4. Ý nghĩa khoa học của đề tài
3.1Trình tự mồi nhân gen LTP
Tên mồi Trình tự mồi Nhiệt độ
gắn mồi
NcoI-LTPF CATGCCATGGATGGCTAGCCTGAAGGTTGCA 560C NotI-LTPR ATTTGCGGCCGCCTTGATGTTAGCGCAGTTGGT 560C
3.1.2. Tách RNA tổng số
Do đặc tính của RNA là một loại phân tử không bền, dễ bị phân hủy bởi các enzyme ribonuclease (RNase). RNase có mặt ở khắp nơi trong tế bào và có hoạt tính rất mạnh và vẫn có hoạt tính mạnh ở nhiệt độ cao (100oC trong khoảng 1 giờ). Do đó, việc tách chiết RNA đòi hỏi phải hết sức cẩn thận để tránh các tạp nhiễm chứa RNase từ môi trƣờng và tất cả các dụng cụ thí nghiệm để tách RNA đều phải đƣợc xử lý trong dung dịch DEPC 0,1% để loại trừ RNase.
Để tách RNA tổng số từ lá non của cây đậu xanh chúng tôi tiến hành thu mẫu lá non của giống HN2. Các mẫu đƣợc nghiền nhanh trong Nitơ lỏng thành bột mịn với cối chày sứ đã đƣợc khử trùng để phá vỡ tế bào. Sau đó phải bổ sung ngay dung dịch Trizol vào vì nếu không các RNase nội bào sẽ đƣợc giải phóng và phân cắt RNA. Các thành phần trong dung dịch Trizol
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
nhƣ: phenol, guanidine isothiocyanate sẽ nhanh chóng làm kết tủa protein và bất hoạt các RNase nội bào. Bổ sung chloroform:isoamyl (24:1) để làm sạch các protein còn sót lại. Tiếp theo việc bổ sung isopropanol vào làm kết tủa RNA. Cuối cùng sản phẩm RNA tổng số đƣợc hòa tan trong 20 μl nƣớc cất có DEPC 0,01%. RNA tổng số sẽ đƣợc kiểm tra chất lƣợng bằng phƣơng pháp điện di trên gel agarose 1%. RNA tổng số sẽ đƣợc loại DNA bằng DNase sử dụng cho phản ứng tạo cDNA và nhân đoạn gen LTP.
3.1.3. Kết quả PCR nhân đoạn gen LTP
Sau khi tách RNA chúng tôi tổng hợp cDNA và nhân gen LTP. 50ng DNA đƣợc sử dụng trong phản ứng PCR để nhân đoạn gene LTP sử dụng cặp mồi đặc hiệu đã thiết kế ở trên. Sản phẩm của phản ứng PCR đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8% với thang DNA 1kb (Hình 3.1). Kết quả cho thấy, chúng tôi đã nhận đƣợc một đoạn DNA có kích thƣớc khoảng 350 bp, kích thƣớc này phù hợp với chiều dài của gen LTP theo tính toán khi thiết kế mồi. Đồng thời, kết quả điện di cho thấy sản phẩm PCR là đặc hiệu và đủ hàm lƣợng sử dụng cho tách dòng gen LTP.
Hình 3.1. ết quả PCR nhân gen LTP
(1), (2) Sản phẩm nhân đoạn gen LTP bằng cặp mồi NcoI-LTPF và NotI-
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
3.1.4. Kết quả tách dòng gen LTP
Để ghép nối sản phẩm PCR vào vector tách dòng pBT có hiệu quả thì sản phẩm PCR phải đƣợc làm sạch để loại bỏ các thành phần tạp chất có trong sản phẩm PCR. Sau khi đã tinh sạch sản phẩm PCR, chúng tôi gắn trực tiếp sản phẩm PCR vào vector tách dòng pBT, rồi biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến chủng E. coli DH5α.
Sau khi biến nạp, chủng E. coli DH5α mang vector tái tổ hợp đƣợc cấy trải trên môi trƣờng LB đặc (pepton, cao nấm men, NaCl và agar) có kháng sinh ampicilin (100 mg/ml), IPTG (0,1 mM) và X - gal (40 mg/ml, nuôi khuẩn ở 37oC trong 16 giờ. Kết quả thu đƣợc có cả khuẩn lạc màu xanh và màu trắng, chọn khuẩn lạc có màu trắng chuyển sang nuôi ở môi trƣờng có LB lỏng (có bổ sung ampicilin 100 mg/ml), nuôi qua đêm. Lấy dịch nuôi chứa vi khuẩn kiểm tra sản phẩm chọn dòng bằng phƣơng pháp PCR để xác định khuẩn lạc có mang gen mong muốn. Đồng thời, những khuẩn lạc trắng phát triển tốt trên môi trƣờng chọn lọc đƣợc nhân lên và tách chiết plasmid sau đó
kiể gen LTP bằng giới hạn Bam
(Hình 3.2).
