4. Ý nghĩa khoa học của đề tài
2.3 Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR nhân gen LTP
Bƣớc Phản ứng Nhiệt độ (0C) Thời gian Số chu kỳ
1 Biến tính 94 3 phút 1
2 Biến tính 94 1 phút
30
3 Gắn mồi 56 45 giây
4 Kéo dài chuỗi 72 45 giây
5 Hoàn tất chuỗi 72 5 phút 1
6 Kết thúc phản ứng 4 ∞
Từ bƣớc 2 đến bƣớc 4 của phản ứng PCR đƣợc lặp lại 30 chu kì. Sản phẩm PCR đƣợc điện di trên gel agarose 1% trong đệm 1X TAE. Gel đƣợc nhuộm trong dung dịch ethidium bromide (EtBr) với nồng độ 0,5µg/ml.
2.2.4. Thôi gel và tinh sạch sản phẩm thôi gel
Trên cột thôi gel có màng chứa các phân tử ái lực cao với DNA, khi cho dịch có chứa DNA qua cột, DNA sẽ đƣợc cố định trên màng còn các
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
thành phần khác sẽ đi qua màng và đƣợc loại bỏ. Khi bổ sung nƣớc vào màng, DNA đƣợc hòa tan và thu lại vào ống mới bằng cách ly tâm tốc độ cao (13.000 v/p).
Dịch chứa DNA quan tâm (ví dụ, sản phẩm PCR) đƣợc điện di trên agarose 0,8% và cắt lấy băng quan tâm. Sau đó gel đƣợc làm sạch (thôi gel) theo hƣớng dẫn của bộ kit AccuPrep®
Gel Purification Kit (Bionner). - Cân gel theo quy ƣớc: 1mg tƣơng đƣơng với µl.
- Bổ sung dịch GB theo tỉ lệ: V mẫu : VGB = 1: 5 (µl).
- Ủ ở 600C trong 10 phút, 2 phút mix nhẹ một lần, sau khi gel tan hết ủ thêm 2 phút cho gel tan hoàn toàn.
- Chuyển hỗn hợp dung dịch lên cột gel, ly tâm 13000v/p trong 1 phút. Loại bỏ dịch chảy qua cột.
- Bổ sung 500 µl GB, ly tâm 13000v/p trong 1 phút. Loại bỏ dịch chảy qua cột.
- Bổ sung 500 µl WB, ly tâm 13000v/p trong 1 phút. Loại bỏ dịch chảy qua cột.
- Thêm 500 µl WB để rửa sạch sản phẩm, ly tâm 13000v/p trong 1 phút, loại bỏ dịch chảy qua cột, ly tâm bổ sung thêm 1 phút để loại bỏ hết dịch WB. - Chuyển cột sang ống effendorf 1,5 ml.
- Hòa tan DNA trong 30 – 50 µl nƣớc khử ion khử trùng hoặc dung dịch EL, để ở nhiệt đọ phòng 1 phút, sau đó li tâm 13000 v/p trong 1 phút. Thu dịch.
2.2.5. Tách dòng và xác định trình tự gen
Sản phẩm PCR tinh sạch sẽ đƣợc gắn vào vector tách dòng pBT để tạo vector tổ hợp có mang đoạn gen LTP mong muốn (LTP-pBT). Phản ứng đƣợc thực hiện theo hƣớng dẫn của nhà sản xuất. Sau đó, vector tái tổ hợp LTP-
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
pBT đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến E.coli DH5 . Chọn lọc các khuẩn lạc dƣơng tính (khuẩn lạc màu trắng) trên môi trƣờng LB có bổ sung 50 mg/l ampicillin, 30 mg/l X-gal và 0,1 mM IPTG. Sự có mặt của DNA tái tổ hợp đƣợc kiểm tra bằng phản ứng cắt enzyme.
Tách plasmid mang gen LTP2 phục vụ cho đọc trình tự gen bằng bộ Kit AccuPrep Plasmid Extraction của hãng Bioneer. Trình tự nucleotide của gen LTP2 đƣợc xác định trên máy đọc trình tự nucleotide tự động ABI PRISM@ 3100 Advant Genetic Analyzer của hãng Ampplied Biosystem. Kết quả đọc trình tự gen đƣợc xử lý bằng phần mềm DNAstar và BioEdit.
a. Phƣơng pháp ghép nối gen LTP vào vector tách dòng pBT
- Vector pBT: là vector tách dòng, trên vector này có trình tự nhận biết của enzyme NcoI và NotI.
