Mẫu chuẩn thường là những mẫu càng gần với các mẫu bệnh phẩm được thực hiện tại các phòng thí nghiệm càng tốt. Mặc dù các sinh phẩm xét nghiệm HIV hiện nay đều có thể thực hiện được với cả mẫu huyết thanh và huyết tương và nhiều loại có thể xét nghiệm với máu toàn phần. Tuy nhiên mẫu thực hiện tại các phòng thí nghiệm HIV hiện nay là mẫu huyết thanh. Mà các đơn vị mẫu thu thập về đều từ các ngân hàng máu nên mẫu sẽ được thu thập dưới dạng huyết tương. Thêm vào đó
sử dụng huyết tương có thể chất lượng mẫu không cao do có hiện tượng tạo các cục đông fibrin.
Trong nghiên cứu này đã sử dụng phương pháp Thrombin hóa và phương pháp phục hổi Canxi để chuyển đổi huyết tương thành huyết thanh. Với phương pháp phục hồi bằng Canxi chúng tôi thử nghiệm ở các nồng độ Canxi khác nhau 0,001M; 0,005M, 0,008M, 0,01M, 0,05M, 0,1M, kết quả như Hình 8:
Hình 8: Thử nghiệm phục hồi Caxi với các nồng độ khác nhau
Ở các nồng độ khác nhau cho thấy việc tạo cục đông fibrin khác nhau. Với nồng độ 0,01M và 0,005M sợi tơ huyết hình thành không đáng kể, còn tại nồng độ 0,05M và 0,1M cục đông tạo thành cục tơ huyết cứng. Sau khi cất đông và tan đông lượng huyết thanh thu được không đáng kể. Qua đó nghiên cứu sử dụng nồng độ 0.01M để tiến hành cho các mẫu lựa chọn.
Từ kết quả chuẩn tại bảng 1 lựa chọn 10 mẫu, chia mỗi mẫu ra thành 2 ống sau đó tiến hành song song một ống cho CaCl2 và một ống cho Thrombin. Kết quả thể hiện tại Hình 9.
Hình 9: Hình ảnh mẫu chuyển từ huyết tương thành huyết thanh qua 2 phương pháp Thrombin và phục hồi Canxi
Qua hình 9 cho ta thấy sự tạo cục đông fibrin giữa hai phương pháp có sự khác nhau. Với ống mẫu chuyển huyết tương thành huyết thanh theo phương pháp Thrombin: các ống mẫu trong, cục đông fibrin co rõ nét. Còn đối với ống mẫu phục hồi bằng Canxi cục đông fibrin tạo thành không rõ nét, sợi huyết tạo thành từng cục nhỏ lẫn trong huyết thanh, tạo cho ống mẫu đục, lượng huyết thanh tạo thành không nhiều.
Quá trình chuyển đổi từ huyết tương thành huyết thanh hoàn tất, mẫu dương tính được ủ tại nhiệt độ 56oC trong 1h nhằm bất hoạt vi rút đảm bảo an toàn cho người sử dụng cũng như quá trình vận chuyển. Mẫu âm tính không tiến hành bất hoạt do các mẫu âm tính đã được xét nghiệm chẩn đoán âm tính với vi rút HIV và các tác nhân gây bệnh khác như viêm gan B, giang mai, ký sinh trùng sốt rét. Ngoài ra việc bất hoạt mẫu âm tính có thể gây ra các phản ứng dương tính giả khi thực hiện xét nghiệm.
Việc thực hiện ly tâm hay các công đoạn lọc đều được thực hiện riêng biệt, các mẫu âm tính hoàn tất quá trình ra ống sau đó khử trùng tủ an toàn sinh học rồi mới tiến hành sản xuất các mẫu pha loãng sau đó là mẫu dương tính.
Mẫu âm tính sau khi rã đông tự nhiên được ly tâm ở tốc độ 15.000 vòng/phút với nhiệt độ 4oC trên máy ly tâm tốc độ cao Heltech thu phần dịch nổi trong vào chai đựng mẫu đã dán nhãn mã số tương ứng. Phần dịch nổi trong này được tiến hành lọc. Quá trình lọc được thực hiện bằng cách sử dụng áp lực dương nhờ bơm hút và hệ thống bình lọc Nagenel với màng lọc có kích thước 0.22micron và màng 0.45micron.
Phần dung dịch sau khi lọc được thu vào chai lọc và tiến hành cho chất bảo quản Procin 300 nồng độ 0.05%. Các chai mẫu sau khi hoàn tất quá tình lọc được cho chất bảo quản và được quấy từ qua đêm ở nhiệt độ 4oC (Hình 10).
Hình 10: Chai mẫu khuấy từ qua đêm tại nhiệt độ 2-8oC
Các chai mẫu đã qua các bước xử lý được xác định lại đặc điểm mẫu với 3 kỹ thuật theo đúng chiến lược xét nghiệm của Bộ y tế quy định cho chẩn đoán một trường hợp HIV dương tính. Kết quả này cũng chính là kết quả được đưa vào làm kết quả chuẩn của bộ mẫu. Kết quả của mẫu được chuyển đổi bằng phương pháp Thrombin hóa được thể hiện ở Bảng 8.
