Vi sinh vaat hoic co sou

Vi sinh vật học sở PGS.TS Trần Linh Thước CHƯƠNG CÔNG NGHỆ SINH HỌC PHÂN TỬ VI SINH VẬT CHẨN ĐOÁN PHÂN TỬ SẢN XUẤT THUỐC PROTEIN TÁI TỔ HP SẢN XUẤT VẮC XIN XỬ LÝ MÔI TRƯỜNG, CHUYỂN HÓA, SẢN XUẤT SINH KHỐI 179 Vi sinh vật học sở PGS.TS Trần Linh Thước CHẨN ĐOÁN PHÂN TỬ (MOLECULAR DIAGNOSTICS) + So sánh phương pháp phát hiện, chẩn đoán VSV gây bệnh Phương pháp Ưu điểm Nhược điểm Kính hiển vi Đơn giản Phát trực tiếp Phân biệt sinh vật khác hình thái Nuôi cấy, nhiễm chuột Chỉ phát ký sinh gây bệnh sống Đo lường mức ác tính mức nhiễm Nhanh, đơn giản Có thể tự động hóa Có thể sàn lọc số lượng mẫu lớn Nhanh, nhạy chuyên biệt Phát trực tiếp ký sinh gây bệnh Phân biệt loài khác Không phụ thuộc vào lần nhiễm trước Không cần ký sinh sống Có thể tự động hóa Chậm, tốn công sức Độ nhạy thấp Không phân biệt hai VSV giống hình thái Cần tay nghề Chậm, đắc tiền Các chủng cho đáp ứng khác Tác nhân gây bệnh chết Sử dụng động vật thí nghiệm Có trường hợp tính chuyên biệt thấp Không phân biệt dạng hoạt động dạng tiềm tàng Đắc tiền, nhiều bước Không phân biệt dạng sống chết Có thể cho dương tính giả âm tính giả Miễn dịch DNA (lai, PCR) 1.1 CHẨN ĐOÁN MIỄN DỊCH (IMMNUNO DIAGNOSTICS) + Kỹ thuật ELISA: - Mẫu xét nghiệm cố định giá thể rắn; - Kháng thể chuyên biệt kháng nguyên mục tiêu bổ sung Kháng thể gọi kháng thể sơ cấp (bậc một, thường thỏ) - Kháng thể thứ cấp (bậc 2) dạng phức hợp (tiếp hợp, conjugate) với enzyme bổ sung vào Kháng thể dạng kháng-kháng thể sơ cấp - Một chất không màu bổ sung, chuyển hóa thành sản phẩm có màu tiếp xúc với enzyme Sự xuất màu thị diện phân tử protein mục tiêu mẫu xét nghiệm + Ứng dụng: kỹ thuật ELISA dùng để phát nhiều loại protein, nhận diện virút, vi khuẩn, xác định diện hợp chất phân tử lượng nhỏ nhiều loại mẫu sinh học khác + Nhược điểm kháng thể đa dòng: - Lượng loại kháng thể khác dao động tùy theo mẻ - Kháng thể đa dòng không phân biệt chủng có chung yếu tố định kháng nguyên 180 Vi sinh vật học sở PGS.TS Trần Linh Thước 1.2 KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG (MONOCLONAL ANTIBODY) + Kháng thể đơn dòng: loại kháng thể có lực với kháng nguyên chuyên biệt tạo dòng tế bào bạch huyết B, làm tăng tính chuyên biệt kháng thể sơ cấp đảm bảo độ tin cậy chế phẩm kháng thể + Qui trình tạo kháng thể đơn dòng: - Gây miễn dịch chuột kháng nguyên mục tiêu - Thu nhận lách, nghiền tách thu nhận tế bào B - Dung hợp tế bào B với tế bào ung thư tủy xương polyethylene glycol tạo tế bào lai (hybrid cell) tế bào ung thư tủy xương có kiểu hình HGPRT -(không có enzyme hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase) HGPRT cần cho tổng hợp purine (A, G) từ hypoxanthine 181 Vi sinh vật học sở PGS.TS Trần Linh Thước - Chuyển lên môi trường HAT (hypoxanthine, aminopterin, thymidine) Aminopterin kìm hãm hoạt tính dihydrofolate