Nguyên liệu chính được sử dụng để tiến hành tách chiết tinh dầu trong đề tài là lá cây Chanh ta (Citrus aurantifolia Swingle) trồng tại Diên Khánh - Khánh Hịa. Thu hái và mua lá tại vườn trồng Chanh.
Lá Chanh được sử dụng để tách chiết tinh dầu phải tươi, khơng bị nấm mốc, khơng bị hư hỏng, dập, úa, khơng bị sâu bệnh, lá đạt độ trưởng thành, khơng thu hái lá quá non hoặc quá già vì những lá đĩ hàm lượng tinh dầu chứa trong lá ít.
Hình 2.1. Lá Chanh 2.1.2. Dụng cụ - thiết bị - hĩa chất
a. Dụng cụ thiết bị
- Cân kỹ thuật 1 mg (Shimadzu, Nhật). - Cân kỹ thuật 1 g (Việt Nam).
- Bộ chưng cất tinh dầu định lượng, cĩ hồi lưu kiểu Clevenger dùng cho tinh dầu nhẹ hơn nước (ISOLAB, Đức).
- Bếp đun bình cầu 1000 ml (Trung Quốc). - Máy xay điện (Sanyo, Nhật).
- Tủ sấy 1000OC (Memmert , Đức).
- Bình đo tỷ trọng 25 ml (Bomex, Trung Quốc).
- Buret, pipet, bình tam giác, cốc thủy tinh, đũa thủy tinh.
- Hệ thống sắc ký khí ghép khối phổ hai lần với thiết bị GC model G3440A của hãng Agilent (Agilent, USA) ghép với detector MS/MS model Quattro micro TMGC của hãng Waters (USA).
b. Hĩa chất - Nước cất. - NaCl. - Na2SO4 khan. - KOH 0,1N và 0,5N. - HCl 0,5N. - Dung dịch chỉ thị phenolphtalein 1%.
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1. Chuẩn bị nguyên liệu
Lá Chanh để tách chiết tinh dầu phải tươi, đạt độ trưởng thành của lá, khơng bị sâu bệnh, lá sau khi thu hái mang đi rửa sạch bằng nước máy để loại bỏ tạp chất, bụi bẩn sau đĩ tiến hành mang đi xử lý chưng cất lấy tinh dầu, trong đề tài nghiên cứu, em lấy mẫu 100g cho một lần chưng cất tách tinh dầu.
2.2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.3. Quy trình tách chiết tinh dầu từ lá Chanh dự kiến
Hình 2.2. Sơ đồ quy trình dự kiến tách chiết tinh dầu từ lá Chanh
Lá Chanh
Xay (3 phút )
Na2SO4 khan
Lắng gạn Làm khan
Nghiên cứu thời gian chưng cất Nghiên cứu nồng độ NaCl, thời gian
ngâm
Tinh dầu thơ Phân ly Ngưng tụ
Chưng cất lơi cuốn hơi nước Ngâm
Nghiên cứu tỷ lệ nước ngâm nguyên liệu
Xử lý
2.2.4. Bố trí thí nghiệm
2.2.4.1. Thí nghiệm xác định hàm lƣợng NaCl trong nƣớc ngâm chiết.
Mục đích: NaCl cĩ tác dụng tốt trong quá trình tách chiết tinh dầu do NaCl cĩ tác dụng làm tăng khả năng thẩm thấu của nước trong tế bào, làm tăng độ phân cực của dung dịch từ đĩ làm giảm lực tương tác giữa các cấu tử tinh dầu kém phân cực với nước tạo điều kiện cho tinh dầu dễ dàng bay hơi khi chưng cất.
