Công ty Liên doanh Dợc Phòng KTCL phẩm Thẩm định phơng pháp định lợng flavonoid toan phần viên nén bao phim Ðloge ginkgo Ðloge France ViÖt Nam Khu CN Quế Võ - Bắc Ninh Mục đích - Phơng pháp xác định hàm lợng flavonoid toàn phần tiêu chuẩn chất lợng thành phẩm viên nén bao phim éloge ginkgo đợc xây dựng theo USP30 chuyên luận viên nén, để thẩm định phơng pháp Chúng tiến hành xác định: Độ đúng, độ lặp lại, tính tơng thích hệ thống, tính đặc hiệu phơng pháp Đối tợng phơng pháp 2.1 Đối tợng: - Chuẩn Quercetin: ĐCVKN TPHCM, hàm lợng 91,34% (nguyên trạng), SKS: QT104050609, Nớc: 8,51% - Chuẩn Kaempferol làm việc, hàm lợng 95,9% (nguyên trạng), SKS: 110861 - 200808 - Chuẩn Isorhamnetin làm việc, hàm lợng 100,0% (nguyên trạng), SKS: 110860 - 200806 - Viên nén bao phim éloge ginkgo Số lô: 3001201, HD: 19/03/2014 - Viªn nÐn bao phim Ðloge ginkgo Placebo có công thức tá dợc nh sau: (công thức tá dợc cho viên nén 40mg): + + + + + + + + + Lactose Tinh bét mú Talc Tartrazin HPMC Ponceau 4R Titan oxyd Magnesi stearat PEG 6000 75 mg 145 mg mg 0,035 mg 2,1 mg 0,035 mg 0,45 mg mg 0,5 mg 2.2 Ph¬ng pháp: Định lợng phơng pháp sắc ký lỏng hiệu cao đà mô tả tiêu chuẩn sở viªn nÐn bao phim Ðloge ginkgo - Cét : C18, 250ì 4,6 mn; 20àm - Detector : 270 nm - Tốc độ dòng : 1,5 ml/phút - Thể tích tiêm : 20àl QCPP018.01 Kiểm tra Trang / Công ty Liên doanh Dợc Phòng KTCL phẩm éloge France Việt Nam Khu CN Quế Võ - Bắc Ninh Thẩm định phơng pháp định lợng flavonoid toan phần viên nén bao phim éloge ginkgo Pha động : Dung dịch acid phosphoric 0,5% : Methanol (50:50) Tiến hành kết 3.1 Độ - Nguyên lý: Độ đợc xác định theo phơng pháp thêm, cách thêm đồng thời lợng chất chuẩn Quercetin, Kaempferol, Isorhamnetin đà biết vào mẫu viên nén bao phim éloge ginkgo placepo 80% ( kho¶ng 0,16mg/ml, 0,16mg/ml, 0,04mg/ml), 100% (kho¶ng kho¶ng 0,2mg/ml, 0,2mg/ml, 0,05mg/ml) 120% ( khoảng khoảng 0,24mg/ml, 0,24mg/ml, 0,06mg/ml) nồng độ định lợng phơng pháp đà nêu Độ tỉ lệ (%) lợng tìm thấy lợng thêm vào 3.1.1 - Chuẩn bị dung dịch: Dung dch chun Quercetin: + Cân 27,40 mg Quercetin chuẩn hoà tan võa ®đ 25ml b»ng methanol - Dung dịch chuẩn thêm Quercetin (ASQ): - Dung dch chun thêm ASQ1: Cân 83,4 mg quercetin n chuẩn hoà tan vừa đủ 50ml methanol - Dung dch chuẩn thêm ASQ2: Cân 110,5 mg quercetin chuẩn hoà tan vừa đủ 50ml methanol - Dung dịch chuẩn thêm ASQ3: Cân 144,5 mg quercetin chuẩn hoà tan vừa đủ 50ml methnol - Dung dch chuẩn Kaempferol: + Cân 16,50 mg kaempferol chuẩn hoà tan võa ®đ 25ml b»ng methanol - Dung dịch chuẩn thêm Kaempferol (ASK): - Dung dch chun thêm ASK1: Cân 83,4 mg kaempferol chuẩn hoà tan vừa đủ 50ml methanol - Dung dch chuẩn thêm ASK2: Cân 99,1 mg kaempferol chuẩn hoà tan vừa đủ 50ml methanol - Dung dịch chuẩn thêm ASK3: Cân 118,2 mg kaempferol chuẩn hoà tan vừa đủ 50ml methanol - Dung dịch chuẩn Isorhamnetin: QCPP018.01 Kiểm tra Trang / Công ty Liên doanh Dợc