reductase (xúc tác tổng hợp purine) - Chỉ tế bào lai có đặc tính phân chia tế bào ung thư HGPRT tế bào lách tăng trưởng môi trường HAT - Tách thu nhận tế bào đơn, nuôi cấy, kiểm tra khả tạo kháng thể 182 Vi sinh vật học sở PGS.TS Trần Linh Thước + Kháng thể đơn dòng (nguyên vẹn đoạn Fv) tái tổ hợp E coli + Các phân tử mục tiêu kháng thể đơn dòng - Phát hiện, định lượng hormone - Phát tế bào ung thư - Định lượng tế bào tố (cytokine) - Phát thuốc - Phát chất phân tử lượng nhỏ - Phát ký sinh gây bệnh 1.3 CHẨN ĐOÁN BẰNG DNA (DNA DIAGNOSTICS SYSTEMS) 1.3.1 Lai phân tử (Hybridization) + Dựa bắt cặp bổ sung hai trình tự đối song song + Qui trình: - Gắn sợi DNA kiểm chứng mạch đơn lên màng lai - Bổ sung mẫu dò (probe) đánh dấu điều kiện thích hợp nhiệt độ, lực ion để xúc tiến bắt cặp chuyên biệt mẫu dò trình tự mục tiêu - Rửa mẫu dò không lai (bắt cặp) - Phát vạch lai màng + Đánh dấu phát mẫu dò phóng xạ: 32P, phát phim X quang + Đánh dấu phát mẫu dò không dùng phóng xạ: dựa vào tạo màu phát quang - Đánh dấu gián tiếp: biotin (hoặc digoxygenin) • Mẫu dò đánh dấu cách đưa vài nuleotide chứa biotin • Bổ sung mẫu dò đánh dấu vào dung dịch lai chứa màng lai • Bổ sung avidin streptavidin • Bổsung phức hợp biotin-enzyme (peroxidase, alkaline phosphatase) • Bổ sung chất sinh màu phát sáng enzyme - Đánh dấu trực tiếp: mẫu dò đánh dấu cách tạo phức hợp cộng hóa trị với enzyme (peroxidase) 183 Vi sinh vật học sở PGS.TS Trần Linh Thước 1.3.2 PCR (Polymerase chain reaction) + Khuếch đại đoạn gen mục tiêu phản ứng mã dựa cặp mồi có trình tự biết hai đầu đoạn DNA mục tiêu + Qui trình: gồm 20 - 30 chu kỳ ba bước - Biến tính DNA khuôn để tách mạch - Bắt cặp mồi trình tự bổ sung khuôn DNA - Kéo dài mồi tổng hợp đoạn DNA bổ sung theo chiều 5'-3' - Bắt đầu chu kỳ bước biến tính + Phát vạch khuếch đại điện di gel agarose, nhuộm chất phát huỳnh quang ethydium bromide kích thước 184 Vi sinh vật học sở PGS.TS Trần Linh Thước 185 Vi sinh vật học sở PGS.TS Trần Linh Thước 1.3.3 Dấu vân tay (DNA finger-printing) + Dùng xét nghiệm pháp y + Qui trình - Cắt DNA ly trích từ mẫu enzyme cắt giới hạn - Phân đoạn đoạn cắt điện di gel agarose - Chuyển thẩm vạch DNA sang màng lai - Lai với - trình tự minisattelite (10 - 30 trình tự lặp lại, 10bp/trình tự lặp lại) đánh dấu phóng xạ - Phát vạch lai phim X quang + Minisattelite có tính đa dạng cao nên tần suất trùng lặp vạch lai 105 - 10-8 nên đặc trưng mức cá thể 186 Vi sinh vật học sở PGS.TS Trần Linh Thước 1.3.4 Đa hình đoạn DNA khuếch đại ngẫu nhiên RADP (random amplified DNA polymorphism) + Dùng cặp mồi có trình tự tùy ý để khuếch đại ngẫu nhiên đoạn DNA DNA gen Mỗi primer định tạo tập hợp đoạn DNA khuếch đại riêng, đặc trưng cho DNA gen loài nòi, chủng + Qui trình - Tách DNA gen - Thực PCR cặp mồi ngẫu nhiên mồi - Điện di gel agarose, nhuộm ethidium bromide - Ghi