn coumarin(g) Hàm lượng coumarin (%) 1 30,14 11,79 0,4006 1,51 2 30,11 11,79 0,3806 1,43 3 31,48 11,79 0,3953 1,42 4 30,49 11,79 0,3794 1,41 5 30,89 11,79 0,4105 1,51 TB 30,62 0,3933 1,46± 0,06
Nhận xét: Bằng phương pháp cân, sơ bộ định lượng coumarin trong lá bạch đồng nữ có hàm lượng là 1,46± 0,06%.
2.2.5. Nghiên cứu về saponin2.2.5.I. Chiết xuất saponin 2.2.5.I. Chiết xuất saponin
Cân chính xác khoảng 20g bột dược liệu vào túi giấy lọc, đặt túi giấy lọc vào bình Soxhlet, chiết bằng ether dầu hoả cho đến khi dịch chiết trong bình trong suốt. Túi bã dược liệu được lấy ra và để cho bay hết ether dầu hoả. Sau đó tiếp tục chiết bằng methanol 80% trong bình Soxhlet cho tới khi dịch chiết trong suốt và không cho phản ứng với acid sulfuric đặc. Dịch chiết methanol đem cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm được dịch chiết methanol đậm đặc (cao lỏng), sau đó lắc kĩ với ether dầu hoả để loại tạp. Phần cao lỏng đem lắc với n- butanol (đồng thể tích) cho đến hết saponin (thử với phản ứng Salkowski). Cất thu hồi n- butanol dưới áp suất giảm đến dạng cao đặc. Hoà cao trong một lượng methanol vừa đủ sau đó thêm một lượng ether ethylic gấp 10 lần, saponin toàn phần kết tủa. Gạn lọc phần ether ethylic ra, tủa tiếp tục làm lại như trên 1 -2 lần. Lọc lấy tủa, để cho bay hơi hết ether, sấy nhẹ tủa ở 40-50°C, thu được saponin toàn phần ( cắn S). (Hình2.12 ).
2.2.S.2. Định tính saponin bằng SKLM
- Dịch chấm sắc ký: Saponin được chiết xuất theo qui trình mô tả ở mục 2.2.5.1 thu được cắn s. Hòa tan cắn s trong methanol để chấm sắc ký.
- Bản mỏng: Silicagel GF254(MERCK) tráng sẵn, được hoạt hóa ở 110° c trong Ih. Để nguội và bảo quản trong bình hút ẩm.
- Hệ dung môi khai triển:
Hệ I: Chloroform: Methanol: H2O (64: 50: 10)
Hệ II: Toluen: Ethylacetat: Acid Formic: H2O (6: 5: 1,5: 1) Hệ III: Chloroform: Ethyl acetat: Methanol (9: 1,5: 0,5) Hệ IV: n-Butanol: Ethyl acetat: H2O (4:1:1)
Hệ V : Ethylacetat: Acid acetic: HjO (3: 1: 3) Hệ VI: n-Butanol: Acid acetic: H2O (4; 1: 5) - Thuốc thử hiện màu: Soi dưới đèn tử ngoại.
- Tiến hành: Chấm dịch chiết methanol ở trên lên bản mỏng. Sấy nhẹ cho khô, đặt vào bình sắc ký đã bão hòa dung môi. Sau khi triển khai lấy bản mỏng ra khỏi bình sắc ký, sấy nhẹ 15 phút cho bay hết dung môi. Quan sát dưới ánh sáng thường.
Sau nhiều lần triển khai cho thấy hệ VI tách tốt nhất. (Hình2.9). Kết quả định tính saponin bằng SKLM được trình bày ở bảng 2.7.
Bảng 2.7: Kết quả định tính saponin bằng SKLM với hệ dung môi VI
Vết Màu (ánh sáng thường) Rf X 100 Độ đậm 1 Xanh nâu 25,00 ++ 2 Hồng 37,50 ++ 3 Vàng nâu 68,75 +++ 4 Vàng 81,25 ++ Ghi chú: (++): đậm. (+++): rất đậm.
Nhận xét: Qua thăm dò 6 hệ dung môi khác nhau, thấy hệ VI cho kết quả tách tốt nhất. Trên bản mỏng Silicagel, cắn saponin xuất hiện 4 vết với màu sắc, Rf và độ đậm khác nhau.
2.2.S.3. Định lượng saponin
Saponin trong lá bạch đồng nữ được định lượng theo phương pháp cân. Tiến hành chiết xuất theo qui trình ở mục 2.2.5.1, thu được cắn saponin toàn phần. Sấy cắn ờ 40- 50® c đến khối lượng không đổi, để nguội trong bình hút ẩm 30 phút, sấy khô và cân ngay. Kết quả hàm lượng saponin được tính theo công thức: m x% = -xioo Trong đó: X m M a M X ( l - a )
Hàm lượng % cắn thu được (%). Khối lượng cắn (g).