Phòng KTCL phẩm éloge France Việt Nam Khu CN Quế Võ - Bắc Ninh Thẩm định phơng pháp định lợng flavonoid toan phần viên nén bao phim éloge ginkgo + Cân 15,70 mg Isorhamnetin chuẩn hoà tan vừa đủ 100ml methanol - Dung dch chun thêm Isorhamnetin (ASI): - Dung dch chun thêm ASI1: Cân 40,90 mg Isorhamnetin chuẩn hoà tan vừa đủ 100ml methanol - Dung dch chuẩn thêm ASI2: Cân 47,20 mg Isorhamnetin chuẩn hoà tan vừa đủ 100ml methanol - Dung dịch chuẩn thêm ASI3: Cân 55,9 mg Isorhamnetin chuẩn hoà tan vừa đủ 100ml methanol - Dung dịch chuẩn hỗn hợp: Hút 2,0 ml chuẩn quercetin, hút 3,0 ml kaempferol, hút 3,0 ml isorhamnetin vào bình định mức 10ml thêm methanol đến vạch, lắc - Dung dịch mẫu éloge ginkgo Placebo: Cân lợng hỗn hợp tá dợc khoảng 500,0mg vào bình định mức 100ml Cách pha Lợng cân Dung dịch 01.01 01.02 01.03 02.01 02.02 02.03 03.01 03.02 03.03 - Khối lợng hỗn hợp tá dợc (mg) 511,0 510,3 508,6 507,5 505,6 506,7 508,1 509,2 502,7 Thªm 40ml methanol, lắc siêu âm phút, thêm 40ml acid hydrocloric 1,5N, lắc siêu âm 10 phút, để nguội thêm methanol vừa đủ 100ml, lắc Dung dịch thử 01: Lần lợt hút 10,0 ml chuẩn ASQ1, ASK1, ASI1, vào bình định mức 100ml, thêm dung dịch éloge ginkgo Placebo tơng ứng tới vạch, lắc - Dung dịch thử 02: Lần lợt hút 10,0 ml chuẩn ASQ2, ASK2, ASI2, vào bình định mức 100ml, thêm dung dịch éloge ginkgo Placebo tơng ứng tới vạch, lắc QCPP018.01 Kiểm tra Trang / Công ty Liên doanh Dợc Phòng KTCL phẩm Ðloge France ViƯt Nam Khu CN Q Vâ - B¾c Ninh - Thẩm định phơng pháp định lợng flavonoid toan phần viên nén bao phim éloge ginkgo Dung dịch thử 03: Lần lợt hút 10,0 ml chuẩn ASQ3, ASK3, ASI3, vào bình định mức 100ml, thêm dung dịch éloge ginkgo Placebo tơng ứng tới vạch, lắc - Dung dịch trắng: Hút 10,0ml dung dịch éloge ginkgo Placebo, pha loÃng thành 100,0ml với methanol - Lọc dung dịch qua màng lọc 0,45àm Lần lợt tiêm dung dịch: chuẩn hỗn hợp, trắng thử 01, thử 02, thử 03 vào hệ thống sắc ký lỏng, ghi sắc ®å 3.1.2 - KÕt qu¶: Quercetin Chn Thư 01.01 Thư 01.02 Thö 01.03 Thö 02.01 Thö 02.02 Thö 02.03 Thö 03.01 Thử Diện tích Lợng thêm Lợng tìm thấy peak vµo 100ml 100ml (A, (B, mg) mg) - - - 15,12 99,21 15,09 98,99 4082108 15,09 99,00 5396833 19,95 98,79 19,93 98,74 19,90 98,57 26,18 99,21 26,18 99,19 5417249 4090810 4081721 5393717 15,24 20,19 5384912 7084151 7082684 26,39 Lợng tìm thấy X (%) 03.02 QCPP018.01 Kiểm tra Trang / Công ty Liên doanh Dợc Phòng KTCL phÈm Ðloge France ViÖt Nam Khu CN QuÕ Vâ - Bắc Ninh Thử Thẩm định phơng pháp định lợng flavonoid toan phần viên nén bao phim éloge ginkgo 7101204 03.03 26,25 99,45 Trung b×nh: 99,02 S 0,28 RSD (%): 0,28 Khoảng tin cậy với độ xác 95% 98,8 99,2 o Công thức: + Lợng quercetin tìm thÊy 100ml dung dÞch: A( mg ) = S T × mC × × 100 × HLC S C ì 25 ì 10 + Phần trăm thu hồi: X ( % ) = - A × 100 B Kaempferol ChuÈn Thö 01.01 Thö 01.02 Thö 01.03 Thö 02.01 Thư 02.02 Thư 02.03 Thư 