Hình 3.2. điện di sản phẩm cắt plasmid pBT-LTP bằng BamHI
M. Marker 1 Kb; (1),(2): Sản phẩm cắt plasmid của hai dòng khuẩn lạc
Hình 2. Véctơ pBT
M 1 2
250 bp
500 bp
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Với kết quả thu đƣợc ở hình 3.2 cho thấy rằng dòng plasmid tái tổ hợp tách từ dòng khuẩn số 2 cho các băng có kích thƣớc khoảng 350 bp và băng khoảng 2700 bp đúng với kích thƣớc của tính toán lý thuyết của các dòng plasmid pBT-LTP dƣơng tính. Nhƣ vậy, có thể kết luận rằng đoạn gen LTP đã đƣợc gắn vào vector pBT ở dòng khuẩn số 2. Dòng plasmid pBT-LTP tái tổ hợp đã đƣợc gửi đi để xác định trình tự đoạn gen LTP.
3.1.5. Kết quả xác định trình tự nucleotide
Để xác định chính xác trình tự nucleotide của gen LTP, chúng tôi tiến hành đọc trình tự nucleotide của gen LTP2 trên máy đọc tự động ABI PRISM@ 3100 Avant Genetic Analyzer. Kết quả đọc trình tự đƣợc đem phân tích, xử lý bằng phần mềm BioEdit. Sau khi xử lý kết quả đọc trình tự nucleotide cho thấy, chiều dài gen LTP2 ở giống đậu xanh HN2 có kích thƣớc 351 nucleotide. Khi so sánh trình tự này trong BLAST của NCBI, kết quả cho biết đây là các trình tự gen mã hoá LTP2 của đậu xanh.
Từ kết quả xác định trình tự ở trên, chúng tôi so sánh trình tự gen LTP2 của giống HN2 với trình tự của giống đậu xanh trên Ngân hàng gen Quốc tế có mã số AY300807. Kết quả hình 3.3 cho thấy, gen LTP2 của hai giống đậu xanh này có độ tƣơng đồng cao (chỉ sai khác 1 nucleotide ở vị trí 326). Ở vị trí này, nucleotide loại T ở AY300807 đƣợc thay bằng C ở HN2
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
10 20 30 40 50
AY300807 ATGGCTAGCC TGAAGGTTGC ATGCATGGTT GCGGTGGTGT TCATGGTCGT
HN2 ATGGCTAGCC TGAAGGTTGC ATGCATGGTT GCGGTGGTGT TCATGGTCGT
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
60 70 80 90 100
AY300807 GGTGAGTGCA CATATGGCAC ATGCGATCAC GTGCGGGCAA GTGGCCTCTT
HN2 GGTGAGTGCA CATATGGCAC ATGCGATCAC GTGCGGGCAA GTGGCCTCTT
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
110 120 130 140 150
AY300807 CTTTGGCTCC ATGCATCTCC TACCTCCAAA AGGGCGGAGT TCCGTCGGCG
HN2 CTTTGGCTCC ATGCATCTCC TACCTCCAAA AGGGCGGAGT TCCGTCGGCG
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
160 170 180 190 200
AY300807 TCGTGTTGCA GCGGAGTGAA GGCCCTGAAC AGCGCCGCAA GTACCACCGC
HN2 TCGTGTTGCA GCGGAGTGAA GGCCCTGAAC AGCGCCGCAA GTACCACCGC
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
210 220 230 240 250
AY300807 TGACCGCAAA ACCGCGTGCA ACTGTCTGAA AAACCTTGCC GGTCCAAAGT
HN2 TGACCGCAAA ACCGCGTGCA ACTGTCTGAA AAACCTTGCC GGTCCAAAGT
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
260 270 280 290 300
AY300807 CGGGTATCAA CGAGGGCAAC GCCGCTTCAC TCCCAGGCAA ATGTAAAGTC
HN2 CGGGTATCAA CGAGGGCAAC GCCGCTTCAC TCCCAGGCAA ATGTAAAGTC
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
310 320 330 340 350
AY300807 AACGTGCCCT ACAAGATCAG CACCTTCACC AACTGCGCTA ACATCAAGTA
HN2 AACGTGCCCT ACAAGATCAG CACCTCCACC AACTGCGCTA ACATCAAGTA
AY300807 A
HN2 A (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hình 3.3. So sánh trình tự nucleotide của gen LTP ở giống đậu xanh HN2 và trình tự đã công bố AY300807
So sánh trình tự amino acid trong protein của gen LTP2 đƣợc phân lập với AY300807 chúng tôi nhận thấy, có 1 vị trí sai khác là vị trí 109 (F thay bằng S). Nhƣ vậy, amino acid Pheninalanin ở AY300807 đƣợc thay bằng Serin ở HN2. Kết quả đƣợc thể hiện ở hình 3.4.