Hình 2.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ muối bổ sung trong nƣớc ngâm chiết
Ngâm Lá Chanh
Xử lý
Ngưng tụ Chưng cất 80 phút
Bổ sung nước với nồng độ muối NaCl (w/v,%) Xay
Phân ly
0 2,0 4,0 6,0 8,0
Tinh dầu thơ
Cách tiến hành: lấy 100g nguyên liệu mang xử lý sau đĩ cho vào máy xay điện, tiến hành xay ướt với dung dịch NaCl được pha với tỷ lệ lần lượt như trên, tỷ lệ nước muối/nguyên liệu là 4/1. Xay nguyên liệu trong 3 phút. Chuyển tồn bộ nguyên liệu đã xay vào bình cầu của hệ thống chưng cất, ngâm mẫu trong 2h sau đĩ tiến hành chưng cất hỗn hợp trong 80 phút dưới áp suất khí quyển. Hỗn hợp sẽ bay hơi sau khi gia nhiệt và đi qua ống sinh hàn. Tại đây tinh dầu ngưng tụ sau khi gặp lạnh do cĩ nước làm mát tại ống sinh hàn, tinh dầu nhẹ hơn nước nên sẽ phân li thành 2 lớp, lớp trên là tinh dầu, lớp dưới là nước. Đọc thể tích tinh dầu tách ra trên ống ngưng tụ cĩ vạch đo trong mỗi mẫu chưng cất với điều kiện lần lượt như trên và so sánh. Từ đĩ chọn nồng độ NaCl thích hợp.
2.2.4.2. Thí nghiệm xác định tỷ lệ nƣớc/nguyên liệu
Mục đích: nước cĩ tác dụng thẩm thấu các mơ nguyên liệu, sau đĩ sẽ hịa tan, khuếch tán và lơi cuốn hơi nước và các hợp chất hữu cơ trong tinh dầu, cĩ tác dụng phá vỡ hệ keo xung quanh tinh dầu, tạo điều kiện cho tinh dầu thốt ra ngồi dễ dàng hơn. Thí nghiệm nước bổ sung nhằm xác định lượng nước bổ sung vào mẫu khi ngâm nhằm đánh giá khả năng phân ly tinh dầu trong nguyên liệu.
Cách tiến hành: lấy 100g nguyên liệu đã xử lý cho vào máy xay, thêm vào đĩ một lượng nước muối, trong đĩ tỷ lệ nước muối/nguyên liệu thay đổi lần lượt là: 2/1, 3/1, 4/1, 5/1, 6/1, 7/1 (v/w) (hàm lượng NaCl thích hợp được xác định từ lơ nguyên liệu trước). Xay mẫu 3 phút để làm dập nát mẫu. Sau đĩ chuyển tồn bộ nguyên liệu đã xay vào bình cầu của hệ thống chưng cất, ngâm mẫu trong 2h và tiến hành chưng cất hỗn hợp trong 80 phút dưới ấp suất khí quyển. Đọc thể tích tinh dầu thơ tách ra trên ống ngưng tụ (cĩ khắc vạch thể tích) và so sánh thể tích tinh dầu thu được ở các nồng độ khác nhau như trên. Từ đĩ, chọn tỷ lệ nước/nguyên liệu thích hợp.
Hình 2.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ nƣớc bổ sung 2.2.4.3. Thí nghiệm xác định thời gian ngâm muối
Mục đích: thời gian ngâm ảnh hưởng đến thể tích tinh dầu thu được bởi vì sự thẩm thấu của muối và nước hay sự khuếch tán của các cấu tử tinh dầu ra mơi trường khơng thể thực hiện được ngay sau xay mẫu mà địi hỏi phải cĩ một thời gian ngâm nhất định.
Sau khi xác định được hàm lượng NaCl, tỷ lệ nước/nguyên liệu thích hợp, muối và nước sẽ được ngâm chung với nguyên liệu. Tiến hành khảo sát thí nghiệm xác định thời gian ngâm nước muối. Thí nghiệm được tiến hành với các thời gian thay đổi như sau: 0h, 1h, 2h, 3h, 4h, 5h.