Khối lượng dược liệu dùng để chiết xuất (g). Độ ẩm của dược liệu (%).
Bảng 2.8: Kết quả xác định hàm lượng saponin toàn phần
TT Khối lượng
dược liệu(g) Độ ẩm a(% )
Khối lượng cắn saponin (g) Hàm lượng saponin (% ) 1 20,54 11,79 0,2046 1,13 2 20,34 11,79 0,1895 1,06 3 20,05 11,79 0,2045 1,16 4 20,29 11,79 0,1950 1,09 5 20,15 11,79 0,2235 1,26 TB 20,28 11,79 0,2154 1,14± 0,09
Nhận xét: Bằng pliương pháp cân, sơ bộ định lượng saponin toàn phần trong lá bạch đồng nữ có hàm lượng là 1,14± 0,09%.
2.2.6. Thử độc tính cấp
Cao chiết bằng nước từ lá bạch đồng nữ (Cỉerodendrum chínense var. simplex (Moldenke)S.L.Chen ) được khảo sát về độc tính cấp nhằm xác định độ an toàn của dược liệu để phục vụ việc nghiên cứu tác dụng sinh học và điều trị.
2.2.6.I. Chế phẩm thử
Dịch nước sắc lá khô bạch đồng nữ {Clerodendrum chínense var. simplex (Moldenke) S.L.Chen ) dạng cao lỏn g có tỉ lệ là (4:1).
2.2.Ó.2. Tiến hành
Thử độc tính cấp của dịch nước sắc lá khô bạch đồng nữ theo phương pháp của Behrens - Karber. Qiuột nhắt trắng có trọng lượng 20 ± 2 gam, khoẻ mạnh, không phân biệt giống do Viện Vệ sinh Dịch tễ cung cấp được chia ngẫu nhiên thành lô, mỗi lô 6 con. Trước khi thí nghiệm, để chuột nhịn đói 16 giờ. Cho chuột uống chế phẩm thử bằng kim cong đầu tù đủ mức liều quy định cho từng lô, thể tích 0,2 ml/lOg chuột, với các mức liều tăng dần (có thể làm đậm đặc thuốc để giảm thể tích thuốc nếu cần). Sau khi cho uống thuốc, chuột được nhốt riêng từng lô, theo dõi, quan sát các biểu hiện của chuột và ghi số chuột chết trong 72 giờ. Chuột chết được mổ để kiểm tra đại thể.
2.2.Ố.3. Kết quả
Bảng 2.9. Kết quả thử độc tính cấp trên các lô chuột
Nhóm Liều (g/kg) Số chuột thử (n¡) Số chuột chết (r¡) Hiệu 2 liều kế tiếp (d) Số chuột chết trung bình 2 lần kế tiếp (a) Tích a.d Tỷ lệ % chuột chết (%) 1 120 6 0 0 0 0 2 140 6 1 20 0,5 10 17 3 160 6 2 20 1,5 30 33 4 180 6 3 20 2,5 50 50 5 200 6 5 20 4 80 83 6 220 6 6 20 5,5 110 100 Tổng 36 280
Liều LD50 được tính theo công thức sau: LD =LD ^ ^ 5 0 - ^ M o o n,b = 173(g/kg) Trong đó: = ỉ ^ = 6 LD50 : Liều chết 50% số chuột. LDioo : Liều chết 100% số chuột. K : Số nhóm thí nghiệm.
Kết luận: Sau khi tiến hành thử độc tính cấp trên chuột nhắt bằng phương pháp Behrens- Karber, chúng tôi đã xác định được dịch nước sắc của lá bạch đồng nữ có độc tính với LD50= 173 g/kg.
PHẦN 3
KẾT LUẬN VÀ ĐỂ XUẤT
3.1. KẾT LUẬN
Sau thời gian thực nghiệm, chúng tôi đã thu được những kết quả sau:
Về thực vật:
❖ Đã mô tả và phân tích đặc điểm thực vật của cây nghiên cứu. Căn cứ vào các đặc điểm cành, lá, hoa, mẫu nghiên cứu đã được kiểm định tên khoa học là:
Clerodendrum chínense var. simplex (Moldenke) S.L.Chen =
Cỉerodendrum philippinum var. simplex Moldenke, thuộc họ c ỏ roi ngựa
(Verbenaceae).
*1* Đã xác định đặc điểm vi phẫu lá, vi phẫu thân, đặc điểm bột lá, tiến hành giải phẫu hoa, lá, cành góp phần tiêu chuẩn hoá và kiểm nghiệm dược liệu, chống nhầm lẫn khi sử dụng.
Vê thành phần hóa học:
Kết quả định tính các nhóm chất bằng phản ứng hóa học cho thấy trong lá bạch đồng nữ (Cỉerodendrum chínense var. simplex (Moldenke) S.L.Ơien) có flavonoid, coumarin, saponin, đường khử, tanin, sterol, acid amin,