Luận văn thạc sĩ phân lập và thiết kế vector mang gen mã hóa NAD p h quinone oxidoreductase 1 NQO1 ở người

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Nguyễn T T n N PHÂN LẬP VÀ T T TR N GEN MÃ HÓA NAD(P)H: N N R T N Ở NGƢỜ LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – 2014 Nguyễn Th Thanh Nga K20 Sinh học thực nghiệm ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Nguyễn T T n N PHÂN LẬP VÀ T T TR N GEN MÃ HÓA N N N R T N Ở NGƢỜ Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜ ƢỚNG DẪN KHOA HỌC TS NG N Đ NG T N TS LÊ HỒNG Đ P Nguyễn Th Thanh Nga K20 Sinh học thực nghiệm LỜI CẢM ƠN Trước tiên, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành sâu sắc đến TS Nguyễn Đăng Tôn, Viện Nghiên cứu hệ gen, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam TS Lê Hồng Điệp, Khoa Sinh học, Trường ĐHKHTN - ĐHQGHN hướng dẫn hỗ trợ tận tình, truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm quý báu suốt trình thực đề tài Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới PGS.TS Nông Văn Hải, Viện Trưởng Viện Nghiên cứu hệ gen cán nghiên cứu thuộc Viện Nghiên cứu hệ gen, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Đặc biệt, TS Nguyễn Hải Hà, Ths Nguyễn Văn Phòng, Ths Đỗ Mạnh Hưng bảo cho bước thực tạo điều kiện thuận lợi, giúp đỡ, cho lời khun q báu để tơi hồn thành luận văn Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn đến thầy cô giáo, cán Khoa sinh học đặc biệt thầy cô Bộ môn Sinh lý thực vật Hóa sinh, Trường ĐHKHTN - ĐHQGHN tạo điệu kiện thuận lợi giúp đỡ suốt q trình học tập hồn thành luận văn Luận văn hỗ trợ đề tài “Nghiên cứu biến đổi gen, nhiễm sắc thể người có nồng độ dioxin máu cao”, mã số KHCN-33.06/11-15 thuộc chương trình KHCN-33, Bộ Tài ngun Mơi trường quản lý Cuối cùng, xin cảm ơn gia đình, bạn bè ln động viên, giúp đỡ tơi suốt trình học tập nghiên cứu Hà Nội, ngày 20 tháng 12 năm 2013 Học viên Nguyễn Thị Thanh Nga Nguyễn Th Thanh Nga K20 Sinh học thực nghiệm CÁC CHỮ VI T TẮT Chữ viết tắt Chữ viết đầy đủ Amp Ampicilin ARE antioxidant response element BHA Butylated hydroxyanisole bp Base pair cDNA Compelementary DNA ddNTP Dideoxynucleoside triphosphate DMEM Dulbecco's modified eagle medium DNA Deoxyribonucleic acid dNTP Deoxynucleoside triphosphate DQ Duroquinone E coli Escherichia coli EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid EtBr Ethidium Bromide EtOH Ethanol FAD flavin adenine dinucleotide GSH Glutathione HCT human colon cancer IPTG Isopropyl-thio-β-D-galactoside JHH Human hepatocellular carcinoma Kb Kilo base Chữ viết tắt Chữ viết đầy đủ kD Kilo Dalton KEAP1 Kelch-like ECH-associated protein LB Luria Bertani L-DOPA L-3,4-dihydroxyphenylalanine NRF2 nuclear factor erythroid 2-related factor NQO1 NAD(P)H:quinone oxidoreductase MFC-7 Michigan Cancer Foundation-7 mRNA Messenger RNA ODC ornithine decarboxylase pcDNA3.1B his-myc Vector pcDNA3.1B his-myc PCR Polymerase Chain Reaction RNA Ribonucleic acid RNase Ribonuclease ROS Reactive oxygen species SDS-PAGE sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis UV Ultraviolet TAE Tris-Acetate-EDTA Nguyễn Th Thanh Nga K20 Sinh học thực nghiệm DANH MỤC CÁC BẢNG Số bảng Tên bảng Trang Bảng Kích thước exon intron gen mã hóa enzyme NQO1 Bảng Trình tự cặp mồi sử dụng 24 Bảng Môi trường nuôi cấy chủng vi sinh vật 25 Bảng Tương quan nồng độ gel agarose kích thước đoạn 29 DNA cần phân tách Nguyễn Th Thanh Nga K20 Sinh học thực nghiệm DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Số hình Tên hình Trang Hình Vị trí gen mã hóa NQO1 NST số 16 Hình Cấu trúc gen NQO1 với intron exon Hình Con đường Keap1/Nrf2/ARE Hình Cấu trúc bậc hai dạng dimer NQO1 15 Hình Mật độ điện tích mơ hình NQO1 tinh thể liên kết với 16 phân tử Hình Cấu trúc vector biểu pcDNA3.1(+)myc-his B 21 (Theo hãng Invitrogen) Hình Sơ đồ quy trình phân lập thiết kế vector biểu mang 40 đoạn cDNA mã hóa enzyme NQO1 Hình Điện di đồ sản phẩm RNA tổng số gel agarose 1% 41 Hình Điện di đồ sản phẩm PCR nhân gen cDNA mã hóa NQO1 42 gel agarose 0,8% Hình 10 Cấu trúc vector tái tổ hợp pcDNA3.1B myc-his-NQO1 44 Hình 11 Điện di sản phẩm PCR vector pcDNA 3.1B sau xử lý 45 enzyme giới hạn gel agarose 0,8% Hình 12 Biến nạp vào tế bào khả biến E coli 10β 47 Hình 13 Điện di kết tách plasmid tái tổ hợp gel agarose 0,8% 48 Hình 14 Điện di sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp enzyme giới 49 hạn gel agarose 0,8% Nguyễn Th Thanh Nga K20 Sinh học thực nghiệm Số hình Tên hình Trang Hình 15 So sánh trình tự nucleotide amino acid suy diễn 53 dòng plasmid mang cDNA mã hóa protein NQO1 người Hình 16 Trình tự amino acid suy diễn plasmid pcDNA3.1- 55 NQO1-15 mang đoạn cDNA mã hóa NQO1 trình tự cơng bố NM_000903.2 Hình 17 Tế bào ni mơi trường DMEM có bổ sung 56 huyết Hình 18 Điện di kết biểu tạm thời protein gel polyacrylamide 12,6% 58 Nguyễn Th Thanh Nga K20 Sinh học thực nghiệm MỤC LỤC MỞ ĐẦU ƣơn TỔNG QUAN TÀI LI U 1.1 Tổng quan gen NQO1 1.1.1 Giới thiệu chung gen NQO1 1.1.2 Cấu trúc gen NQO1 1.1.3 Sự điều hòa NQO1 đường Keap/Nrf2/ARE 1.1.4 Đa hình gen NQO1 1.2 Tổng quan protein NQO1 1.2.1 Vai trò NQO1 1.2.2 Cấu trúc phân tử protein NQO1 14 1.2.3 Các trạng thái liên kết chuyển hóa để ổn định hoạt hóa protein 17 1.3 Các hệ thống biểu dùng tạo protein tái tổ hợp 17 1.4 Vector biểu pcDNA3.1 B myc-his B 19 1.5 Tình hình nghiên cứu nước 22 ƣơn ẬT LI À ƢƠNG Á NG ÊN ỨU .24 2.1 Vật liệu 24 2.2 Phương pháp 25 2.2.1 Tách chiết RNA tổng số 25 2.2.2 Tổng hợp cDNA 26 2.2.3 Nhân đoạn cDNA phản ứng PCR 27 2.2.4 Phương pháp điện di DNA gel agarose 28 2.2.5 Xử lý DNA enzyme giới hạn 30 2.2.6 Tinh chế đoạn DNA gel agarose 31 2.2.7 Ghép nối DNA 32 2.2.8 Biến nạp plasmid vào E coli phương pháp sốc nhiệt .32 2.2.9 Tách chiết DNA plasmid 33 2.2.10 Xác định trình tự DNA 34 2.2.11 Biểu tạm thời DNA plasmid tái tổ hợp vào tế bào động vật 36 Nguyễn Th Thanh Nga K20 Sinh học thực nghiệm 2.2.12 Phân tích protein kỹ thuật điện di SDS-PAGE 38 ƣơn T QUẢ VÀ THẢO LUẬN 40 3.1 Sơ đồ thí nghiệm 40 3.2 Tách chiết RNA tổng số 40 3.3 Tạo dòng thiết kế vector biểu gen NQO1 41 3.3.1 Thiết kế cặp mồi PCR 41 3.3.2 