Ngâm Xử lý
Ngưng tụ Chưng cất 80 phút Bổ sung nước với tỷ lệ nước/cái
Xay
Phân ly
2/1 3/1 4/1 5/1 6/1 7/1
Tinh dầu thơ
Cách thực hiện: lấy 100g nguyên liệu mang đi xử lý sau đĩ cho vào máy xay điện, tiến hành xay ướt với dung dịch nước muối đã được xác định trên thí nghiệm xác định nồng độ muối và tỷ lệ nước bổ sung vào mẫu. Xay trong 3 phút. Chuyển tồn bộ nguyên liệu đã xay vào bình cầu của hệ thống chưng cất. Thay đổi thời gian ngâm nguyên liệu lần lượt là: 0h, 1h, 2h, 3h, 4h, 5h. Sau đĩ, chưng cất hỗn hợp trong 80 phút dưới áp suất khí quyển. Tinh dầu sẽ được ngưng tụ và phân ly khi gặp lạnh ở ống sinh hàn. Đọc thể tích tinh dầu tách ra trên ống ngưng tụ và so sánh. Từ đĩ, chọn thời gian ngâm thích hợp.
Hình 2.5. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định thời gian ngâm nguyên liệu
Lá Chanh
Xử lý
Ngưng tụ Chưng cất 80 phút Ngâm với thời gian (h)
Xay
Phân ly
0 1 2 3 4 5
Tinh dầu thơ
2.2.4.4. Thí nghiệm xác định thời gian chƣng cất
Mục đích: thời gian chưng cất ảnh hưởng lớn tới lượng tinh dầu thu được. Nếu chưng cất trong thời gian quá ngắn thì lượng tinh dầu trích ly chưa hết hồn tồn do tinh dầu vẫn tồn tại trong tế bào tiết, do đĩ lượng tinh dầu thu được thấp. Ngược lại, khi chưng cất quá thời gian quá dài thì tốn thời gian, tổn hao năng lượng và chất lượng tinh dầu thu được cũng bị giảm đi đáng kể.
Hình 2.6. Sơ đồ bố trí thì nghiệm xác định thời gian chƣng cất
Lá Chanh
Xử lý
Ngưng tụ Chưng cất (phút) Ngâm với thời gian
Xay
Phân ly
10 20 30 40 50 60 70 80 90
Tinh dầu thơ
Tiến hành: sau khi xác định được các thơng số tối ưu như hàm lượng NaCl, tỷ lệ nước/nguyên liệu, thời gian ngâm nước muối. Tiến hành khảo sát thời gian chưng cất tối ưu. Lấy 100g mẫu đã được xử lý, mang xay với dung dịch nước muối đã tiến hành xác định ở các thí nghiệm trước, chuyển mẫu đã xay vào bình cầu và ngâm với thời gian đã được chọn ở lơ thí nghiệm xác định thời gian ngâm mẫu. Sau đĩ mang chưng cất mẫu dưới áp suất khí quyển.
Thí nghiệm tiến hành khảo sát thời gian chưng cất nguyên liệu với các khoảng thời gian biến thiên từ 10 phút, 20 phút , 30 phút… thời gian chưng cất được khảo sát bắt đầu tính từ khi cĩ giọt tinh dầu đầu tiên rơi xuống ống xiphong, thường xuyên theo dõi mẫu đang chưng cất và cứ sau 10 phút ghi lại thể tích tinh dầu thơ thu được trên ống ngưng tụ. Quá trình khảo sát thời gian chưng cất kết thúc tại thời điểm mà thể tích tinh dầu đọc được trên ống xiphong khơng tăng nữa. Ghi lại thời gian và thể tích tinh dầu.
2.2.5. Xác định hàm lƣợng ẩm trong nguyên liệu Chanh: bằng phương pháp sấy đến khối lượng khơng đổi [1] (phụ lục1)
2.2.6. Xác định các chỉ số hĩa-lý và định danh các cấu tử thành phần của tinh dầu dầu
2.2.6.1. Phƣơng pháp xác định các tính chất lý-hĩa cơ bản của tinh dầu [1]
Lượng tinh dầu sau khi chưng cất và làm khan được đem xác định các chỉ số lý hĩa như sau:
- Xác định tỷ trọng ở 25OC (d25): Phương pháp khối lượng, dùng bình đo tỷ trọng (Phụ lục 2).
- Xác định chỉ số acid (IA), chỉ số ester (IE) và chỉ số xà phịng hĩa (IS):
Phương pháp chuẩn độ (Phụ lục 2).
