Trong quá trình điều chế cao khô Giảo cổ lam, các giai đoạn cô đặc và sấy khô được tiến hành theo phương pháp chung trong sơ đồ 2.1. Chúng tôi chỉ đi sâu vào nghiên cứu giai đoạn chiết xuất nhằm lựa chọn được phương pháp chiết xuất hiệu quả nhất cho 2 nhóm chất chính trong cây là Flavonoid và Saponin.
2.2.2.1. Lựa chọn phương pháp và dung môi chiết xuất
13 Sử dụng phương pháp ngâm lạnh và phương pháp ngấm kiệt với các dung môi EtOH.70%, EtOH.60%, và EtOH.50%. Vì;
- Phương pháp ngâm lạnh và ngấm kiệt:
+ Có thể chiết được khá nhiều hoạt chất trong dược liệu. + Phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm.
- Các dung môi EtOH.70%, EtOH.60%, và EtOH.50%:
+ Có thể hòa tan các nhóm chất cần chiết trong Giảo cổ lam (Flavonoid, Saponin) và có khả năng hòa tan chọn lọc.
+ Nhiệt độ sôi thấp nên có thể cô đặc nhanh ở nhiệt độ thấp, bảo vệ dược chất.
+ Thích hợp với phương pháp ngâm lạnh, ngấm kiệt. + Phổ biến, rẻ tiền, ít độc hại.
s Sử dụng phương pháp sắc với dung môi H2O. Vì: + Phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm. + Dung môi sẵn có, không độc hại.
2.22.2, Chọn độ mịn của bột dược liệu và dung môi phù hợp nhất
E Sử dụng phương pháp ngấm kiệt:
Chúng tôi tiến hành chiết xuất theo phương pháp đã nêu trong mục 2.1.2.1. với thời gian ngâm 36 giờ, sau đó định lượng Saponin và Flavonoid trong cao khô thu được theo phương pháp ghi trong mục 2.1.2.2.
Làm với 3 dung môi:
- EtOH.70%. - EtOH.60%. - EtOH.50%.
Và 3 mức độ mịn khác nhau của bột dược liệu:
- Độ mịn 1: Xay dược liệu qua máy xay (cỡ rây 1,5 mm).
- Độ mịn 2: Xay dược liệu qua máy xay và rây qua rây 1,0 mm. - Độ mịn 2; Xay dược liệu qua máy xay và rây qua rây 0,5 mm.
Đánh giá hiệu quả chiết xuất của các dung môi đối với mỗi độ mịn của bột dược liệu. Kết quả được trình bày ở các bảng 2,4, 2.5, 2.6 và các
hình 2.1, 2.2.
Bảng 2.4: Hiệu quả chiết xuất của các dung môi đối với độ mịn 1
Dung môi EtOH.70% EtOH.60% EtOH.50%
Khối lượng dược liệu (g) 30.1250 29.2973 30.7511
Độ ẩm dược liệu (%) 9.37 9.37 9.37
Khối lượng cao khồ tạo ra (g) 4.3174 4.7849 5.1791
Độ ẩm cao khô (%) 4.24 4.31 4.09
Hàm lượng Saponin/cao khô (%) 19.27 19.80 17.99 Hàm lượng Flavonoid/cao khô (%) 8.76 8.52 7.58 Hiệu suất chiết Saponin (%) 63.30 74.08 69.55
Hiệu suất chiết Flavonoid (%) 61.41 68.02 62.55
Nhận xét: ở độ mịn 1, dung môi EtOH.60% đạt hiệu quả chiết xuất cao nhất đối với cả Flavonoid và Saponin (68.02% đối với Flavonoid và 74.08% đối với Saponin), sau đó là dung môi EtOH.50%, và thấp nhất là EtOH.70%.