10 20 30 40 50
AY300807 MASLKVACMV AVVFMVVVSA HMAHAITCGQ VASSLAPCIS YLQKGGVPSA
HN2 MASLKVACMV AVVFMVVVSA HMAHAITCGQ VASSLAPCIS YLQKGGVPSA
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
60 70 80 90 100
AY300807 SCCSGVKALN SAASTTADRK TACNCLKNLA GPKSGINEGN AASLPGKCKV
HN2 SCCSGVKALN SAASTTADRK TACNCLKNLA GPKSGINEGN AASLPGKCKV
....|....| ....|. 110
AY300807 NVPYKISTFT NCANIK
HN2 NVPYKISTST NCANIK
Hình 3.4. So sánh trình tự amino acid trong protein LTP của giống đậu xanh HN2 và AY300807
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Kết quả xác định trình tự nucleotide đã chính xác ở trên là cơ sở để chúng tôi tiếp tục thiết kế vector chuyển gen mang gen LTP để phục vụ việc nghiên cứu chuyển gen nhằm tạo các giống đậu xanh có khả năng chịu hạn.
3.2. THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN
Để gen LTP biểu hiện trong cây chuyển gen, chúng tôi gắn gen LTP vào vector chuyển tiếp pRTRA7/3 có chứa gen điều khiển 35S promoter, gen mã hóa cho tín hiệu nhận biết (c-myc), tín hiệu nhận biết của mạng lƣới ER (KDEL) và đoạn gen kết thúc (NOS) tạo thành cấu trúc 35S-LTP-cmyc- KDEL-NOS. Cấu trúc này sau đó đƣợc chuyển vào vector chuyển gen pCB301 và tạo chủng A.tumefaciens mang vector tái tổ hợp pCB301-LTP.
3.2.1. Ghép nối đoạn gen LTP vào vector chuyển tiếp pRTRA7/3
Đầu tiên vector pRTRA7/3 và pBT-LTP đƣợc cắt đồng thời 2 enzyme NcoI và NotI. Sau đó thực hiện phản ứng lai để ghép nối đoạn gen LTP vào vector pRTRA7/3 tạo thành plasmid tái tổ hợp pRTRA7/3-LTP. Sản phẩm lai đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến E.coli DH5α bằng phƣơng pháp sốc nhiệt để chọn lọc. Thu nhận plasmid tái tổ hợp và cắt kiểm tra bằng NotI và NcoI. Kết quả điện di cho thấy, sản phẩm cắt phân thành hai băng khoảng 4200 bp và 350 bp tƣơng ứng với phần vector pRTRA7/3 và gen LTP. Chúng tôi tiến hành giữ chủng trong glycerol 100% bảo quản ở nhiệt độ -800C để phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo.
Từ kết quả trên, chứng tỏ rằng đoạn gen LTP đã đƣợc chèn thành công vào vector pRTRA7/3 tạo ra vector tái tổ hợp pRTRA7/3-LTP làm nguyên liệu cho việc thiết kế vector chuyển gen.
3.2.2. Thiết kế vector tái tổ hợp pCB301 mang gen LTP
Để mang đƣợc cả cấu trúc 35S-LTP-cmyc-KDEL-NOS vào vector chuyển gen pCB301, chúng tôi cắt đồng thời 2 vector pCB301 và
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
LTP-cmyc-KDEL-NOS và vector pCB301 có kích thƣớc tƣơng ứng khoảng 1190 bp và 6200 bp. Sản phẩm này sau đó đƣợc tinh sạch theo bộ kit tinh sạch của hãng QIAGEN (QIAquick DNA Gel Extraction Kit) và đƣợc gắn trực tiếp với nhau nhờ enzyme T4 ligase tạo thành vector tái tổ hợp pCB301-LTP. Sau đó, tiến hành biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E. coli DH5α để chọn lọc, nhân nhanh plasmid với số lƣợng lớn.