nhận vạch khuếch đại, so sánh với đối chứng - Thực phản ứng PCR với cặp mồi ngẫu nhiên khác có khác biệt + Ưu điểm: - Không phụ thuộc vào mồi - Không cần ngân hàng gen, không lai, không cần đánh dấu đồng vị phóng xạ - Dễ dàng tự động hóa - Phân biệt mức loài 187 Vi sinh vật học sở PGS.TS Trần Linh Thước 1.3.6 Các dạng phân tích đoạn DNA khác (DNA fragment analysis) - Phân tích đoạn DNA: tìm dấu hiệu phân tử (kiểu gen) thay cho dấu hiệu hình thái (kiểu hình) dựa đặc trưng đoạn DNA - Dấu hiệu đa dạng cao, đặc trưng, dùng để nhận diện cá thể, quần thể, để nghiên cứu di truyền - SSCP: single strand conformation polymorphism - RFLP: restricted fragment length polymorphism - AFLP: amplified fragment length polymorphism - STR: simple tandem repeat, microsattelite - SNP: single nucleotide polymorphism 1.4 CHẨN ĐOÁN PHÂN TỬ CÁC BỆNH DI TRUYỀN (MOLECULAR DIAGNOSIS OF GENETIC DISEASE) + Xét nghiệm DNA nhằm tìm đột biến liên quan đến bệnh di truyền Còn gọi xác định kiểu gen (genotyping) 1.4.1 Hồng cầu hình lưỡi liềm + Do đột biến thay đổi base kéo theo thay đổi amino acid thứ (Val thành Glu) sợi β Cá thể đồng hợp tử đột biến (S/S) bị bệnh, trường hợp khác A/A, A/S không bệnh + DNA dạng bình thường có chứa trình tự nhận biết CvnI (CCTNAGG) CCTGAGG Trong dạng đột biến CCTGTGG + Qui trình phát hiện: - Tạo cặp mồi tương ứng với trình tự lân cận hai đầu vị trí CvnI DNA - Cắt sản phẩm khuếch đại CvnI - Điện di gel agarose để phát vạch DNA - Dạng bình thường có trình tự nhận biết CvnI cho vạch khác với dạng đột biến 188 Vi sinh vật học sở PGS.TS Trần Linh Thước 208 Vi sinh vật học sở PGS.TS Trần Linh Thước XỬ LÝ MÔI TRƯỜNG, CHUYỂN HÓA VÀ SẢN XUẤT SINH KHỐI 4.1 THỦY PHÂN CÁC CHẤT DỊ SINH BỞI VI KHUẨN + Xử lý sinh học môi trường (bioremediation) việc ứng dụng vi sinh vật để làm môi trường chứa chất gây ô nhiễm + Nhiều loài thuộc giống Pseudomonas có mang plasmid (50 - 200kb) mã hóa enzyme thủy phân 100 hợp chất hữu chứa nhân thơm nhóm Cl + Các chất hưũ chứa nhân thơm không bị halogen hóa thường bị vi khuẩn biến đổi thành catechol protocatechuate sau bị ôxi hóa thành acetyl-CoA succinate pyruvate acetaldehyde + Các chất hữu chứa nhân thơm bị halogen hóa thành phần loại thuốc trừ sâu, diệt cỏ biến đổi thành catechol, protocatechuate hydroxyquinone dẫn xuất halogen tương ứng enzyme tham gia chuyển hóa chất hữu nhân thơm bình thường + Bước loại nhóm halogen (dehalogenation) thường thực phản ứng xúc tác dioxygenase thay nhóm halogen nhóm hydroxyl 4.2 BIẾN ĐỔI DI TRUYỀN CÁC CON ĐƯỜNG PHÂN HỦY SINH HỌC + Nhược điểm chủng phân hủy chất dị sinh tự nhiên: - Một chủng phân hủy một vài chất - Nồng độ chất dị sinh cao thường ức chế tăng trưởng vi khuẩn phân hủy chất dị sinh - Thường có ô nhiễm lúc nhiều chất dị sinh khác có thành phần ức chế tăng trưởng chủng - Nhiều chất dị sinh không phân cực bị hấp