Bảng 8: Kết quả xác định đặc tính mẫu sau khi Thrombin hóa
TT Mã số mẫu
Kết quả xét nghiệm Genscreen HIV Ultra
Ag/Ab (OD/CO) Serodia HIV 1/2 Mix Determine HIV 1/2 1 HIV-NIHE 01 12.67 ++ + 2 HIV-NIHE 02 0.45 (-) (-) 3 HIV-NIHE 03 0.37 (-) (-) 4 HIV-NIHE 04 8.94 + + 5 HIV-NIHE 05 0.45 (-) (-) 6 HIV-NIHE 06 0.51 (-) (-) 7 HIV-NIHE 07 0.42 (-) (-) 8 HIV-NIHE 08 8.82 + + 9 HIV-NIHE 09 12.29 ++ + 10 HIV-NIHE 10 0.46 (-) (-)
Kết quả xét nghiệm mẫu sau khi chuyển đổi huyết tương thành huyết thanh bằng phương pháp phục hồi Canxi được thể hiện tại Bảng 9.
Bảng 9: Kết quả xác định đặc tính mẫu sau khi phục hồi bằng Canxi
TT Mã số mẫu
Kết quả xét nghiệm Genscreen HIV Ultra
Ag/Ab (OD/CO) Serodia HIV 1/2 Mix Determine HIV 1/2 1 HIV-NIHE 01 12.97 ++ + 2 HIV-NIHE 02 0.47 (+/-) (-) 3 HIV-NIHE 03 0.41 (-) (-) 4 HIV-NIHE 04 9.63 + + 5 HIV-NIHE 05 0.38 (-) (-) 6 HIV-NIHE 06 0.53 (-) (-) 7 HIV-NIHE 07 0.43 (-) (-) 8 HIV-NIHE 08 9.07 + + 9 HIV-NIHE 09 11.58 ++ + 10 HIV-NIHE 10 0.41 (+/-) (-)
Mẫu sau khi đã chuyển đổi thành huyết thanh và bất hoạt nhiệt với mẫu dương, qua quá trình lọc được cho chất bảo quản. Kết quả xét nghiệm sau khi cho proclin 300 được thể hiện tại Bảng 10.
Bảng 10: Kết quả xét nghiệm sau khi cho Proclin 300
TT Mã số mẫu
Kết quả xét nghiệm Murex HIV Ag/Ab
(OD/CO) Serodia HIV 1/2 Mix Determine HIV 1/2 1 HIV-NIHE 01 16.52 ++ + 2 HIV-NIHE 02 0.53 (-) (-) 3 HIV-NIHE 03 0.65 (-) (-) 4 HIV-NIHE 04 14.63 + + 5 HIV-NIHE 05 0.45 (-) (-) 6 HIV-NIHE 06 0.72 (-) (-) 7 HIV-NIHE 07 0.55 (-) (-) 8 HIV-NIHE 08 14.22 + + 9 HIV-NIHE 09 18.24 ++ + 10 HIV-NIHE 10 0.61 (-) (-)
Những mẫu dương tính được xác định đặc tính bằng kỹ thuật Western Blot (Hình 11). Từ hình kết quả Western Blot thấy rằng hai mẫu dương tính mạnh HIV- 01 và HIV-9 có phản ứng tại tất cả các vị trí gắn kháng nguyên của vi rút, với kết quả các vạch màu tương ứng ở mức 3+. Tuy nhiên mẫu HIV 04 và HIV 08 có kết quả dương tính với các vị trí gắn kháng nguyên với mức độ dương tính 2+, một vài vị trí như gp120 có mức độ dương tính 1+.
Hình 11: Kết quả xét nghiệm mẫu dương tính với kỹ thuật Western Blot
Quá trình xác định đặc tính của bộ mẫu chuẩn đến đây được hoàn tất. Trong trường hợp số phòng thí nghiệm tham gia đông, thể tích của 1 đơn vị máu không đủ để phân phối đủ cho 1 mã số mẫu thì ta sẽ sử dụng các mẫu có cùng đặc điểm và trộn mẫu với nhau. Những mẫu có sự pha trộn như vậy sẽ được khuấy từ tối thiểu 4 giờ để đảm bảo các mẫu được đồng nhất. Sau đó các mẫu được chia ra các ống nghiệm tương ứng với thể tích yêu cầu. Sử dụng các pipet lặp lại để chia các chai mẫu ra các ống cryo. Sau khi chia mẫu trên mỗi hộp mẫu đều được dán mã số cả trong và ngoài hộp. Nhãn tạm thời này ghi rõ mã số của mẫu sản xuất, tình trạng
huyết thanh học. Sau đó những mẫu này sẽ được dán các nhãn với mã số được mã hóa riêng cho từng bộ mẫu.