- Sản phẩm PCR (gen LTP) đƣợc ghép nối vào vector pBT tạo plasmid tái tổ hợp mang gen LTP (ký hiệu pBT-LTP).
Bảng 2.4. Thành phần phản ứng vector STT Thành phần Thể tích (µl) 1 Nƣớc 2 2 Buffer 10x 1 3 pBT đã xử lý enzyme 1 4 Sản phẩm PCR 5 5 Enzyme T4 ligase 1 Tổng thể tích 10 Hỗn hợp phản ứng đƣợc ủ 1 giờ ở nhiệt độ phòng (220C – 230C).
Đặt phản ứng trong đá và chuẩn bị thực hiện quá trình biến nạp vào tế bào khả biến E.coli DH5α. Biến nạp sản phẩm ghép nối gen vào tế bào khả biến E. coli DH5α phƣơng pháp sốc nhiệt
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
* Chuẩn bị tế bào khả biến
Tế bào khả biến E. coli One Shot TOP 10 đƣợc tạo theo phƣơng pháp của Sambrook và cs (1998) có cải tiến ở bƣớc rửa cặn khuẩn trong CaCl2 0,1M sau khi ly tâm. Bƣớc này đƣợc lặp lại ba lần, để trong đá lần đầu và thứ hai 30 phút, lần thứ ba 45 phút.
* Biến nạp plasmid vào vi khuẩn E.coli DH5α
Sản phẩ đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến
E.coli DH5α bằng phƣơng pháp sốc nhiệt. Quá trình biến nạp đƣợc thực hiện nhƣ sau:
• Bổ sung 5 µl sản phẩm phản ứng lai vào tế bào khả biến và đảo nhẹ • Ủ trong đá 15 – 30 phút. • Sốc nhiệt ở 420 C trong 1 phút 30 giây. • Để trong đá 15 - 30 phút. • Bổ sung 200 µl LB lỏng. • Nuôi lắc 200v/phút ở 370 C trong 1giờ.
• Cấy trải 100 µl dịch biến nạp trên môi trƣờng chứa kháng sinh chọn lọc (Carber 50 mg/L).
• Nuôi qua đêm ở 370
C
c. Kiểm tra khuẩn lạc dƣơng tính bằng kỹ thuật colony PCR
Kỹ thuật colony-PCR cũng giống nhƣ PCR, nhƣng chỉ khác là mẫu DNA đƣợc thay bằng khuẩn lạc. Ở nhiệt độ cao (94-950C), màng tế bào vi khuẩn bị phá vỡ, giải phóng plasmid tái tổ hợp. Plasmid tái tổ hợp này sẽ làm khuôn cho phản ứng PCR nhân gen bằng cặp mồi đặc hiệu.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Chúng tôi tiến hành nuôi cấy khuẩn lạc mang pBT-LTP trong môi trƣờng LB lỏng có bổ sung Ampicilin 50 mg/L ở 370C qua đêm. Các tế bào
E.coli mang plasmid sau khi nuôi cấy đến pha cân bằng thì đƣợc ly tâm thu cặn. Thành và màng tế bào đƣợc phá vỡ bằng kiềm và chất tạo sức căng bề mặt. Sau đó, DNA hệ gen và protein đƣợc tủa lại bằng muối potassium acetate và SDS, phần tủa bị loại bỏ khỏi dung dịch chứa DNA plasmid bằng ly tâm. Dịch DNA đƣợc cố định trên màng của cột tinh sạch, sau khi rửa và hòa tan trong nƣớc, DNA đƣợc thu lại bằng ly tâm tốc độ cao.
Phƣơng pháp tách chiết plasmid đƣợc thực hiện theo Sambrook và cs (1998).
