L ời cam đ oan
3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của của đề tài
2.3.2. Phương pháp nghiên cứu phòng thí nghiệm
- Tách chiết và tinh sạch ADN theo phương pháp CTAB cải tiến (của phòng thí nghiệm Di truyền học, Trường đại học Gent, Vương Quốc Bỉ).
- Chọn lọc cây con mang QTL/gen tăng số hạt trên bông thông qua phương pháp PCR đối với các chỉ thị SSR liên kết với QTL quy định tính trạng tăng số hạt trên bông. Chọn lọc nền gen thông qua phương pháp PCR đối với các chỉ thị phân bố trên 12 NST lúa.
- Điện di trên gel agarose 0,8% nhuộm Ethidium Bromide. - Điện di trên gel agarose 3% nhuộm Ethidium Bromide - Điện di trên gel polyacrylamide biến tính 4,5% nhuộm bạc.
- Phân tích dữ liệu trên chương trình Graphical Genotyper (GGT2) (Van Berloo, 2008).
2.3.2.1. Phương pháp tách chiết ADN tổng số
ADN lúa được tách chiết và tinh sạch theo phương pháp CTAB cải tiến (của phòng thí nghiệm Di truyền học, Trường đại học Gent, Vương Quốc Bỉ)
Các bước tiến hành
Phương pháp CTAB cải tiến trên cơ sở phương pháp của Shagai – Maroof (năm 1984). Quy trình thực hiện gồm các bước:
2.3.2.2. Phương pháp PCR với mồi SSR
Các thành phần tham gia vào phản ứng PCR được chuẩn bị trong tấm PCR plate 96 giếng. Thành phần, hàm lượng của các chất trong mỗi phản ứng như trong bảng 2.1.
Bảng 2.3. Thành phần các chất dùng cho mỗi phản ứng PCR với mồi SSR
STT Thành phần Thể tích (µl)
1 H2O cất khử trùng 8.95
2 Buffer 10X 1,5
3 MgCl2 (50mM) 0,45
4 dNTP (1mM) 1,0
5 Taq ADN polymeraza (5U) 0,1
6 Primer forward 5µM 0,5
7 Primer Revert 5µM 0,5
8 ADN (35ng/ µl) 2,0
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 30
Sau khi đã có đủ thành phần, hàm lượng các chất cần thiết, tiến hành đặt chương trình chạy cho máy. Chu trình nhiệt trong máy PCR như sau:
Bảng 2.4. Chương trình chạy của phản ứng PCR
Bước Nhiệt độ (oC) Thời gian Số chu kỳ
1 94 5 phút 1 2 94 30 giây 35 55* 30 giây 72 45 giây 3 72 5 phút 1 4 10 ∞ 1
(*): Nhiệt độ gắn mồi - có thể thay đổi tùy theo từng cặp mồi SSR cụ thể
2.3.2.3. Phương pháp điện di trên gel agarose 0,8% Các bước tiến hành:
- Cân 0.8g agarose, đong 100ml TBE 0,5X (5,4g Tris base; 2,76g axít boric; 2ml 0,5M EDTA, pH = 8,0) cho vào bình tam giác.
- Đun trong lò vi sóng cho đến khi tạo thành một dung dịch đồng nhất.
- Để nguội đến khoảng 50 - 600C, thêm 5µl ethidium bromide (10 mg/ml) và lắc đều.
- Chuẩn bị khay và lược. Đổ dung dịch agarose vào khay sao cho không có bọt khí. Chờ khoảng 45 - 60 phút gel đông.
- Rút lược, đặt gel vào bểđiện di. Đổ 0,5X TBE ngập mặt gel khoảng 2mm. - Tra sản phẩm PCR đã được trộn với Xylen cyanol vào giếng. tỷ lệ 5µl Xylen cyanol /15µl mẫu. Thời gian và điện thế sử dụng đểđiện di dài hay ngắn phụ thuộc vào kích thước của cặp mồi SSR cần kiểm tra. Các mẫu chạy với ladder 25 bp.
- Soi gel trên máy soi cực tím, đọc và ghi nhận kết quả.
2.3.2.4. Phương pháp điện di trên gel agarose 3% Các bước tiến hành:
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 31
2.3.2.5. Phương pháp điện di trên gel polyacrylamide 4,5%
Chuẩn bị dung dịch 4,5%,acrylamide từ dung dịch gốc 40% acrylamide (19:1 = acrylamide 380g; bisacrylamide 20g trong 1 lít dung dịch)
Chuẩn bị kính:
- Lau kỹ bề mặt hai tấm kính 3 lần bằng nước cất, sau đó lau lại 3 lần bằng ethanol 95%, để khô sau mỗi lần lau.