Thiết kế vector tách dòng biểu pcDNA3.1B-NQO1 43 3.3.3 Tạo dịng đoạn cDNA mã hóa enzyme NQO1 vector pcDNA3.1B 44 3.4 Biểu tạm thời DNA plasmid tái tổ hợp tế bào động vật 54 3.4.1 Nuôi cấy ổn định cho tế bào HEK 293 54 3.4.2 Chuẩn bị vector pcDNA3.1-NQO1 cho chuyển gen 56 3.4.3 Biểu nhanh NQO1 tế bào động vật 56 K T LUẬN VÀ KI N NGHỊ 59 TÀI LI U THAM KHẢO 60 210 220 230 240 | | | | | | | | P15.NQO1 201 RIQILEGWKK RLENIWDETP LYFAPSSLFD LNFQAGFLMK NM_000903.2 201 250 260 270 280 | | | | | | | | P15.NQO1 241 KEVQDEEKNK KFGLSVGHHL GKSIPTDNQI KARNSSLEGP NM_000903.2 241 .K* 290 300 | | | | P15.NQO1 281 RFEQKLISEE DLNMHTGHHH HHH* NM_000903.2 275 c-myc 6x His Hình 16 Trình tự amino acid suy diễn plasmid pcDNA3.1-NQO1-15 mang đoạn cDNA mã hóa NQO1 trình tự cơng bố NM_000903.2 Như chúng tơi thành cơng việc tách dịng thiết kế vector biểu mã hóa cho enzyme NQO1, dòng plasmid pcDNA3.1-NQO1-15 chọn cấu trúc biểu cần nhân lượng lớn E coli 10β Cấu trúc biểu tách chiết tinh trước sử dụng làm nguyên liệu cho việc biểu tế bào động vật 3.4 Biểu tạm thời DNA plasmid tái tổ hợp vào tế bào động vật 3.4.1 Nuôi cấy ổn định cho tế bào HEK 293 Với mục đích sưu tập ni dòng tế bào ổn định phục vụ cho nghiên cứu tạo protein tái tổ hợp, sử dụng tế bào HEK293 hãng Invitrogen Cũng giống dịng tế bào động vật ni cấy, tế bào HEK 293 chọn lọc thích nghi với điều kiện nuôi cấy khác Ở điều kiện ni cấy tĩnh mơi trường có bổ sung huyết thanh, tế bào HEK293 sống bám thành lớp mỏng bề mặt đĩa bình ni cịn điều kiện nuôi lắc môi trường không bổ sung huyết thanh, tế bào sống dạng huyền phù Đây ưu quan trọng nghiên cứu sản xuất protein tái tổ hợp mang lại hiệu cao biểu giảm chi phí cho mơi trường ni cấy Bên cạnh dịng tế bào HEK sử dụng rộng rãi giới công cụ biểu protein tái tổ hợp Mặc dù có nguồn gốc biểu mơ, máy sinh hóa lại có khả thực hầu hết cuộn gấp sau dịch mã biến đổi cần thiết để tạo protein chức trưởng thành từ dãy rộng nuclecid động vật có vú khơng có vú Trước tiến hành biến nạp, tế bào biểu từ trạng thái đông lạnh nuôi phục hồi mơi trường DMEM có bổ sung huyết thanh, điều kiện nuôi tủ ấm 37oC 5% CO2, tạo tế bào khỏe mạnh Sau 14 ngày, tế bào phát triển đạt 70% bề mặt bình ni cấy bắt đầu chia bình ni Các tế bào trì ổn định cách thay môi trường ngày/lần Sau 2-4 hệ nửa tế bào giữ dòng bảo quản -80oC, ngày sau giữ dòng ống tế bào nuôi phục hồi để kiểm tra khả sống sót Kết tế bào phát triển trở lại sau ngày phục hồi (hình 17) Như việc ni ổn định giữ dòng tế bào tiến hành tốt Các tế bào sử dụng cho nghiên cứu chuyển gen vào tế bào biểu protein tái tổ hợp Hình 17 Tế bào HEK293 ni mơi trường DMEM có bổ sung huyết 3.4.2 Chuẩn bị vector pcDNA3.1-NQO1 cho chuyển gen Trong nghiên cứu này, sau tìm plasmid mang cDNA mã hóa cho enzyme NQO1 tiến hành biến nạp vector tái tổ hợp (pcDNA3.1B pcDNA3.1B-NQOQ-15 mang gen mã hóa cho enzyme NQO1) vào tế bào HEK theo phương pháp lipofectamine Biểu tạm thờicủa cDNA NQO1 điều khiển promoter immediate early CMV có nguồn gốc từ cytomegalovirus Trên vector pcDNA3.1B cịn có cấu trúc biểu gen kháng