Các mẫu được xét nghiệm để xác định đặc tính về kháng thể kháng HIV bằng nhiều loại sinh phẩm khác nhau. Các sinh phẩm sử dụng để xác định đặc tính là các sinh phẩm được sử dụng phổ biến tại các phòng thí nghiệm.
Một số mẫu huyết thanh dương tính được pha loãng bậc hai với các nồng độ khác nhau. Xác định nồng độ pha loãng tối ưu cho kết quả dương tính với kháng thể HIV ở các loại sinh phẩm được sử dụng.
Xác định đặc tính mẫu thông qua kỹ thuật Elisa thế hệ 3
Chúng tôi sử dụng bộ sinh phẩm Elisa thế hệ thứ ba như Genscreen HIV 1/2 Version 2 của hãng Bio Rad; sinh phẩm SD HIV 1/ 2 Elisa 3.0 của hãng Standard Diagnostics.
Nguyên tắc :
- Là kỹ thuật Elisa “Sandwich” với 2 giai đoạn.
- Sử dụng giếng microplate có gắn kháng nguyên tinh chế là các protein tái tổ hợp.
- Kháng thể kháng HIV trong mẫu thử sẽ kết hợp đặc hiệu với kháng nguyên cố định trên giếng và được phát hiện bởi cộng hợp là các kháng nguyên virus gắn enzyme. Giá trị mật độ quang của phản ứng màu (OD) tỷ lệ thuận với lượng kháng thể kháng HIV hiện diện trong mẫu thử [11, 34].
Xác định đặc tính mẫu thông qua kỹ thuật Elisa thế hệ 4
Chúng tôi sử dụng bộ sinh phẩm Genscreen Ultra HIV Ag/Ab của hãng Bio rad và Murex HIV Ag/Ab Combination của hãng Diasorin. Với sinh phẩm Elisa thế hệ thứ tư này chúng tôi mong muốn sẽ phát hiện sớm các trường hợp mới nhiễm trong giai đoạn cửa sổ.
Nguyên tắc: Kháng nguyên p24 hoặc các kháng thể kháng HIV hiện diện trong mẫu thử kết hợp đặc hiệu với kháng thể kháng p24 và các kháng nguyên vi rút được gắn trên giá đỡ. Phức hợp kháng nguyên - kháng thể sẽ được phát hiện bởi các cộng hợp gắn men cho phản ứng hiện màu sau khi cho cơ chất [11, 54].
Xác định đặc tính mẫu thông qua kỹ thuật ngưng kết hạt
Chúng tôi sử dụng bộ sinh phẩm Serodia HIV 1/2 Mix của hãng Fujirebio Nhật Bản.
Nguyên tắc: Những hạt gelatin được gắn với các thành phần kháng nguyên của vi rút HIV sẽ tạo ngưng kết khi có sự hiện diện của kháng thể đặc hiệu trong huyết thanh hoặc huyết tương.
Trong phản ứng ngưng kết, mẫu thử được tiến hành đồng thời trên hai giếng: với hạt gelatin không gắn kháng nguyên (giếng chứng âm) và các hạt gelatin có gắn kháng nguyên vi rút HIV 1 và HIV 2.
Không có phản ứng ngưng kết khi các hạt gelatin tự động lắng xuống thành hình nút nhỏ dưới đáy giếng.
Có phản ứng ngưng kết khi các hạt gelatin kết hợp tạo thành mạng liên kết phủ đều trên giếng.
Đọc và biện luận kết quả:
Điều kiện để đọc kết quả: Không có sự ngưng kết ở các giếng chứng âm. Trong trường hợp có hiện tượng ngưng kết ở các giếng chứng âm phải xử lý huyết thanh bằng cách hấp phụ các yếu tố làm ngưng kết không đặc hiệu trong huyết thanh và làm lại phản ứng.
