(Luận án tiến sĩ) tổng hợp và đánh giá tác dụng sinh học các dẫn xuất của indirubin

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - NGUYỄN TRỌNG DÂN TỔNG HỢP VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG SINH HỌC CÁC DẪN XUẤT CỦA INDIRUBIN Chuyên ngành: Hóa học hợp chất thiên nhiên Mã số: 44 01 17 LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS Lưu Văn Chính TS Tơ Đạo Cường Hà Nội - Năm 2021 LỜI CẢM ƠN Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Lưu Văn Chính, TS Tơ Đạo Cường - Viện Hóa học hợp chất thiên nhiên, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam giao đề tài tận tình hướng dẫn em suốt trình thực Luận án Em xin chân thành cảm ơn GS, TS Nguyễn Mạnh Cường cung cấp chất đầu indirubin quý giá góp ý nhiều cho Luận án em Em xin chân thành cảm ơn Thầy, Cơ, cán Viện Hóa học hợp chất thiên nhiên, Viện Hàn lâm Khoa học Cơng nghệ Việt Nam, Khoa Hóa học Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại Học Quốc gia Hà Nội giảng dạy, hướng dẫn giúp đỡ em hoàn thành học phần chuyên đề Chương trình đào tạo Tơi xin chân thành cảm ơn tập thể cán Phòng Tổng hợp hữu cơ, Viện Hóa học hợp chất thiên nhiên giúp đỡ tơi suốt q trình thực Luận án Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn đến Lãnh đạo Viện Hóa học hợp chất thiên nhiên, Học viện Khoa học công nghệ, Hội đồng khoa học, Bộ phận quản lý đào tạo phòng ban giúp đỡ, tạo điều kiên thuận lợi cho suốt thời gian học tập nghiên cứu sở Tôi xin cảm ơn Lãnh đạo, Chỉ huy Trung tâm Nhiệt đới Việt -Nga, Phân viện Cơng nghệ Sinh học, Chi nhánh Phía Nam tập thể phịng Sinh hóa cho phép, tạo điều kiện thời gian, thiết bị nghiên cứu, động viên tinh thần cho tơi q trình học tập nghiên cứu Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn đến gia đình, người thân, bạn bè hết lịng ủng hộ tinh thần vật chất suốt trình học tập thực Luận án Hà Nội, ngày tháng năm 2021 Tác giả Luận án Nguyễn Trọng Dân MỞ ĐẦU Các hợp chất thiên nhiên tạo thành từ trình sinh tổng hợp thực động vật, vi sinh vật thường có hoạt tính sinh học đặc biệt, chọn lọc, dễ dung nạp vào thể tác dụng phụ Vì thế, nhiều chất số chúng sử dụng rộng rãi thực tế để làm thuốc điều trị bệnh như: ung thư, nhiễm khuẩn… mà tác dụng điều trị bệnh định cấu trúc hóa học chúng Cấu trúc hóa học hợp chất thiên nhiên thường phức tạp mà đường tổng hợp tồn phần khơng kinh tế phải qua nhiều bước phản ứng, hiệu suất thấp, chi phí xử lý mơi trường cao, thời gian phản ứng dài Do đó, tận dụng nguồn nguyên liệu sẵn có từ thiên nhiên để tổng hợp, phân lập chất dẫn đường, sau chuyển hóa chúng thành dẫn xuất có hoạt tính sinh học tốt chất dẫn đường thu hút ý nhiều nhà khoa học Gần đây, nhà khoa học khám phá nhiều