Sau khi nuôi khuẩn, chúng tôi thu nhận khuẩn lạc và tiến hành kiểm tra xem vector tái tổ hợp có mang gen LTP hay không.
a. Kết quả kiểm tra vector tái tổ hợp bằng phản ứng colony-PCR
Chúng tôi tiến hành chọn 10 khuẩn lạc để tiến hành phản ứng colony-PCR với mồi đặc hiệu. Những khuẩn lạc đƣợc chọn là những khuẩn lạc tròn đều, không quá to hoặc quá nhỏ. Kết quả colony-PCR đƣợc thể hiện ở hình 3.5.
Qua hình 3.5 cho thấy 10 khuẩn lạc thí nghiệm đều cho kết quả dƣơng tính, xuất hiện một băng vạch có kích thƣớc khoảng 350 bp cho thấy kết quả biến nạp đã thành công.
b. Kết quả kiểm tra vector tái tổ hợp bằng enzyme giới hạn
Hình 3.5. Kết quả pCB301-LTP (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
M: Thang marker DNA 1kb; 1 – 10: Các mẫu pCB301-LTP
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Chúng tôi tiếp tục sử dụng 10 khuẩn lạc vừa thu đƣợc để tách
plasmid và tiến hành phản ứng cắt bằ NcoI và NotI. Kết
quả thể hiện ở hình 3.6.
Để kiểm tra vector tái tổ hợp có mang gen LTP hay không, chúng tôi sử dụng phƣơng pháp kiểm tra sản phẩm cắt vector tái tổ hợp bằng enzyme giới hạn NcoI và NotI. Kết quả thể hiện ở hình 3.6 cho thấy, khi cắt pCB301-LTP bằng NotI và NcoI thu đƣợc 2 băng: một là gen LTP có kích thƣớc khoảng 350 bp, hai là vector kích thƣớc khoảng 7000 bp. Kết quả thí nghiệm thu đƣợc phù hợp với các tính toán lý thuyết. Sở dĩ khi điện di thu đƣợc băng có kích thƣớc 7000 bp là do chiều dài vector pCB301 (khoảng 6200 bp), đoạn 35S có kích thƣớc khoảng 544 bp, đoạn cmyc-KDEL-NOS có kích thƣớc khoảng 300 bp.
ể khẳng định, chúng tôi đã thiết kế và biến nạp thành công vector chuyển gen pCB301-LTP vào trong tế bào E.coli DH5. Tế bào
vi khuẩ ợc giữ chủng trong glycerol ở -850
C.
Hình 3.6.Hình ảnh điện di sản phẩm cắt pCB301-LTP bằng NcoI và NotI
M: Thang marker DNA 1kb; 1: Mẫu pCB301-LTP
7.000 bp
10000 bp
500 bp 350 bp
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
3.2.3. Kết quả biến nạp pCB301-LTP vào vi khuẩn A. tumefaciens
Plasmid pCB301-LTP sau khi thiết kế thành công đƣợc biến nạp vào
A.tumefaciens chủng CV58C1 bằng phƣơng pháp xung điện. Đây là phƣơng pháp biến nạp rất có hiệu quả, có thời gian thí nghiệm ngắn.
Sản phẩm của quá trình biến nạp đƣợc nuôi chọn lọc trên môi trƣờng LB đặc có chứa 50 mg/l Kanamycin và 100 mg/L Rifamycin, ủ đĩa ở 28o
C.
Sau 2 ngày, kết quả thu đƣợc các khuẩn lạc trên đĩa thạ 3.7)
3.2.4. Kết quả kiểm tra sự có mặt của vector tái tổ hợp trong các dòng khuẩn lạc bằng colony-PCR. khuẩn lạc bằng colony-PCR.
Các dòng khuẩn lạc A. tumefaciens đƣợc tạo ra nhờ xung điện chứa Ti-plasmid tái tổ hợp đã đƣợc phát hiện bằng phƣơng pháp chọn lọc trên môi trƣờng đặc hiệu.
Để chọn ra những dòng khuẩn lạc nhƣ mong muốn (mang vector chuyển gen), chúng tôi đã tiến hành kiểm tra bằng phản ứng colony-PCR.