phụ lên chất mang riêng đất bùn hạn chế tiếp xúc công vi sinh vật phân hủy - Tốc độ phân hủy sinh học thường chậm + Kỹ thuật tái tổ hợp gen cho phép khắc phục số nhược điểm nêu Trong hầu hết trường hợp, plasmid mang nhiều gen mã hóa cho enzyme cần cho bước đường phân hủy chất Bằng cách đưa plasmid từ nhiều chủng Pseudomonas khác vào chung tế bào chủ người ta tạo chủng có khả phân hủy nhiều chất khác Ngoài ra, kỹ thuật di truyền làm nới rộng dãi chất bị phân hủy đường sinh hóa 4.2.1 Biến đổi di truyền giao nạp - Dùng giao nạp để chuyển vào chủng nhận nhiều plasmid khác mang gen đường phân hủy khác - Sự tái tổ hợp plasmid có trình tự tương đồng cho phép tạo plasmid dung hợp chứa nhiều gen phân hủy 209 Vi sinh vật học sở PGS.TS Trần Linh Thước 210 Vi sinh vật học sở PGS.TS Trần Linh Thước 211 Vi sinh vật học sở PGS.TS Trần Linh Thước 212 Vi sinh vật học sở PGS.TS Trần Linh Thước 213 Vi sinh vật học sở PGS.TS Trần Linh Thước - Trường hợp plasmid thuộc nhóm không tương hợp khác nhau: plasmid diện bên tế bào + Ví dụ: tạo thành chủng phân hủy đồng thời phân hủy camphor (CAM), octane (OCT), xylene (XYL), naphthalene (NAH) dầu thô 4.2.2 Biến đổi di truyền kỹ thuật gen + Ví dụ: tạo chủng E coli mang operon mã hóa toluene dioxygenase thủy phân toluene trichloroethylene - Các gen todA, todB, todC1, todC2 có sản phẩm tạo thành phức hợp toluene dioxygenase từ Pseudomonas putida dòng hóa vào E coli kiểm soát tac promoter (cảm ứng, hoạt tính mạnh) - Khi có diện IPTG (isopropyl-β-thio-galactopyranoside (IPTG), toluene trichloroethylene phân hủy hoạt tính - Chủng E coli tái tổ hợp có ưu điểm chủng P putida ban đầu có khả phân hủy cao 214 Vi sinh vật học sở PGS.TS Trần Linh Thước 4.3 CHUYỂN HÓA TINH BỘT VÀ ĐƯỜNG + Tinh bột polysaccharide cấu tạo mạch homopolymer không phân nhánh amylose phân nhánh amylose pectin - Amylose tạo thành từ 100 - 40.000 phân tử glucose nối với liên kết α1,4-glucoside - Amylopectin đoạn ngắn 17 - 23 glucose nối với α-1,4-glucoside, sợi lại nối với liên kết 1,6 1,3 Phân tử amylopectin chứa 104 - x 107 đơn phân glucose + Enzyme thủy phân hiệu tinh bột dùng để sản xuất cồn fructose (chất làm thay saccharose) α-amylase, β-amylase, glucoamylase, glucose isomerase - α-Amylase thủy phân cách ngẫu nhiên liên kết α-1,4 từ tinh bột tạo hỗn hợp glucose, maltose, maltotriose, đoạn dextrin (α-limit dextrin), thường dùng bước dịch hóa tinh bột - β-Amylase thủy phân liên kết α-1,4 từ hai đầu amylose amylopectin tạo maltose đoạn β-limit dextrin 215 Vi sinh vật học sở PGS.TS Trần Linh Thước - Glucoamylase thủy phân α-1,3, α-1,4 α-1,6 (nhưng hoạt tính thủy phân α1,4 α-amylase) từ tinh bột, đoạn β-limit α-limit dextrin tạo glucose; thường dùng bước đường hóa để thủy phân đường lại bia - Glucose isomerase dùng để chuyển glucose thành fructose 216 Vi sinh vật học sở PGS.TS Trần Linh