hoạt tính sinh học hợp chất indirubin dẫn xuất, bisindole alkaloid thu nhận với lượng lớn từ nguyên liệu chàm mèo Strobilanthes cusia có nhiều Việt Nam phản ứng isatin indoxyl acetate Hoạt chất dẫn xuất thể nhiều hoạt tính sinh học q gây độc với nhiều dịng tế bào ung thư, có tác dụng chống kết tập tiểu cầu, tác dụng kháng viêm, kháng virus, chống oxy hóa, kháng nấm, chống vảy nến với chế rõ ràng, đến thời điểm công bố hoạt tính tiếp tục Tuy nhiên, để ứng dụng hợp chất vào thực tế cịn khó khăn độ tan nước, số công trình nghiên cứu sử dụng hướng thứ để cải thiện độ tan indirubin, theo hướng thứ hai số dẫn xuất tổng hợp nhiên công bố chưa nhiều Theo hướng này, đề tài luận án đề cập tới tổng hợp số dẫn xuất indirubin tổ hợp lai indirubin với hợp chất dị vòng chứa S, N, O; hợp chất hydroxychalcone hợp chất amine, sau đánh giá hoạt tính chống ung thư in vitro, giải thích hoạt tính để bổ sung liệu hóa học hoạt tính sinh học dẫn xuất làm sở cho nghiên cứu sâu việc tìm kiếm thuốc để chăm sóc bảo vệ sức khỏe cộng đồng từ nguồn nguyên liệu thực vật sẵn có nước Vì thế, chúng tơi lựa chọn đề tài: “Tổng hợp đánh giá tác dụng sinh học dẫn xuất indirubin” Mục tiêu luận án: - Tổng hợp 40 dẫn xuất indirubin xuất phát từ nguyên liệu đầu indirubin thu nhận từ chàm mèo Strobilanthes cusia - Đánh giá hoạt tính chống ung thư in vitro dẫn xuất tạo Nội dung luận án: Tổng hợp dẫn xuất indirubin tổ hợp lai indirubin với hợp chất 1,3,4-oxadiazole, 1,3,4-thiadiazole, 6-mercaptopurin, hợp chất hydroxychalcone hợp chất amine; Xác định cấu trúc dẫn xuất tổng hợp phương pháp phổ đại; Đánh giá hoạt tính chống ung thư in vitro ( ung thư đại tràng SW480, ung thư phổi LU-1, ung thư gan HepG2, ung thư máu HL-60 ) dẫn xuất tổng hợp được; Nghiên cứu mối tương quan cấu trúc hoạt tính chống ung thư số dẫn xuất tổng hợp sử dụng phần mềm AutoDock 4.2.6 1.1 CHƯƠNG TỔNG QUAN Giới thiệu indirubin số đồng phân Indirubin bisindole alkaloid có màu đỏ thẫm có cơng thức phân tử C16H10N2O2 (M = 262 g/mol), tên IUPAC: (3Z)-3-(3-oxo-1,3-dihydro-2H-indol-2ylidene)-1,3-dihydro-2H-indol-2-one, nhiệt độ nóng chảy 356,2÷357,8 oC, hợp chất khơng tan nước, tan methanol, ethanol, tan nhiều acetone, DMSO, DMF Phổ UV-VIS dung mơi 1,1,2,2-tetrachloroethane có cực đại 291, 356 540 nm [1] Indirubin có cơng thức cấu tạo Hình 1.1 Hình 1.1 Cơng thức cấu tạo indirubin Phân tử indirubin có liên kết hydro nội phân tử hình thành nguyên tử H-1ʹ với nguyên tử O nhóm C=O C-2 liên kết chứng minh qua nhiễu xạ tia X đơn tinh thể [2] Nhóm tác giả liên hợp phân tử indirubin với nhau, lý tan indirubin Indirubin số đồng phân indigotin màu xanh, indigo màu xanh, isoindirubin màu đỏ, isoindigo màu nâu tìm thấy Isatis