2.2.6.2. Định danh các cấu tử thành phần cĩ trong tinh dầu lá Chanh bằng phƣơng pháp phân tích sắc kí khí ghép phối phổ GC-MS (phụ lục 5)
Xác định các cấu tử cĩ trong tinh dầu lá Chanh tại Trung tâm Dịch vụ Phân tích Thí nghiệm Thành phố Hồ Chí Minh (số 02 Nguyễn Văn Thủ, Quận 1, Tp.HCM) trên thiết bị sắc ký khí – ghép khối phổ. Việc định danh các thành phần
trong tinh dầu được thực hiện bằng cách dùng phần mềm cài đặt sẵn trên máy để so sánh các phổ full-MS và MS/MS của từng cấu tử tách ra trên sắc ký đồ với các phổ chuẩn cĩ trong thư viện phổ.
Mức độ phù hợp giữa chất cĩ trong mẫu nghiên cứu và chất đề nghị được tính bằng đại lượng độ tương thích. Độ tương thích càng cao thì kết quả định danh càng chính xác. Khi phổ khối của một chất phân tích hồn tồn giống với phổ khối của một chất chuẩn trong thư viện thì độ tương thích là được biểu thị là 1000. Độ tương thích đạt trên 800 được xem là cho kết quả cĩ độ tin cậy cao.
2.2.7. Phƣơng pháp xác định tỉ lệ khối lƣợng tinh dầu [1]
Tinh dầu thu được sau khi chưng cất ta đem tiến hành xác định tỉ lệ khối lượng tinh dầu tách chiết được.
Tỉ lệ khối lượng tinh dầu thu hồi được tính theo cơng thức:
Trong đĩ:
η: Tỉ lệ khối lượng tinh dầu thu hồi tinh dầu (%).
Vtd: Thể tích tinh dầu thu được (ml).
Dtd: Tỷ trọng của tinh dầu (g/ml).
mNL: Khối lượng nguyên liệu đem đi chưng cất (g).
2.2.8. Phƣơng pháp xử lý số liệu
Các kết quả nghiên cứu đều là trung bình cộng của 3 lần xác định song song. Xử lý số liệu và vẽ đồ thị bằng phần mềm MS Excel 2007.
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả xác định hàm lƣợng NaCl trong nƣớc ngâm, chiết
Kết quả thí nghiệm được thể hiện ở hình 3.1 (bảng PL 3.1)
0,52; a 0,4; b 0,33; c 0,28; d 0,23; e 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0 2 4 6 8 T hể t íc h ti nh d ầu ( m l) Nồng độ NaCl (%)
Hình 3.1. Ảnh hƣởng của nồng độ muối NaCl trong nƣớc ngâm, chiết tới thể tích tinh dầu lá thu đƣợc
(Các chữ cái khác nhau thể hiện sự khác biệt cĩ ý nghĩa)
Thảo luận:
Nhìn vào kết quả thí nghiệm được thể hiện trên hình 3.1 trong phần bố trí thí nghiệm để xác định hàm lượng muối NaCl bổ sung trong nước ngâm chiết ta thấy: hàm lượng muối bổ sung trong khoảng khảo sát cĩ ảnh hưởng cĩ ý nghĩa tới lượng tinh dầu thu được. Khi khơng dùng muối thể tích tinh dầu chưng cất thu được là 0,52ml. Nhưng khi sử dụng muối trong nước ngâm lá và tiến hành chưng cất thì lượng tinh dầu lại giảm, cụ thể: sử dụng muối 2% lượng tinh dầu chưng cất thu được là 0,4 ml và giảm theo chiều tăng của nồng độ muối, tới nồng độ khảo sát cuối cùng khi tăng nồng độ muối tới 8% thì lượng tinh dầu thu được chỉ là 0,23 ml. Vậy ta cĩ thể kết luận việc sử dụng muối trong nước ngâm, chiết để tiến hành chưng cất
tinh dầu lá Chanh khơng cĩ hiệu quả. Với một số nghiên cứu đã tiến hành thì kết quả này cĩ sự tương đồng với kết quả khảo sát của nguyên liệu lá Quất [7], tuy nhiên cùng trong họ Citrus nhưng với nguyên liệu vỏ Quất và vỏ Bưởi thì việc sử dụng muối trong nước ngâm lại cĩ hiệu quả (vỏ Quất sử dụng nồng độ muối 10% [4] và vỏ Bưởi Năm Roi sử dụng nồng độ muối 12,2% [6] trong quy trình chưng cất lơi cuốn hơi nước thu tinh dầu). Điều này cĩ thể được giải thích bởi bản chất nguyên liệu và thành phần hĩa học khác nhau trong nguyên liệu tiến hành chưng cất.