Thước + Enzyme dùng sản xuất cồn fructose chiếm phần quan trọng tổng chi phí sản xuất dùng lần Một giải pháp làm giảm giáthành sản xuất enzyme qui mô lớn rẽ tiền - Biểu vượt mức enzyme vi sinh vật tăng trưởng nhanh sử dụng nguồn chất rẽ tiền - Sử dụng α-amylase chịu nhiệt (80 - 90°C) tự nhiên đột biến bước hồ hóa để làm giảm thời gian số lượng enzyme cần thiết - Cải biến α-amylase glucoamylase cho có nhiệt độ pH tối ưu để bước dịch hóa đường hóa thực điều kiện chung - Sử dụng enzyme thủy phân hưũ hiệu tinh bột sống để loại bỏ bước hồ hóa, giảm chi phí lượng - Tạo chủng nấm men sản xuất glucoamylase để loại bỏ bước đường hóa lên men cồn 217 Vi sinh vật học sở PGS.TS Trần Linh Thước + Ví dụ: tạo chủng nấm men mang gen mã hóa glucoamylase biểu glucoamylase bề mặt tế bào - Gen mã hóa glucoamylase từ nấm mốc Rhizopus oryzae dòng hóa vào vùng kiểm soát tiết (secrete signal sequence, sss) vùng 3' gen mã hóa agglutinin (một protein diện 10.000 phân tử bề mặt tế bào nấm men) - Tất kiểm soát GAPD promoter (glyceraldehyde 3-phosphat dehydrogenase) - Chọn lọc dòng tái tổ hợp dựa gen trp - Trên plasmid, đoạn gen trp1-GADP promoter-sss-Glucoamylase-AgglutininGADP terminator chèn vào đoạn trình tự nucleotide từ nhiễm sắc thể 11 nấm men (không thể plasmid) - Trong tế bào nấm men, đoạn gen trp1-2μ-GADP promoter-sss-GlucoamylaseAgglutinin-GADP terminator sát nhập vào nhiễm sắc thể số 11 nấm men trao đổi đoạn tương đồng - Chủng nấm men tái tổ hợp biểu glucoamylase thủy phân tinh bột lên men rượu từ tinh bột Glucoamylase Promoter sss 3’-Agglutinin Terminato 218 Vi sinh vật học sở PGS.TS Trần Linh Thước Tinh bột E Glucose Glucose E E Yeast cell E Glucose E Ethanol E Ethanol E Glucoamylase E E + Một giải pháp để cải thiện suất sản xuất cồn thương mại tiến hành làm biến đổi di truyền vi khuẩn Zymomonas mobilis gen cho phép vi sinh vật sử dụng nhiều loại hợp chất carbon làm nguồn chất 4.4 CHUYỂN HÓA CELLULOSE 4.4.1 Thành phần cấu trúc lignocellulose + Các loại đường đa lignin, cellulose, hemicellulose tổ hợp với tỷ lệ khác thành thành phần khung cấu trúc lignocellulose tất thực vật Đây thành phần phụ phế phẩm nông nghiệp, chế biến gỗ, giấy, chất thải sinh hoạt cần xử lý để tránh ô nhiễm môi trường cần sử dụng nguồn tài nguyên cho sản xuất + Lignin tạo thành chủ yếu từ phenylpropane tạo thành hợp chất cao phân tử (> 10.000) không tan, khó bị phân hủy enzyme hóa học Các đơn phân phenylpropane nối với nhiều liên kết hóa học khác hình thành theo chế gốc tự Lignin tạo liên kết hóa học với hemicellulose bao quanh sợi cellulose + Hemicellulose heteropolymer mạch ngắn gồm hexose (glucose, mannose, galactose) pentose (xylose, arabinose) Có ba loại hemicellulose: - Xylan: có khung sợi poly-β-1,4-xylan, nhánh bên arabinose, glucuronic acid, arabinoglucuronic acid; thường diện gỗ cứng - Mannan: gồm có