STT Thành phần
Sol I 50 mM glucose, 25 mM Tris HCl pH 8, 10 mM EDTA pH 8
Sol II 0,2 NaOH, SDS 1 %
Sol III 60 ml acetat potassium 5M, 11,5 ml acid acetic, 28,5 ml H2O
* Các bƣớc tiến hành:
- Lấy 2 ml dung dịch vi khuẩn nuôi trong LB lỏng 12 giờ - Ly tâm 13000v/p thu tế bào
- Bổ sung 150 µl Sol I hòa tan tế bào hoàn toàn - Bổ sung 150 µl Sol II trọn nhẹ trong 30 giây - Bổ sung tiếp 150 µl Sol III trộn nhẹ trong 30 giây
- Bổ sung 450 µl chloroform : isopropanol (24 : 1) trộn đều trong 3 phút
- Ly tâm 13000 v/p, hút nhẹ không cặn 400 µl pha trên sang ống effendorf mới.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
- Cho 800 µl cồn tuyệt đối, để ở nhiệt độ 5–10 phút, ly tâm 10000
v/p, loại bỏ pha trên
- Cho 500 µl cồn 80% vào, ly tâm 2 phút, sau đó loại bỏ cồn và làm đông khô trong 5 phút
- Hòa tan sản phẩm trong 50 µl nƣớc khử ion - Bổ sung Rnase. Ủ ở 370C trong 10 phút
- Kiểm tra độ tinh sạch bằng cách lấy 5 µl điện di trên gel agarose 0,8%.
a. Ghép nối đoạn gen LTP vào vector tách dòng pRTRA7/3
- Vector pRTRA7/3: là vector tiếp nhận, trên vector này vừa có hai điểm cắt của enzyme giới hạn là NcoI và NotI vừa có trình tự nhận biết của HindIII.
- Plasmid pBT-LTP 7/3 đƣợc cắt đồng thời bằng 2
enzyme giới hạn NcoI và NotI. Sau đó, thực hiện phản ứng theo bảng 2.4,
- 7/3
plasmid pRTRA7/3-LTP.
b. Ghép nối đoạn gen LTP vào vector pCB301
* Phản ứng cắt sử dụng enzyme giới hạn tạo vector chuyển gen pCB301
Bảng 2.6. Thành phần phản ứ enzyme giới hạn STT Thành phần Thể tích (µl) STT Thành phần Thể tích (µl) 1 H2O 1 2 Buffer Tango (1x) 1 3 pCB301 12 4 Enzyme (HindIII) 1 T ng thể tích 15
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Phản ứng đƣợc ủ ở 370C trong vòng 2-4 h.
Plasmid pRTRA7/3-LTP cũng đƣợc cắt bằng HindIII để tạo đoạn gen LTP có đầu dính bởi enzyme trên.
* Phản ứng lai ghép nối đoạn gen LTP vào pCB301
Sản phẩm cắ đƣợc ghép nối vào vector pCB301 tạo
plasmid tái tổ hợp mang gen LTP (ký hiệ -
bảng 2.4. Sau khi bổ sung lần lƣợt các thành phần của
phản ứng vào ống eppendorf 0,5 ml, ủ ở 370
C trong 2 giờ. Chạy điện di kiểm tra sản phẩm trên gel agarose 0,8%
Vector chuyển gen mang gen mong muốn sẽ đƣợc sử dụng để chuyển vào vi khuẩn A. tumefaciens bằng xung điện tạo vector tái tổ hợp.
2.2.7. Biến nạp vector chuyển gen vào A. tumefaciens CV58C1 a . Chuẩn bị tế bào khả biến A. tumefaciens CV58C1
50 ml tế bào vi khuẩn A. tumefaciens nuôi cấy trên môi trƣờng mới đến đầu pha log đƣợc thu lại bằng ly tâm lạnh. Cặn của tế bào vi khuẩn đƣợc làm sạch bằng cách rửa nhiều lần bằng nƣớc khử ion và glycerol 10% đã đƣợc làm lạnh trƣớc. Các thao tác đƣợc thực hiện trong box vô trùng. Bƣớc cuối cùng bổ sung 0,5 ml glycerol 10% chia đều 50 µl vào 10 ống eppendorf và giữ ở tủ -850C.