neomycin/kanamycin cho phép chọn dòng tế bào chuyển gen ổn định nhờ kháng sinh chọn lọc geneticine (G418) Ngoài đoạn cDNA ghép nối với đuôi c-myc 6xHis giúp cho trình phát tinh protein tái tổ hợp tế bào vật chủ dễ dàng Để đạt hiệu cao biến nạp DNA ngoại lai vào tế bào plasmid dùng cho biến nạp phải tinh với nồng độ cao Chúng tiến hành tách chiết plasmid tinh phương pháp chiết phenol Vector tái tổ hợp sau kiểm tra chất lượng nồng độ máy đo OD bước sóng 260 280nm Tỷ lệ giá trị OD260/280 >1,8 chứng tỏ plasmid tách đủ tinh cho bước biến nạp vào tế bào động vật 3.4.3 Biểu nhanh NQO1 tế bào động vật Trong nghiên cứu sử dụng phương pháp lipofectamine TM 2000 để biến nạp pc DNA3.1-NQO1 pcDNA3.1B vào tế bào HEK293 Khoảng 24 sau biến nạp thay mơi trường có bổ sung kháng sinh geneticin Mơi trường có bổ sung kháng sinh geneticin thay hàng ngày liên tục ngày Đây thời gian cần thiết để geneticin tác động lên tế bào không nhận DNA plasmid, làm cho chúng bong khỏi bề mặt đĩa nuôi bị loại bỏ lần thay môi trường Khi tất tế bào đĩa nuôi đối chứng hoàn toàn bị chết, tiến hành chọn dòng mang plasmid tái tổ hợp Khi khuẩn lạc chiếm khoảng 1/6 bề mặt giếng nuôi, chuyển tế bào sang đĩa (35x10 mm) Tế bào sau phát triển tốt đĩa nuôi chuyển sang đĩa (60x15 mm), (100x20 mm), giữ chủng giống thu tế bào để phân tích biểu protein Kết thúc thí nghiệm, chúng tơi thu dịch tế bào có chứa protein tổng số Để kiểm tra kết biểu tiến hành điện di biến tính protein gel polyacrylamide 12,6% có SDS Kết điện di protein tổng số mẫu trình bày hình 18 Kết điện di SDS-PAGE cho thấy, dịch chiết protein tổng số mẫu tế bào mang plasmid tái tổ hợp pcDNA3.1B-NQO1 (ở đường chạy số 2), có xuất băng protein có khối lượng phân tử khoảng 33 kDa so với mẫu tế bào mang plasmid pcDNA3.1B (ở đường chạy số 1) Theo phần thiết kế vector biểu protein tái tổ hợp bao gồm đoạn protein NQO1 (274 aa tương ứng với 30kDa) phần myc-his có trọng lượng phân tử khoảng kDa, tương đương với băng có kích thước khoảng 33 kDa Như vậy, protein có trọng lượng phân tử hồn tồn phù hợp với tính tốn lý thuyết Có thể tạm thời khẳng định hệ biểu vector pcDNA3.1B có mang trình tự đoạn gen mã hóa cho protein NQO1 hoạt động dẫn đến biểu protein protein tái tổ hợp mà mong muốn Hình 18 Điện di biểu tạm thời protein gel polyacrylamide 12,6% M: Marker protein (Fermentas) 1: Protein tổng số mẫu tế bào đối chứng mang plasmid pcDNA3.1B 2: Protein tổng số mẫu tế bào HEK mang plasmid tái tổ hợp pcDNA3.1B-NQO1 Protein tái tổ hợp NQO1 có gắn 6x-histidine nên protein tái tổ hợp tinh hệ thống cột resin có gắn nickel chuyên dùng cho protein tái tổ hợp chứa đuôi histidine Resin chất mang dạng agarose liên kết chéo, chứa thụ thể iminodiacetic acid chất làm cầu nối với Ni 2+ Cột resinnickel có lực cao với protein có chứa gốc histidine Việc gắn kết hình thành thơng qua liên kết ion Ni2+ His phân tử protein Protein tinh điều kiện khơng biến tính protein muối imidazol Các tế bào chuyển gen biểu ổn định NQO1 chọn lọc giữ dòng Các kết nghiên cứu cho thấy tiềm ứng dụng kỹ thuật ni cấy tế bào