03.01 Thư QCPP018.01 DiƯn tÝch Lợng thêm Lợng tìm thấy peak vào 100ml 100ml (A, (B, mg) mg) - - - 15,85 99,06 16,01 100,04 4520458 15,99 99,94 5355434 18,94 99,71 18,99 99,94 18,86 99,26 22,32 98,44 22,34 98,53 5367828 4480510 4525071 5367828 16,00 19,00 5331355 6308520 6314439 22,67 Lỵng tìm thấy X (%) Kiểm tra Trang / Công ty Liên doanh Dợc Phòng KTCL phẩm éloge France Việt Nam Khu CN Q Vâ - B¾c Ninh 03.02 Thư 03.03 Thẩm định phơng pháp định lợng flavonoid toan phần viªn nÐn bao phim Ðloge ginkgo 6314439 22,34 98,53 Trung bình: 99,27 S 0,63 RSD (%): 0,63 Khoảng tin cậy với độ xác 95% 98,8 99,8 + Lợng kaempferol tìm thấy 100ml dung dịch: A( mg ) = S T × mC × × 100 × HLC S C ì 25 ì 10 + Phần trăm thu håi: X ( % ) = - A × 100 B Isorhamnetin ChuÈn Thö 01.01 Thö 01.02 Thö 01.03 Thö 02.01 Thö 02.02 Thö 02.03 Thö 03.01 Thö 03.02 Thử QCPP018.01 Diện tích Lợng thêm Lợng tìm thấy peak vµo 100ml 100ml (A, (B, mg) mg) - - - 4,07 99,50 4,06 99,38 512439 4,02 98,18 602252 4,72 99,99 4,71 99,79 4,74 100,32 5,54 99,03 709076 5,56 99,40 704530 5,52 98,76 601062 519320 518731 601062 4,09 4,72 604283 706414 5,59 Lợng tìm thấy X (%) Kiểm tra Trang / Công ty Liên doanh Dợc Phòng KTCL phẩm Thẩm định phơng pháp định lợng flavonoid toan phần viên nén bao phim éloge ginkgo éloge France ViƯt Nam Khu CN Q Vâ - B¾c Ninh 03.03 Trung bình: 99,37 S 0,65 RSD (%): 0,65 Khoảng tin cậy với độ xác 95% 98,9 99,9 + Lợng isorhamnetin tìm thấy 100ml dung dịch: A( mg ) = + Phần trăm thu hồi: X ( % ) = S T × mC × × 100 × HLC S C × 100 × 10 A ì 100 B 3.2 Độ lặp lại - Nguyên lý: Định lợng flavonoid toàn viên nén bao phim eloge ginkgo lần, với nồng độ nh đà mô tả TCCS, tính độ xác phơng pháp thông qua giá trị trung bình độ lệch chuẩn tơng đối - Thực kết quả: + Cân 20 viên nén, xác định khối lợng trung bình Nghiền thành bột + mtb= 270,5mg Cách pha Lợng cân mT (mg) Chuẩn hỗn hợp Thử Thử Thử Thử Thử Thử 01 02 03 04 05 06 Xem phần độ mục 3.1.1 311,2 Vào bình định mức 50ml , thêm 20ml 315,5 324,9 344,9 348,7 378,7 MeOH, lắc siêu âm phút, thêm 20ml HCl 1,5N lắc siêu âm 10 phút, để nguội đến nhiệt độ phòng, thêm methanol đến vach, lắc ®Ịu Läc qua giÊy läc thêng, läc qua mµng läc 0,45àm vào vial, đun cách thủy 1h, làm nguội nớc đá, để nguội đến nhiệt độ phòng Tiêm s¾c ký, tÝnh tỉng diƯn tÝch pic cđa flavonoid (quercetin, kaempferol, isorhamnetin) Hàm lợng flavonoid toànphần tính theo QCPP018.01 Kiểm tra Trang / Công ty Liên doanh Dợc Phòng KTCL phẩm éloge France Việt Nam Khu CN Quế Võ - Bắc Ninh Thẩm định phơng pháp định lợng flavonoid toan phần viên nén bao phim éloge ginkgo quercetin viên - Kết Tổng diện tích peak Hàm lợng X (mg/Viên) 5417249 Chuẩn Thử 01 Thö 02 Thö 03 Thö 04 Thö 05 Thö 06 -10,85 10,94 10,87 10,74 10,91 10,93 2457598 2512677 2571397 2696374 2768483 3012292 Trung b×nh: 10,87 S 0,07 RSD (%): 0,67 Khoảng tin cậy với xác suất 95% - C«ng thøc tÝnh: X ( mg / Vien ) = ∑ 10,78 - 10,94 S T × mC × HLC × mtb × 2,51 × × 50 S C xmT ì 25 ì 10 3.3 Tính đặc hiệu - Trên sắc ký đồ dung dịch: Trắng, chuẩn hỗn hợp dung dịch thử éloge ginkgo mục độ 3.1 cho thấy: + Trên sắc đồ dung dịch trắng không xuất peak thời diểm rửa giải quercetin, kaempferol, isorhamnetin, nh thời điểm khác + Peak sắc ký đồ dung dịch thử có thời gian lu phổ tử ngoại trùng với peak sắc ký đồ dung dịch chuẩn hỗn hợp ( quercetin, kaempferol, isorhamnetin) + Nh công thức bào chế nh điều kiện phân tích Công ty LD dợc phẩm Eloge France Việt Nam không ảnh hởng tới rửa giải nh thứ tự rửa giải thành phần chÝnh (Flavonoid) viªn nÐn bao phim Eloge Ginko 3.4 Tính thích hợp hệ thống - Tiêm lần dung dịch chuẩn hỗn hợp phần độ mục 3.1 vào hệ thống sắc ký lỏng hiệu nâng cao, ghi lại sắc đồ QCPP018.01 Kiểm tra Trang / Công ty Liên doanh Dợc Phòng KTCL phẩm éloge France Việt Nam Khu CN Quế Võ - Bắc Ninh - Thẩm định phơng pháp định lợng flavonoid toan phần viên nén bao phim Ðloge ginkgo KÕt qu¶: DiƯn Thêi DiƯn Thêi DiƯn tÝch Thêi gian tÝch gian lu tÝch gian lu peak lu peak querce peak kaempf (isorham isorhamn (querc tin (kaemp erol netin) etin etin) (phót) ferol) (phót) 12,792 5367828 25,935 601062 28,883 12,574 5355434 25,472 602252 28,390 12,739 5331355 25,730 604283 28,644 12,574 5355434 25,472 602252 28,390 12,792 5367828 25,935 201062 28,883 12,739 5331355 25,730 604283 28,644 12,702 5351539 25,712 602532 28,639 (phót) ChuÈn 541724 01 ChuÈn 539683 02 ChuÈn 538491 03 ChuÈn 539683 04 ChuÈn 541724 05 ChuÈn 538491 06 Trung 539966 b×nh: S 14626,9 0,1 16587,9 0,2 1456,7 0,2 0,27 0,80 0,31 0,87 0,24 0,77 RSD (%): - KÕt luËn: + Phơng pháp xác định hàm lợng flavonoid toàn phần tiêu chuẩn chất lợng thành phẩm viên nén bao phim éloge ginkgo có tính đặc hiệu cao + Phơng pháp có độ xác cao, với hàm lợng trung bình 10,87mg/viên độ lệch chuẩn tơng đối 0,67% + Độ phơng pháp 99,02% độ lệch chuẩn tơng đối 0,28% quercetin, 99,27%; 0,63% kaempferol, 99,37%; 0,65% isorhamnetin + Tính thích hợp hệ thống đạt yêu cầu so với USP30 QCPP018.01 Kiểm tra Trang / Công ty Liên doanh Dợc Phòng KTCL phẩm éloge France ViƯt Nam Khu CN Q Vâ - B¾c Ninh ThÈm định phơng pháp định lợng flavonoid toan phần viên nÐn bao phim Ðloge ginkgo TP KiĨm tra chÊt lỵng Ds Lê Văn Tú QCPP018.01 Kiểm tra Trang / ... Ninh Thẩm định phơng pháp định lợng flavonoid toan phần viên nén bao phim éloge ginkgo Pha động : Dung dịch acid phosphoric 0,5% : Methanol (50:50) Tiến hành kết 3.1 Độ - Nguyên lý: Độ đợc xác định. .. CN Q Võ - Bắc Ninh - Thẩm định phơng pháp định lợng flavonoid toan phần viên nén bao phim éloge ginkgo Dung dịch thử 03: Lần lợt hút 10,0 ml chuẩn ASQ3, ASK3, ASI3, vào bình định mức 100ml, thêm... France Việt Nam Khu CN Quế Võ - Bắc Ninh Thẩm định phơng pháp định lợng flavonoid toan phần viên nén bao phim éloge ginkgo quercetin viên - Kết Tổng diện tích peak Hàm lợng X (mg/Viên) 5417249