b. Phƣơng pháp
- Rửa cuvette bằng cồn 700, rửa lại bằng nƣớc khử ion vô trùng rồi thấm khô - Tế bào khả biến đặt trong đá 15 phút
- Bổ sung 1 µl plasmid vào 50 µl tế bào khả biến và trộn nhẹ
- Chuyển tất cả hỗn hợp dịch tế bào khả biến và plasmid vào cuvette - Xung điện: 2,5 kV, 25 µF, 200 Ω
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
- Bổ sung 500 µl YEP và mix nhẹ - Chuyển sang ống eppendoft 2ml - Nuôi lắc ở 280C trong 1 giờ
- Chuyển dịch ra đĩa môi trƣờng YEP bổ sung 100 mg/l Kanamycine
Sự có mặt của vector chuyển gen đƣợc kiểm tra bằng phản ứng colony- PCR với cặp mồi đặc hiệu hoặc bằng phản ứng cắt bởi enzyme giới hạn
HindIII.
2.2.8. Chuyển cấu trúc mang gen LTP vào thuốc lá thông qua vi khuẩn A. tumefaciens CV58C1
Quy trình chuyển gen vào giống thuốc lá N. tabacum K326 thông qua vi khuẩn A. tumefaciens CV58C1 đƣợc tiến hành theo phƣơng pháp của Topping có cải tiến (Topping, 1998). Các bƣớc chính nhƣ sau:
- Chuẩn bị chủng A. tumefaciens CV58C1 mang cấu trúc LTP: một ngày trƣớc khi biến nạp, nuôi một khuẩn lạc vào 5 ml LB lỏng có bổ sung cefotaxim 500 mg/L, nuôi lắc 200 v/p ở 280C.
- Chuẩn bị mảnh lá thuốc lá có kích thƣớc 1cm2 đƣợc làm tổn thƣơng bằng lƣỡi dao cắt bốn cạnh xung quanh, đặt trên môi trƣờng LB trong 2 ngày.
- Hút 1 ml dịch khuẩn nuôi lỏng ở trên cho vào 50 ml YEP lỏng, đo OD600 = 0,7 - 1 là có thể đƣợc sử dụng cho biến nạp.
- Các mảnh lá sau 2 ngày nuôi cảm ứng trên môi trƣờng WPM, đƣợc nhặt ra một bình tam giác mới có bổ sung 5 ml MS.
- Đổ dịch khuẩn vào bình tam giác có chứa các mảnh lá thuốc lá ở trên. - Sau 30 phút chuyển các mảnh cấy lên giấy thấm đã khử trùng, thấm khô và cấy lên môi trƣờng WPM. Sau 2 ngày chuyển sang môi trƣờng WPM có bổ sung kháng sinh cefotaxim 500 mg/l và kanamycin 50 mg/l.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
- Sau 2 – 3 tuần từ các mảnh cấy xuất hiện các chồi nhỏ. Tách các chồi và chuyển sang môi trƣờng MS có bổ sung kháng sinh cefotaxim 500mg/l và kanamycin 50mg/l.
- Sau 4 – 5 tuần tiếp theo những chồi sống sót và phát triển đƣợc thành cây hoàn chỉnh đƣợc cấy lên môi trƣờng RM có bổ sung kháng sinh cefotaxim 500mg/l và kanamycin 50mg/l.
- Ra cây ở phòng thí nghiệm trên giá thể trấu cát sau 4 – 5 tuần. - Sau 2 – 3 tuần chuyển cây ra môi trƣờng nhà lƣới.