tinctoria [3] (Hình 1.2) Hình 1.2 Cơng thức cấu tạo số đồng phân indirubin Từ thuốc cổ truyền Trung Quốc tên Danggui Longhui Wan để điều trị bệnh ung thư bạch cầu Leukemia, gồm 11 thảo dược khác Năm 1966 nhà khoa học thuộc Viện Huyết học, Viện Dược khoa Trung Quốc xác nhận tác dụng nằm vị thuốc có tên Thanh Đại [4] Thanh Đại bột màu xanh đen làm từ số như: Strobilanthes cusia (Nees.) O Kuntze - chàm mèo (Acanthaceae), Polygonum tinctorium (Polygonaceae) Nhật Bản, Isatis indigotica (Brassicaceae), Indigofera suffrutticosa (Fabaceae) Indigofera tinctoria L.- chàm nhỏ (Fabaceae) Bột chàm chứa hàm lượng lớn indigotin 2, phẩm nhuộm tự nhiên màu chàm xanh Những nghiên cứu sâu cho thấy chúng có chứa indirubin hoạt tính chống ung thư bạch cầu bột chàm hoạt tính indirubin mà có Năm 1999, nhà khoa học Đức công bố indirubin dẫn xuất có tác dụng ức chế enzyme kinase phụ thuộc cyclin (CDK) [4] Các enzyme CDK, họ kinase protein hoạt hóa cyclin, có chức điều khiển chu trình tế bào thơng qua việc gắn nhóm photphat vào chất protein (q trình phosphoryl hóa) kiểm sốt q trình tế bào Các CDK cịn tham gia vào việc điều khiển q trình phiên mã, xử lý mRNA trình tự chết tế bào Các CDK photphoryl hóa protein đoạn chứa aminoaxit Serin Threonin thuộc vùng vị trí hoạt động Cho tới có CDKs (cdk1-9) khoảng 16 cyclin gắn kết xác định bước làm rõ mối liên quan đến bệnh khác ung thư, tiểu đường, Alzheimer’s, thần kinh… Indirubin dẫn xuất chất có hoạt tính sinh học cao, chúng ức chế enzyme CDK1, CDK2, GSK-3β [5, 6], qua tác động đến chu trình hình thành phát triển tế bào ung thư, chúng đối tượng nhận quan tâm nghiên cứu nhiều nhà khoa học 1.2 Thu nhận, tổng hợp indirubin 1.2.1 Thu nhận indirubin từ nguyên liệu chàm mèo Strobilanthes cusia Indirubin thu nhận từ chàm mèo Strobilanthes cusia theo quy trình Nguyễn Mạnh Cường cộng [7] Lá chàm mèo thái nhỏ, để lên men ngày sau lọc kiềm hóa, tách lấy bột chàm Bột chàm thu chiếm 0,75% lượng mẫu tươi, nhiều so với lượng bột chàm nhận tiến hành theo quy trình dân gian, hàm lượng indirubin cao so với hàm lượng indirubin bột chàm theo quy trình dân gian Indirubin phân tách sắc ký cột silicagel (cỡ hạt 0,063÷0,4 mm) hệ dung mơi rửa giải nhexan/dichloromethan tăng dần độ phân cực Ngồi ra, lượng lớn indirubin thu phản ứng dịch chiết nước giàu indican từ chàm mèo với isatin môi trường kiềm theo phương pháp nhóm tác giả [8] 1.2.2 Tổng hợp indirubin từ nguyên liệu hóa học Indirubin Baeyer tổng hợp từ sớm phản ứng ngưng tụ isatin indoxyl sử dụng dung môi ethanol, xúc tác Na2CO3 (Sơ đồ 1.1) [9] Tuy nhiên, indoxyl chất trung gian khó tổng hợp khơng bền, dễ bị dime hóa để tạo thành indigotin Để khắc phục nhược điểm này, năm 1969, Rusell