glucomannan galactomannan; thường diện gỗ mềm - Arabinogalactan 219 Vi sinh vật học sở PGS.TS Trần Linh Thước + Cellulose thành phần đơn giản lignocellulose, homopolymer glucose nối với β-1,4-glucoside 220 Vi sinh vật học sở PGS.TS Trần Linh Thước 4.4.2 Thủy phân cellulose cellulase + Cellulase: tên gọi chung họ gồm enzyme thủy phân liên kết β-1,4glucoside: - Endoglucanase: thủy phân liên kết β-1,4- hai phân tử glucose vùng vô định hình (amorphous region), tạo mạch ngắn - Exoglucanase: thủy phân từ hai đầu taïo glucose, cellobiose (hai glucose), cellotriose (ba glucose) - Cellobiohydrolase: dạng exoglucanase thủy phân từ hai đầu tạo mạch khoảng 10 glucose - β-Glucosidase (cellobiase): thủy phân cellobiose, cellotriose thành glucose + Các vi sinh vật tự nhiên thường có hoạt tính thủy phân cellulose thấp Kỹ thuật di truyền sử dụng để tạo sinh vật, vi sinh vật có khả thủy phân cellulose hữu hiệu + Dòng hóa gen mã hóa cellulase từ prokaryote (Streptomyces, Clostridium, Thermoanaerobacter, Thermomonospora, Erwinia, Pseudomonas, Cellvibrio, Ruminococcus, Cellomonas, Fibrobacter, Bacillus): - Tạo ngân hàng gen biểu đối tượng vi sinh vật quan tâm E coli - Tuyển chọn transformant môi trường kháng kháng sinh - Bổ sung lớp môi trường agar mềm chứa carboxymethyl cellulose (CMC, dẫn xuất tan cellulose) - Phát vòng thủy phân cellulose quanh khuẩn lạc cách nhuộm đỏ Congo dung dịch NaCl (hoặc dung dịch Lugol) - Đối với chủng không tạo cellulase tiết, việc tuyển chọn dựa phương pháp lai miễn dịch lai Southern - Dòng có hoạt tính β-glucosidase phát cách nuôi chủng môi trường có nguồn C cellubiose dùng chất tồng hợp X-Gal (5Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucopyranoside) 4.5 SẢN XUÁT SINH KHỐI + Một số lượng lớn dạng sinh khối lúa mì, alkane từ dầu khí, chất thải cellulose methane sử dụng làm chất để nuôi vi sinh vật thành protein đơn bào (single cell protein, SCP) + Các SCP dùng làm chất bổ sung thực phẩm cho người động vật Tuy nhiên, giá thành cao, thiếu vị ngon, có độc tính nên chưa co nhiều công thức SCP trở thành sản phẩm thương mại + Tuy nhiên số trường hợp khả tạo chất bổ sung thực phẩm dạng SCP rẽ tiền đường kỹ thuật di truyền 221 Vi sinh vật học sở PGS.TS Trần Linh Thước 222 ... 209 Vi sinh vật học sở PGS.TS Trần Linh Thước 210 Vi sinh vật học sở PGS.TS Trần Linh Thước 211 Vi sinh vật học sở PGS.TS Trần Linh Thước 212 Vi sinh vật học sở PGS.TS Trần Linh Thước 213 Vi sinh. .. hợp gen dùng để tạo vi khuẩn virút bị biến đổi dùng làm vắc xin sống: - Vi khuẩn hay virút lành biến đổi di truyền để biểu yếu tố định kháng nguyên vi sinh gây bệnh; - Vi sinh gây bệnh bị biến... LÝ MÔI TRƯỜNG, CHUYỂN HÓA VÀ SẢN XUẤT SINH KHỐI 4.1 THỦY PHÂN CÁC CHẤT DỊ SINH BỞI VI KHUẨN + Xử lý sinh học môi trường (bioremediation) vi? ??c ứng dụng vi sinh vật để làm môi trường chứa chất gây