2.2.9. Phƣơng pháp
a. Sàng lọc cây chuyển gen bằng chất chọn lọc
Do không phải toàn bộ các tế bào và các mẫu chuyển gen đều mang gen chuyển nên nhất thiết phải tiến hành sàng lọc các tế bào chuyển gen. Dựa vào các gen chọn lọc đƣợc thiết kế trong vector chuyển gen mà ngƣời ta sử dụng các kháng sinh phù hợp để thu đƣợc các tế bào, mẫu mang gen chuyển. Gen chọn lọc điển hình là các gen mã hóa cho các loại enzyme có khả năng khử độc đối với kháng sinh nhƣ kanamycin (nptII), hygromycine (hyg), gentamycine (gent),… hoặc chất diệt cỏ glyphosate hay basta (bar),… Chỉ những tế bào mang gen biến nạp có thể sống sót trên môi trƣờng chứa chất kháng sinh. Các loại vector này đã đƣợc ứng dụng và mang lại thành công trong việc chọn lọc nhiều đối tƣợng cây trồng chuyển gen nhƣ cây đu đủ, cây hồng, cây lúa, cây bông vải, cây thuốc lá, …
b. Kiểm tra sự có mặt của gen cần chuyển bằng PCR với cặp mồi đặc hiệu
LTP là protein đóng vai trò quan trọng trong chống chịu hạn ở thực vật. Khi gặp điều kiện khô hạn, gen LTP sẽ đƣợc điều khiển tổng hợp protein trong tế bào. Để kiểm tra sự có mặt của đoạn gen LTP dài khoảng 350 bp
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
trong các dòng thuốc lá chuyển gen, các mẫu lá của các dòng thuốc lá chuyển gen đã đƣợc thu thập sau khi cây đƣợc chuyển ra môi trƣờng nhà lƣới. Các mẫu đƣợc tách chiết DNA tổng số và tiến hành PCR nhân đoạn gen LTP bằng cặp mồi đặc hiệu với chu trình nhiệt giống nhƣ trong nhân gen từ cDNA.
2.2.10. Phƣơng pháp xử lý số liệu
- Trình tự gen thu nhận đƣợc xử lý bằng phần mềm Lasergene (USA); BLAST NCBI và phần mềm BioEdit.
- Mỗi thí nghiệm trong nuôi cấy mô tế bào đƣợc nhắc lại 3 lần. Sử dụng toán thống kê để xác định các trị số thống kê nhƣ trung bình mẫu (x), phƣơng sai ( 2), độ lệch chuẩn ( ), và sai số trung bình mẫu (Sx), với n ≤ 30, α = 0,05. Các số liệu đƣợc xử lý trên máy vi tính bằng phần mềm Excel.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1.1. Thiết kế mồi
Trên cơ sở trình tự của gen LTP đã đƣợc công bố trên Ngân hàng gen NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov) mang mã số AY300807 có độ dài 351 bp và vector chuyển gen pCB301, chúng tôi đã thiết kế mồi xuôi có thêm trình tự của enzyme giới hạn NcoI, mồi ngƣợc bổ sung trình tự của enzyme giới hạn
NotI. Cặp mồi đƣợc đặt tổng hợp bởi hãng Bioneer, Hàn Quố 3.1)
Bảng 3.1. Trình tự mồi nhân gen LTP
Tên mồi Trình tự mồi Nhiệt độ
gắn mồi
NcoI-LTPF CATGCCATGGATGGCTAGCCTGAAGGTTGCA 560C NotI-LTPR ATTTGCGGCCGCCTTGATGTTAGCGCAGTTGGT 560C
3.1.2. Tách RNA tổng số
Do đặc tính của RNA là một loại phân tử không bền, dễ bị phân hủy bởi các enzyme ribonuclease (RNase). RNase có mặt ở khắp nơi trong tế bào và có hoạt tính rất mạnh và vẫn có hoạt tính mạnh ở nhiệt độ cao (100oC trong khoảng 1 giờ). Do đó, việc tách chiết RNA đòi hỏi phải hết sức cẩn thận để tránh các tạp nhiễm chứa RNase từ môi trƣờng và tất cả các dụng cụ thí nghiệm để tách RNA đều phải đƣợc xử lý trong dung dịch DEPC 0,1% để loại trừ RNase.
Để tách RNA tổng số từ lá non của cây đậu xanh chúng tôi tiến hành thu mẫu lá non của giống HN2. Các mẫu đƣợc nghiền nhanh trong Nitơ lỏng thành bột mịn với cối chày sứ đã đƣợc khử trùng để phá vỡ tế bào. Sau đó phải bổ sung ngay dung dịch Trizol vào vì nếu không các RNase nội bào sẽ đƣợc giải phóng và phân cắt RNA. Các thành phần trong dung dịch Trizol
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
nhƣ: phenol, guanidine isothiocyanate sẽ nhanh chóng làm kết tủa protein và