Kaupp cải tiến phương pháp tổng hợp Baeyer cách thay indoxyl indoxyl acetate bền hơn, thay dung môi ethanol methanol (Sơ đồ 1.2), giống nghiên cứu Bayer tác giả không công bố hiệu suất phản ứng [10] Hiện phương pháp sử dụng phổ biến để điều chế indirubin hầu hết dẫn xuất Sơ đồ 1.1 Tổng hợp indirubin từ isatin indoxyl Sơ đồ 1.2 Tổng hợp indirubin theo Rusell Kaupp Năm 2017, Cuiling Wang cộng cơng bố qui trình tổng hợp indirubin giai đoạn cách khử isatin tác nhân KBH4 dung môi methanol Phản ứng tiến hành khơng khí nhiệt độ hồi lưu với tỷ lệ mol isatin/KBH4 2/1 Phương pháp dễ thực cho hiệu suất tạo thành sản phẩm indirubin cao (90,8%) (Sơ đồ 1.3) [11] Sơ đồ 1.3 Tổng hợp indirubin cách khử isatin KBH4 Tóm lại, indirubin tổng hợp từ nguyên liệu chàm mèo Strobilanthes cusia tổng hợp từ phản ứng hóa học khác nhau, phản ứng Russel Kaupp (Sơ đồ 1.2) phản ứng thường dùng để điều chế indirubin 1.3 Tổng hợp dẫn xuất indirubin 1.3.1 Tổng hợp dẫn xuất indirubin từ dẫn xuất isatin indoxyl acetate Trong hai cơng trình công bố vào năm 2010 2017, Cheng cộng thực phản ứng ngưng tụ dẫn xuất isatin indoxyl acetate 10 dung môi methanol, xúc tác Na2CO3 nhân dẫn xuất indirubin 11 với hiệu suất tốt (Sơ đồ 1.4) [12, 13] Bản chất phản ứng phương pháp Rusell Kaupp [10] Sơ đồ 1.4 Tổng hợp dẫn xuất indirubin 11 Năm 2017, Wang cộng đưa phương pháp để tổng hợp dẫn xuất indirubin 12 có hai nhóm giống hai bên vịng phenyl thực phản ứng khử hóa dẫn xuất isatin KBH4 dung mơi MeOH, khơng khí, điều kiện hồi lưu (Sơ đồ 1.5), hiệu suất nhận dẫn xuất indirubin 76,4÷88,4% [11] Glycosyl hóa indirubin phương pháp thú vị để cải thiện độ tan indirubin xuất nhóm đường Theo hướng này, số hợp chất indirubin N1-glycoside Libnow giới thiệu [14] Trước hết N-(2,3,4-TriO-acetyl-α,β-L-rhamnopyranosyl)isatin 16α,β điều chế từ đường L-rhamnose (Sơ đồ 1.6) Sơ đồ 1.5 Tổng hợp dẫn xuất indirubin 12 cách khử hóa dẫn xuất isatin KBH4 Sơ đồ 1.6 Tổng hợp N-(2,3,4-Tri-O-acetyl-α,β-L-rhamnopyranosyl)isatin (16α,β) Sau 16α,β tinh chế sắc ký cột/silica gel sử dụng hệ dung môi heptane/ethyl acetate (3/1) nhận hợp chất 16β với hiệu suất 23% Cuối cho 16β phản ứng với indoxyl acetate dung mơi methanol, xúc tác Na2CO3, nhiệt độ phịng, thời gian nhận N-(β-L-rhamnopyranosyl)indirubin 17 với hiệu suất 77% (Sơ đồ 1.7) Sơ đồ 1.7 Tổng hợp N-(β-L-rhamnopyranosyl)indirubin Bằng phương pháp này, hợp chất N-(β-D-glucopyranosyl)indirubin 18, N(β-D-ribopyranosyl)indirubin 19, N-(β-D-galactopyranosyl)indirubin 20, N-(β-Dmannopyranosyl)indirubin 21 tổng hợp thành cơng với hiệu suất từ 59÷81% (Hình 1.3) Năm 2020, Nguyễn Hải Nam cộng công bố tổng hợp dẫn xuất hydroxamic indirubin 24 chứa hợp phần