Bảng 2.5: Hiệu quả chiết xuất của các dung môi đối với độ mịn 2
Dung môi EtOH.70% EtOH.60% EtOH.50%
Khối lượng dược liệu (g) 29.9524 30.0837 30.0474
Độ ẩm dược liệu (%) 7.63 7.63 7.63
Khối lượng cao khô tạo ra (g) 4.5403 5.1074 5.2611
Độ ẩm cao khô (%) 4.25 4.83 4.71
Hàm lượng Saponin/cao khô (%) 19.22 19.79 17.89 Hàm lượng Flavonoid/cao khô (%) 8.76 8.49 7.59 Hiệu suất chiết Saponin (%) 65.51 75.12 70.09
Hiệu suất chiết Flavonoid (%) 63.70 68.72 63.52
Nhận xét: ở độ mịn 2, hiệu suất chiết xuất của dung môi EtOH.60% vẫn cao nhất (68.72% đối với Flavonoid và 75.12% đối với Saponin); Trong 2 dung môi còn lại, EtOH.50% chiết Saponin tốt hơn nhưng hiệu qủa chiết Flavonoid lại thấp hơn chút ít so với dung môi EtOH70%.
Bảng 2.6: Hiệu quả chiết xuất của các dung môi đối với độ mịn 3
Dung môi EtOH.70% EtOH.60% EtOH.50%
Khối lượng dược liệu (g) 30.0961 30.1163 30.2581
Độ ẩm dược liệu (%) 7.37 7.37 737
Khối lượng cao khô tạo ra (g) 5.0356 5.6219 4.7077
Độ ẩm cao khô (%) 4.81 4.90 4.26
Hàm lượng Saponin/cao khô (%) 18.52 1122 15.75 Hàm lượng Flavonoid/cao khô (%) 8.28 7.96 7.29 Hiệu suất chiết Saponin (%) 69.07 71.59 54.94
Hiệu suất chiết Flavonoid (%) 65.92 70.66 54.27
Nhận xét: Đối vói độ mịn 3, EtOH.60% vẫn là dung môi cho hiệu quả chiết xuất cao nhất (70.66% đối vói Flavonoid và 71.59% đối vói Saponin), tiếp theo là EtOH.70%, và thấp nhất là hiệu suất của dung môi EtOH50%.
Sự thay đổi hiệu quả chiết xuất của các dung môi theo độ mịn của bột dược liệu được chúng tôi biểu diễn thông qua 2 đồ thị sau:
Hiệu suát chiết Saponin (%) 60 40 20 74.08. 63.3 ‘69.5565.5J |70.09 69,07 Độ mịn 1 Độ mịn 2 ■ Độ mịn 3 □ EtOH.70% □ EtOH.60% □ EtOH.50% Độ mịn DL
Hinh 2.1: Đồ thị biểu diễn hiệu quả chiết xuất Saponin của các DM đối với cấc độ mịn.
Hiệu suát chiết Flavonoid (%) 80 70 60 50 40 30 20 10 0 61.41 68.02 . □ EtOH.70% ■ EtOH.60% □ EtOH.50% Độ mịn 1 Độ mịn 2 Độ mịn 3 Độ mịn DL
Hình 2.2 : Đồ thị biểu diễn hiệu quả chiết xuất Flavonoid của các DM đối với các độ mịn.
Nhận xét: Dựa vào 2 đồ thị, cho thấy: dung môi EtOH.60% đạt hiệu quả chiết xuất Saponin và Flavonoid cao nhất ở cả 3 độ mịn. Với độ mịn 2 (có kích thước nhỏ hơn độ mịn 1) thì cả 3 dung môi đều tăng hiệu quả chiết xuất. Tuy nhiên khi dược liệu được nghiền quá mịn (độ mịn 3) thì hiệu quả của dung môi EtOH.50% bị giảm đáng kể, dung môi EtOH.70% vẫn đạt hiệu quả chiết xuất cao hcfn so với 2 độ mịn còn lại, dung môi EtOH.60% có hiệu suất chiết Flavonoid cao hơQ 1.94% nhưng lại giảm hiệu suất chiết Saponin 3.53%.
Sử dụng phương pháp sắc:
Tiến hành chiết xuất theo phương pháp đã nêu trong mục 2,1.2.1. rồi định lượng hàm lượng Saponin và Flavonoid trong cao thu được theo phưoíng pháp được ghi ở mục 2.1.2.2., kết quả được trình bày ở bảng 2.7.
Bảng 2.7: Hiệu quả chiết xuất của phương pháp sắc
Khối lượng dược liệu (g) 53.1697
Độ ẩm dược liệu (%) 9.31
Khối lượng cao khô tạo ra (g) 15.7726
Độ ẩm cao khô (%) 4.18
Hàm lượng Saponin/cao khô (%) 11.18
Hàm lượng Flavonoid/cao khô (%) 4.68
Hiệu suất chiết Saponin (%) 76.01
Hiệu suất chiết Flavonoid (%) 67.93
Nhận xét: Bảng 2.7 cho thấy;
- Hiệu quả chiết xuất Saponin của phương pháp sắc cao hơn phương pháp ngấm kiệt (76.01%), nhưng cao hơn không đáng kể so với hiệu suất của dung môi EtOH.60% ở độ mịn 2; Hiệu suất chiết Flavonoid cũng khá cao (67.93%), chỉ kém dung môi EtOH.60%.
- Tuy nhiên sử dụng phương pháp này thì hàm lượng tạp chất trong cao chiếm tỉ lệ cao hơn hẳn (hàm lượng Saponin trong cao chỉ chiếm 11.18% và Flavonoid trong cao là 4.68%).
Kết luận: Từ các kết quả trên, chúng tôi lựa chọn phương pháp ngấm kiệt với dung môi EtOH.60% và độ mịn 2 để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.
2.2.23. Lựa chọn thời gian ngẩm cho phương pháp ngâm kiệt
Tiến hành làm ẩm bột dược liệu và ngâm theo kỹ thuật ngâm kiệt chung (mục 2,1.2.1.)- Định lượng dịch ngâm sau các khoảng thời gian 24 giờ, 36 giờ, và 48 giờ theo phương pháp ghi trong mục 2.1.2.2.
Kết quả được thể hiện trong bảng 2.8.
Bảng 2.8: Kết quả khảo sát thời gian ngâm
Thời gian ngâm 24 giờ 36 giờ 48 giờ
Khối lượng dược liệu (g) 29.9838 28.3973 29.7048
Độ ẩm dược liệu (%) 7.64 7.64 7.64
Khối lượng Saponin (g) 0.6231 0.5897 0.6146
Hiệu suất chiết Saponin (%) 48.81 48.77 48.59
Khối lượng Flavonoid (g) 0.1899 0.1756 0.1881
Hiệu suất chiết Flavonoid (%) 31.75 31.00 31.75
Nhận xét: Sau khoảng thời gian 24 giờ, nồng độ Saponin và Flavonoid không tăng thêm trong dịch ngâm. Vậy chúng tôi lựa chọn thòi gian ngâm là 24 giờ.
2.2.2A. Lựa chọn tỷ lệ DM/DL cho phương pháp ngấm kiệt
Tiến hành chiết xuất theo phưcmg pháp ngấm kiệt với dung môi và độ mịn dược liệu đã chọn ở trên. Rút dịch chiết và để riêng dịch chiết sau các thời điểm tỉ lệ DM/DL đạt 6/1, 8/1, 10/1, và 12/1, rồi định lượng Saponin và Flavonoid trong các dịch chiết này (theo phưcmg pháp ghi trong mục 2.1,2.2.).
Kết quả được trình bày ở bảng 2.9.
Bảng 2.9: Hiệu quả chiết xuất đối với các tỷ lệ DM/DL
Tỷ lệ DM/DL 6/1 8/1 10/1 12/1
Khối lượng dược liệu (g) 29.7348
Độ ẩm dược liệu (%) 9.71
Khối lượng Saponin (g) 0.7548 0.8743 0.9318 0.9458 Hiệu suất chiết Saponin (%) >60.99 70.64 75.29 76.42
Khối lượng Flavonoid (g) 021A6 0.3615 0.3995 0.4056 Hiệu suất chiết Flavonoid (%) 47.36 62.34 68.89 69.96
Hàm luting chiếtí|f^.c(%) 75- 50 - 25- 0 - 5 6 7 8 9 10 11 12 13
Hình 2.1: Sự thay đổi hàm ỉượng Saponin và Flavonoid chiết được với các tỷ lệ DM/DL khác nhau.