ụ ến nạp plasmid tái tổ hợp
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Chọn ngẫu nhiên 10 dòng khuẩn lạc mọc trên đĩa thạch để tiến hành phản ứng PCR colony bằng cặp mồi đặc hiệu. Sản phẩm phản ứng đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8%, kết quả thể hiện trong hình 3.8
Qua kết quả thu đƣợc ở trên, cho thấy: có 8 trong 10 dòng khuẩn lạc đƣợc lựa chọn cho kết quả dƣơng tính với phản ứng PCR với 1 băng duy nhất có kích thƣớc 350 bp (trừ dòng số 9 và 10 cho kết quả âm tính). Với tỷ lệ 80%, cho thấy đã biến nạp thành công vector pCB301 mang gen LTP vào vi khuẩn A.tumefaciens.
Nhƣ vậy, chúng tôi đã tạo đƣợc chủng A. tumefaciens CV58C1 mang plasmid tái tổ hợp pCB301-LTP. Đây chính là nguồn nguyên liệu phục vụ cho mục đích chuyển gen vào thực vật nhằm tạo cây trồng có khả năng chịu hạn tốt. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
-PCR bằng cặp mồi đặc hiệu
M: Thang marker DNA 1kb; Giếng 1 - 10: Các dòng khuẩn lạc.
350 bp
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
3.3. CHUYỂN GEN VÀ KIỂM TRA SỰ CÓ MẶT CỦA GEN LTP Ở CÂY THUỐC LÁ
3.3.1. Kết quả chuyển gen LTP vào cây thuốc lá
Sau khi đƣa đƣợc vector pCB301-LTP vào vi khuẩn A. tumefaciens, chúng tôi tiến hành biến nạp vào mảnh lá cây thuốc lá đã đƣợc cảm ứng trong môi trƣờng WPM trƣớc 2 ngày.
Sau hai ngày đồng nuôi cấy, chúng tôi tiến hành cấy chuyển các mảnh lá sang môi trƣờng GM có bổ sung Cefotaxim 500 mg/l, Kanamycin 50 mg/l và BAP 1mg/l. Cây Thuốc lá K326 in vitro Mảnh lá biến nạp 1 cm2 trên môi trƣờng cảm ứng tạo chồi
tái sinh từ mảnh lá trên môi Trƣờng GM
Tạo cây hoàn chỉnh Chọn lọc cây chuyển gen trên môi trƣờng RM
Hình 3.9. Quy trình chuyển gen-LTP vào cây thuốc lá K326 in vitro từ mô lá thông qua vi khuẩn A. tumefaciens
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Sau 2-3 tuần xuất hiện các chồi nhỏ. Từ các mảnh lá, tiến hành tách các chồi nhỏ và cấy lên môi trƣờng MS cơ bản có bổ sung Cefotaxim 500 mg/l, Kanamycin 50 mg/l để nhân nhanh chồi.
Sau 4-5 tuần, các chồi nhỏ sống sót đƣợc đặt lên môi trƣờng RM có bổ sung Cefotaxim 500 mg/l, Kanamycin 50 mg/l.
Các cây thuốc lá hoàn chỉnh sau đó đƣợc đƣa ra môi trƣờng trấu cát nhằm phát triển hệ rễ. Sau 2-3 tuần cây thuốc lá đƣợc chuyển ra môi trƣờng nhà kính.
Tỷ lệ chọn lọc sơ bộ của các mảnh lá trên môi trƣờng chọn lọc đƣợc thể hiện qua bảng 3.2.
Bảng 3.2. Kết quả LTP vào cây thuốc lá trên môi trƣờng
chọn lọc Thời gian biến nạp (phút) Tổng số Mô lá Số mô sống sót sau 1 tuần Số mô sống sót sau 2 tuần Số mô sống sót sau 3 tuần Số mô cảm ứng tạo chồi 30 200 185 173 157 155
Qua bảng 3.2, chúng tôi nhận thấy số lƣợng mô lá sống sót trên môi trƣờng chọn lọc giảm dần theo thời gian, điều này cho thấy khả năng những mô lá tồn tại và phát triển đƣợc là những mô mang các tế bào đã đƣợc chuyển gen. Sau 3 - 4 tuần, có 155/200 mô lá sống sót trên môi trƣờng chọn lọc và tạo đƣợc chồi và sau 6-8 tuần cây thuốc lá chuyển gen hoàn