Đọc kết quả:
o Mẫu âm tính: Không có sự ngưng kết ở cả hai giếng: giếng chứng âm và giếng phản ứng.
o Mẫu nghi ngờ: Không có sự ngưng kết ở giếng chứng âm, có sự ngưng kết không rõ ràng ở giếng phản ứng.
o Mẫu dương tính: Không có sự ngưng kết ở giếng chứng âm, có sự ngưng kết rõ ràng ở giếng phản ứng [11, 72].
Xác định đặc tính mẫu thông qua kỹ thuật xét nghiệm nhanh
Chúng tôi sử dụng các sinh phẩm Determine HIV 1/2 của hãng Alere; sinh phẩm SD Bioline HIV 1/2 3.0 của hãng Standard Diagnostics; sinh phẩm Double Check gol HIV 1/2 của hãng Alere; sinh phẩm Acon của hãng Acon; sinh phẩm Q Spot HIV 1/2 của hãng Phamatech.
Nguyên tắc: Mẫu thử được nhỏ vào vùng nhỏ mẫu, sau khi nhỏ lượng huyết thanh hoặc huyết tương sẽ mao dẫn đi lên qua vùng cộng hợp. Vùng cộng hợp được gắn các kháng nguyên vi rút HIV 1/2 gắn hạt mầu Selenium colloid, có thể màu đỏ hoặc vàng. Hỗn hợp này tiếp tục dịch chuyển theo màng lên phía trên đi qua vị trí có gắn các kháng nguyên vi rút là các peptit tái tổ hợp. Trong mẫu thử có các kháng thể kháng vi rút HIV đặc hiệu sẽ cho phản ứng kết hợp kháng nguyên kháng thể và cộng hợp và xuất hiện một vạch màu tại vùng thử nghiệm. Hỗn hợp tiếp tục dịch chuyển lên vùng kiểm chứng mang theo các cộng hợp có gắn kháng nguyên và sẽ cho phản ứng với các kháng thể đơn dòng kháng HIV 1/2 được cố định sẵn ở vị trí kiểm chứng và tạo thành vạch màu tại vùng này.
Đọc kết quả:
o Dương tính: Mẫu thử có vạch màu ở cả vùng mẫu thử và vùng kiểm chứng.
o Âm tính: Chỉ có vạch tại vùng kiểm chứng, không có vạch ở vùng mẫu thử.
o Khi không có vạch màu ở vùng kiểm chứng cần tiến hành lại phản ứng đồng thời kiểm tra chất lượng sinh phẩm [11, 65, 72, 73].
Xác định đặc tính mẫu thông qua kỹ thuật Western Blot
Xét nghiệm khẳng định Western-blot được chỉ định khi đã có kết quả dương tính với sinh phẩm sàng lọc. Tuy nhiên trong việc xác định đặc tính mẫu chuẩn cho bộ mẫu ngoại kiểm, chúng tôi sử dụng hai sinh phẩm sàng lọc nếu kết quả dương tính với cả hai sinh phẩm sẽ được xét nghiệm khẳng định bằng sinh phẩm Western- Blot. Trường hợp cả ba kỹ thuật này dương tính thì được coi là tiêu chuẩn vàng để chẩn đoán các trường hợp HIV.
Nguyên tắc: là một kỹ thuật theo nguyên lý ELISA gián tiếp thực hiện trên băng giấy đã cố định các thành phần kháng nguyên của vi rút ở những vị trí tương ứng theo trọng lượng phân tử. Kỹ thuật Western-blot cho phép xác định kháng thể kháng từng thành phần khác nhau của protein vi rút. Có Western-blot riêng cho HIV-1 và HIV-2.
Ủ huyết thanh của mẫu thử với băng giấy. Nếu trong mẫu thử có các kháng thể kháng HIV thì chúng sẽ gắn đặc hiệu lên các protein là kháng nguyên tương ứng và được phát hiện bằng cộng hợp là kháng thể kháng Immunoglobuline người đánh dấu bằng enzyme cho phản ứng màu với cơ chất.
Vị trí các băng màu tương ứng với kháng thể đặc hiệu với thành phần protein vi rút tương ứng [11].