Nhận xét: Khi tỷ lệ DM/DL lớn hom 10/1 thì lượng Saponin và Flavonoid thu thêm được trong dịch chiết là không đáng kể. Vậy chúng tôi lựa chọn tỷ lệ DM/DL là 10/1.
2.22.5. So sánh hiệu quả chiết xuất của phương pháp ngâm lạnh và phương pháp ngấm kiệt
Tiến hành chiết xuất dược liệu bằng phương pháp ngâm lạnh theo phương pháp ghi trong mục 2.1.2.1. với thời gian ngâm cho mỗi lần là 24 giờ.
Áp dụng với tỷ lệ DM/DL là 10/1 như đã chọn và so sánh hiệu quả với phương pháp ngấm kiệt,
Kết quả được trình bày ờ bảng 2.10.
Bảng 2.10: Kết quả khảo sát hiệu quả chiết xuất của phương pháp ngâm lạnh
Lần ngâm 1 Lần ngâm 2 Tổng
Khối lượng dược liệu (g) 31.4853
Độ ẩm dược liệu (%) 7.61
Tỷ lệ DM/DL dùng để ngâm lạnh 6/1 4/1 10/1
Khối lượng Saponin (g) 0.7296 0.2252 0.9548
Hiệu suất chiết Saponin (%) 'ễm»s4.4i 16.79 Y^:7120ỵr \
Khối lượng Flavonoid (g) 0.2248 0.1025 0.3274 Hiệu suất chiết Flavonoid (%) 35.78 16.32 52.10
Nhận xét: Với cùng tỷ lệ DM/DL, so với phương pháp ngấm kiệt thì phưcmg pháp ngâm lạnh có một số ưu - nhược điểm sau:
- Nhược điểm: + Hiệu suất chiết Saponin thấp hơn 3.92%. + Hiệu suất chiết Flavonoid thấp hơn 16.62%. + Cần nhiều thời gian hơn 20 giờ.
Kết luân; Dựa vào kết qủa thực nghiệm ở trên, chúng tôi đề xuất phương pháp chiết xuất cho Giảo cổ lam:
- Phương pháp chiết: Phương pháp ngấm kiệt với các thông số kỹ thuật ghi trong mục 2.1.2.1.
Độ mịn 2. EtOH.60%. 24 giờ.
10/1.
2.2.2.6. Khảo sát tính ổn định của phương pháp chiết xuất
Để kiểm tra tính ổn định của phương pháp chiết xuất vừa xây dựng được, chúng tôi sử dụng phương pháp này để chiết xuất Giảo cổ lam 5 lần.
Kết quả được ghi ở bảng 2.11.
Bảng 2.11: Kết quả khảo sát tính ổn định của phương pháp chiết xuất
- Độ mịn dược liệu - Dung môi
- Thời gian ngâm - Tỷ lệ DM/DL Lần thí nghiệm Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 4 Lần 5 Trung bình Khối lượng dược liệu
(g)
30.2872 30.6832 30.0348 30.2140 30.0837
Độ ẩm dược liệu
(%) 9.96 9.96 9.96 9.96 7.63
Khối lượng cao khô tạo
ra(g) 5.0943 5.1238 4.9832
5.0618 5.1161 Độ ẩm cao khô
(%) 4.93 4.91 4.91 4.90 4.83
Hàm lượng Saponin
trong cao khô (%) 19.38 19.88
19.56 19.99 19.76 19.71 ± 0.3052
Hàm lượng Flavonoid trong cao khô (%)
8.21 8.57 8.33 8.41 8.48 8.40 ± 0.1718 Hiệu suất chiết Saponin
" (%)
74.66 76M 74.34 75.10 75.38 ± 1.2354
Hiệu suất chiết
Havonoid (%) 67.50 69.97 67.57 68.89 68.79
68.55 ± 1.2818
Nhận xét: Cả 5 lần chiết xuất đều cho kết quả tương tự. Qua đó cho thấy phương pháp chiết xuất đã lựa chọn là ổn định.