- Lau tấm kính dài với giấy lụa tẩm Rain-X . Để 5 phút cho khô dung dịch.
Chú ý. Tránh làm dính dung dịch này lên tấm kính ngắn.
- Lau tấm kính ngắn với dung dịch dính (Binding solution) được tạo thành bằng cách thêm 2µl Bind Silane vào 1ml chứa 95% ethanol và 5% glacial acetic acid.
- Để cho tấm kính khô, lau tiếp bằng ethanol 95% 1 lần.
- Lắp ghép 2 tấm kính lại với nhau, sử dụng nẹp Sigma 0,4mm.
Chuẩn bị gel polyacrylamide:
Chuẩn bị dung dịch 4,5% acrylamide từ dung dịch gốc 40% acrylamide (19:1 = acrylamide 380g; bisacrylamide 20g pha trong 1 lít nước)
- Đổ 60ml dung dịch 4,5% acrylamide (25,2 Urea: 6ml TBE 10X: 6,75ml acrylamide/bis-acrylamide 40% (19:1) vào 1 cốc đong 100ml. Thêm 300µl 10% APS (ammonium persulfate) và 60µl TEMED (N,N,N’,N’-Tetraethyl - ethylendiamine), trộn đều.
- Bơm dung dịch gel vào giữa hai tấm kính sao cho không có bọt khí.
- Cài lược vào giữa hai tấm kính (răng lược hướng ra phía ngoài). Dùng kẹp cốđịnh lược.
- Để gel polyme hóa trong 1 - 2 giờ.
Điện di:
- Tháo lược và loại bỏ hết các mảnh gel thừa bám trên mặt tấm kính. - Lắp ráp bộđiện di. Cho 1 lít đệm TBE 1X vào buồng đệm trên và dưới. - Dùng xylanh đuổi hết bọt khí ở bề mặt phía trên của khuôn gel.
- Chạy tiền điện di (prerun) với cường độ dòng điện là 50 - 60A, công suất 92 - 100W.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 32
trong đá và phủđá lên trên ít nhất 5 phút.
Sản phẩm PCR lúc này đã được trộn với 4µl Sequencing Stop solution (10mM NaOH: 95% formamid: 0,05% bromphenol; 0,05% xylene cyanol).
- Tra vào mỗi giếng 5µl sản phẩm PCR đã được làm biến tính, các mẫu chạy với ladder 50 bp.
Thời gian tra mẫu không kéo dài quá dài để gel không bị nguội đi nhiều. - Tiến hành điện di với công suất 60W và ở 500C, thời gian chạy ngắn hay dài tùy kích thước từng mồi sử dụng.
Phương pháp nhuộm bạc:
+ Chuẩn bị các dung dịch
- Dung dịch cố định/dừng phản ứng (Fix/Stop solution): gồm có 100ml glacial acetic acid và 900ml nước cất.
- Dung dịch nhuộm (Staining solution) được tạo thành bằng cách hòa tan 1g bạc nitrat (AgNO3) vào 1 lít nước cất, sau đó bổ sung thêm 1,5ml formaldehyd
(H2CO) 37%.
- Dung dịch hiện (Developing solution): Hòa tan 30g natri cacbonat (Na2CO3) trong 1 lít nước cất và làm lạnh ở -200C.
Chú ý: (Trước khi sử dụng thêm 1,5ml formaldehyd (H2CO) 37% và 200µl natri thiosulfat 10% (Na2S2O.5H2O).
+ Tiến hành nhuộm
Sau khi chạy điện đi, tháo gỡ tấm kính bám gel và tiến hành các bước sau:
- Cốđịnh gel: Đặt tấm kính vào khay sao cho mặt bám gel hướng lên trên, đổ
dung dịch cố định/dừng phản ứng và để trong khoảng 30 phút. Sau đó lấy gel ra khỏi dung dịch.
Chú ý: Giữ lại dung dịch này để dùng cho bước sau.
- Rửa gel bằng nước cất 2 lần mỗi lần 5 phút. Cho gel vào dung dịch nhuộm, lắc nhẹ trong 30 phút. Thêm formaldehyd và sodium thiolsufat vào dung dịch hiện. Lấy gel ra khỏi dung dịch nhuộm, rửa lại bằng nước cất trong 5 - 10 giây.
- Đưa gel vào dung dịch hiện và lắc nhẹđến khi các băng xuất hiện. Cho gel vào dung dịch cốđịnh/dừng phản ứng ở trên trong 3 - 6 phút. Rửa lại gel bằng nước cất. Để gel khô tự nhiên sau đó ghi nhận kết quả.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 33