Muối NaCl là hợp chất vơ cơ cĩ tác dụng làm tăng khả năng thẩm thấu của nước trong tế bào, làm tăng độ phân cực của dung dịch nhờ đĩ làm giảm lực tương tác giữa các cấu tử tinh dầu kém phân cực với nước làm cho tinh dầu dễ tách ra trong quá trình chưng cất. Tuy nhiên với nguyên liệu lá Chanh trong thành phần tinh dầu của lá chứa nhiều gốc phân cực nên việc sử dụng muối trong trường hợp này khơng cĩ tác dụng, ngược lại cịn làm giảm thể tích tinh dầu thu được. Do tinh dầu lá Chanh chứa nhiều gốc phân cực nên sự cĩ mặt của muối sẽ làm tăng khả năng hịa tan các cấu tử tinh dầu phân cực vào nước chưng cất dẫn tới lượng tinh dầu thu được giảm. Đồng thời khi cho muối vào trong nước ngâm chiết sẽ làm tăng nhiệt độ sơi của dung dịch mẫu chưng cất trong khi tinh dầu lá Chanh chứa nhiều các hợp chất dễ bị thủy phân ở nhiệt độ cao làm tổn hao lượng tinh dầu thu hồi. Như vậy, tiến hành chưng cất lơi cuốn hơi nước tinh dầu lá Chanh sẽ khơng bổ sung muối NaCl trong nước ngâm, chiết.
3.2. Kết quả xác định tỷ lệ nƣớc/nguyên liệu (v/w) thích hợp
Kết quả thí nghiệm được thể hiện ở hình 3.2 (bảng PL 3.2)
0,3; a 0,39; b 0,52;c 0,4; b 0,37; d 0,34; e 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 2,0/1 3,0/1 4,0/1 5,0/1 6,0/1 7,0/1 T hể t íc h ti nh d ầu ( m l) Tỷ lệ nƣớc/lá
Hình 3.2. Ảnh hƣởng của tỷ lệ nƣớc/lá Chanh đến thể tích tinh dầu thu đƣợc
(Các chữ cái khác nhau thể hiện sự khác biệt cĩ ý nghĩa)
Thảo luận:
Dựa vào kết quả sau khi tiến hành thí nghiệm được thể hiện trên hình 3.2. Ta thấy được sự chênh lệch về thể tích tinh dầu thu hồi được ở mỗi tỷ lệ nước ngâm khác nhau. Cụ thể tỷ lệ nước ngâm/nguyên liệu sử dụng ở tỷ lệ 2/1 thì thể tích tinh dầu thu được chỉ là 0,3 ml, khi tăng tỷ lệ nước/nguyên liệu là 3/1 thì lượng tinh dầu thu được tăng thêm 0,09 ml so với thể tích tinh dầu thu được ở tỷ lệ 2/1. Tiếp tục khảo sát với tỷ lệ nước/nguyên liệu ở tỷ lệ 4/1 thì thể tích tinh dầu thu được tiếp tục tăng, thể tích tinh dầu thu được là 0,52 ml. Như vậy việc tăng tỷ lệ nước ngâm để tiến hành chưng cất tách tinh dầu cĩ hiệu quả.
Tuy nhiên khi tiếp tục tăng tỷ lệ nước ngâm lên tỷ lệ cao hơn thì lượng tinh dầu thu hồi khơng tăng mà lại giảm. Với tỷ lệ nước ngâm 5/1 thì lượng tinh dầu thu