N-hydroxybenzamide, Nhydroxypropenamide, N-hydroxyheptanamide 3ʹ-oxime từ chất đầu dẫn xuất isatin 9, chất đích tạo thành với hiệu suất 57÷67% (Sơ đồ 1.8 ) [15] Hình 1.3 Cấu trúc hiệu suất tạo thành indirubin N-glycoside khác Sơ đồ 1.8 Tổng hợp dẫn xuất indirubin ức chế mạnh enzyme histone deacetylase 1.3.2 Tổng hợp dẫn xuất indirubin từ indirubin dẫn xuất + Chuyển hóa nhóm hydroxyl C-3ʹ-oxime [13, 16, 17, 18]: Trong nghiên cứu này, tác giả cho indirubin dẫn xuất 11, 12 phản ứng với hydroxylamine hydrocloride dung môi pyridine hồi lưu ethanol xúc tác K2CO3 tạo thành oxime tương ứng 25, bước thực phản ứng Oalkyl hóa 25 với alkyl halogen khác sử dụng xúc tác bazơ tạo chất đích chất trung gian chìa khóa để chuyển hóa tiếp tạo dẫn xuất indirubin (Sơ đồ 1.9 Sơ đồ 1.10) 7.14 Phổ NMR, HR-MS(ESI) hợp chất 56m 273 7.15 Phổ NMR, HR-MS(ESI) hợp chất 56n 274 275 276 277 7.16 Phổ NMR, HR-MS(ESI) hợp chất 56o 278 279 7.17 Phổ NMR, HR-MS(ESI) hợp chất 56p 280 Mô tương tác chất với enzyme GSK-3β sử dụng phần mềm AutoDock4.2.6 (A) (B) 281 (C) (D) (E) (F) (G) (H) 282 (I) (K) (L) (M) Hình 8.1 Các liên kết hydro tạo thành chất với enzyme GSK-3β (PDB ID: 1Q41) (A) Hợp chất 1; (B) Hợp chất 54; (C) Hợp chất 55; (D) Hợp chất 25; (E) Hợp chất 56a; (F) Hợp chất 56b; (G) Hợp chất 56c; (H) Hợp chất 56f; (I) Hợp chất 56i; (K) Hợp chất 56n; (L) CHIR-98014; (M) BIO-acetoxime 283 (A) (B) (C) (D) (E) (F) 284 (G) (H) (I) (K) (L) (M) Hình 8.2 Các tương tác kỵ nước (A) Hợp chất 1; (B) Hợp chất 54; (C) Hợp chất 55; (D) Hợp chất 25; (E) Hợp chất 56a; (F) Hợp chất 56b; (G) Hợp chất 56c; (H) Hợp chất 56f; (I) Hợp chất 56i; (K) Hợp chất 56n; (L) CHIR-98014; (M) BIOacetoxime 285 (A) (B) (C) (D) (E) (F) (G) (H) 286 (I) (K) (L) (M) Hình 8.3 Cấu hình tương tác lập thể hợp chất với vùng liên kết ATP enzyme GSK-3β dự đoán nghiên cứu mô tương tác phân tử Các hợp chất tương tác quan trọng biểu diễn dạng đường nối (A) Hợp chất 1; (B) Hợp chất 54; (C) Hợp chất 55; (D) Hợp chất 25; (E) Hợp chất 56a; (F) Hợp chất 56b; (G) Hợp chất 56c; (H) Hợp chất 56f; (I) Hợp chất 56i; (K) Hợp chất 56n; (L) CHIR-98014; (M) BIO-acetoxime 287 ... hợp đánh giá tác dụng sinh học dẫn xuất indirubin? ?? Mục tiêu luận án: - Tổng hợp 40 dẫn xuất indirubin xuất phát từ nguyên liệu đầu indirubin thu nhận từ chàm mèo Strobilanthes cusia - Đánh giá. .. hướng này, đề tài luận án đề cập tới tổng hợp số dẫn xuất indirubin tổ hợp lai indirubin với hợp chất dị vòng chứa S, N, O; hợp chất hydroxychalcone hợp chất amine, sau đánh giá hoạt tính chống... ứng thường dùng để điều chế indirubin 1.3 Tổng hợp dẫn xuất indirubin 1.3.1 Tổng hợp dẫn xuất indirubin từ dẫn xuất isatin indoxyl acetate Trong hai cơng trình cơng bố vào năm 2010 2017, Cheng cộng