động vật có vú, chuyển gen, biểu nhanh protein chọn dòng tế bào chuyển gen nghiên cứu chuyển gen Việt Nam Đây sở cho nghiên cứu lĩnh vực tạo protein tái tổ hợp có giá trị sử dụng hệ biểu tế bào động vật có vú K T LUẬN VÀ KI N NGHỊ Kết luận Từ kết thu trên, chúng tơi có số kết luận sau:  Từ tế bào nuôi cấy JHH5, tách RNA tổng số có chất lượng đảm bảo, làm nguyên liệu tổng hợp cDNA mã hóa cho enzyme NQO1  Đã nhân đoạn cDNA mã hóa cho enzyme NQO1 Đoạn cDNA mã hóa NQO1 có độ dài tương ứng 822bp mã hóa 274 amino acid tách dịng giải trình tự so với Genbank  Đã thiết kế vector biểu pcDNA3.1 B mang đoạn cDNA mã hóa NQO1 biểu tạm thời gen mã hóa cho enzyme NQO1 tế bào HEK293 Kiến ngh  Tiếp tục nghiên cứu biểu cDNA mã hóa NQO1 vector pcDNA3.1B tế bào HEK293  Nghiên cứu phương pháp thu hồi tinh protein NQO1 TÀI LI U THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt Đặng Trần Hoàng, Vũ Minh Đức, Phùng Thu Nguyệt, Trương Nam Hải (2005), "Biểu gen interleukin-2 người rh-IL2MM bị đột biến điểm glycosyl hóa gốc cysteine 125 Escherichia coli", Tạp chí Công nghệ Sinh học, 3(2),tr 149-154 Lã Thị Huyền, Nguyễn Phương Hoa, Đặng Thị Thu, Lê Quang Huấn (2009), "Biểu kháng nguyên CD25 tái tổ hợp vi khuẩn E coli", Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, 7(3), tr 319-324 Lê Trầm Nghĩa, Thư Trần Phong, Hoàng Thanh Tuấn, Quan Quốc Đăng, Đỗ Minh Sĩ, Đàm Sao Mai (2010), "Sản xuất protein Erthroprotein thơng qua q trình chuyển gen tế bào CHO-K1(Chinese Hamster ovary)", Tạp chí Khoa học Phát triển, 8(3), tr 498-504 Lê Trần Bình, Cao Huyền Trang (2005), "Nghiên cứu phát triển sản xuất vaccine ăn thực vật", Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, 3(2), tr 133-142 Nguyễn Bích Nhi, Masashi Suzuki (2003), "Chuyển biểu gien yếu tố sinh trưởng nguyên bào sợi 10 người (HFGF-10) tế bào động vật bậc cao", Tạp chí Sinh học, 25(4), tr 37-41 Nguyễn Đình Cường, Lê Thị Thu Hiền, Nông Văn Hải, Đặng Thành Nam, Phan Văn Chi (2004), "Tinh chế phân tích khối phổ protein bất hoạt ribosome tái tổ hợp từ mướp đắng (Momordica charantia L.) ", Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, 2(2), tr 217-226 Nguyễn Hải Hà, Lê Thị Thu Hiền, Nông Văn Hải (2009), "Biểu protein huỳnh quang xanh (GFP) tế bào động vật có vú ni cấy", Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, 7(3), tr 313-318 Nguyễn Hải Hà, Nguyễn Văn Phịng, Nguyễn Đăng Tơn, Nguyễn Huy Hồng, Quyền Đình Thi, Nơng Văn Hải (2010), "Biểu yếu tố hoạt hóa plasminogen mơ (h-tPA) người tế bào", Kỷ yếu hội nghị sinh học phân hóa sinh y học, tr 185-191 Nguyễn Hồng Lộc (2006), "Giáo trình Cơng nghệ tế bào", NXB Đại học Huế, tr 203 10 Nguyễn Huy Hoàng, Rita Bernhardt (2012), "Đánh giá biểu Cyp11Bs dòng tế bào HCT116", Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, 34(3), tr 326-330 11 Nguyễn Thùy Dương, Nguyễn Văn Phịng, Nơng Văn Hải (2010), "Tách dịng phân tích trình tự cDNA mã hóa yếu tố đơng máu IX (h-F9) người", Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, 8(4), tr 1785-1792 12 Nguyễn Thúy Hà, Nguyễn Bích Nhi, Đỗ Khắc Hiếu, Phan Văn Chi (2003), "Khả ức chế dòng tế bào ung thư nuôi cấy in vitro Trichobakin tái tổ hợp", Y học Việt Nam, 284, tr 26-30 13 Vũ Ngọc Tân, Vũ Minh Đức, Lê Thị Lan Anh, Bùi Khánh Chi, Trương Nam Hải (2009), "Biểu gen mã hóa interleukin-2 người tế bào Escherichia coli", Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, 7(1), tr 35-39 Tài liệu tiếng Anh 14 Alard A, Fabre B, Anesia R, Marboeuf C, Pierre P, Susini C, Bousquet C, Pyronnet S (2010), "NAD(P)H quinone-oxydoreductase protects eukaryotic translation initiation factor 4GI from degradation by the proteasome.", Mol Cell Biol, 30(4), pp 1097-1105 15 Albena T, Dinkova-Kostova and Talalay Paul (2010), "NAD(P)H:quinone acceptor oxidoreductase (NQO1), a multifunctional antioxidant enzyme and exceptionally versatile cytoprotector", Arch Biochem Biophys, 501(1), pp 116-118 16 Anwar A, Dehn D, Siegel D, Kepa JK, Tang LJ, Pietenpol JA, Ross D (2003), "Interaction of human NAD(P)H:quinone oxidoreductase (NQO1) with the tumor suppressor protein p53 in cells and cell-free systems.", J Biol Chem, 278(12), pp 10368-10373 17 Asher G, Bercovich Z, Tsvetkov P, Shaul Y, Kahana C (2005), "20S proteasomal degradation of ornithine decarboxylase is regulated by NQO1.", Mol Cell Biol, 17(5), pp 645-655 18 Asher G, Dym O, Tsvetkov P, Adler J, Shaul Y (2006), "The crystal structure of NAD(P)H quinone oxidoreductase in complex with its potent inhibitor dicoumarol.", Biochemistry, 45(20), pp 6372-6378 19 Asher G, Lotem J, Cohen B, Sachs L, Shaul Y (2001), "Regulation of p53 stability and p53-dependent apoptosis by NADH quinone oxidoreductase 1.", Proc Natl Acad Sci U S A, 98(3), pp 1188-1193 20 Asher G, Lotem J, Kama R, Sachs L, Shaul Y (2002), "NQO1 stabilizes p53 through a distinct pathway.", Proc Natl Acad Sci USA, 99(5), pp 30993104 21 Asma Chinigarzadeh, Razauden Zulkifli, Iman Yaze and Reyhaneh rahnamai tajadod (2012), "Isolation and cloning of human NQO1 promoter in Pgl3 basic vector", International journal of scientific & technology research, 1(7), pp 2277-8616 22 Bauer AK, Faiola B, Abernethy DJ, Marchan R, Pluta LJ, Wong VA, Roberts K, Jaiswal AK, Gonzalez FJ, Butterworth BE, Borghoff S, Parkinson H, Everitt J, Recio L ( 2003 ), "Genetic susceptibility to benzene-induced toxicity: role of NADPH: quinone oxidoreductase-1.", Cancer Res, 63, pp 929-935 23 Beyer RE, Segura-Aguilar J, di Bernardo S, Cavazzoni M, Fato R, Fiorentini D, Galli MC, Setti M, Landi L, Lenaz G (1997), "The two-electron quinone reductase DT-diaphorase generates and maintains the antioxidant (reduced) form of coenzyme Q in membranes.", Mol Aspects Med, 18, pp 15-23 24 Bianchet MA, Faig M, Amzel LM (2004), "Structure and mechanism of NAD[P]H:quinone acceptor Enzymol., 382, pp 144-174 oxidoreductases (NQO)", Methods 25 Bui CB, Shin J ((2011), "Persistent expression of Nqo1 by p62-mediated Nrf2 activation facilitates p53-dependent mitotic catastrophe", Biochem Biophys 412, pp 347-352 26 Chandrasena RE, Edirisinghe PD, Bolton JL, Thatcher GR (2008), "Problematic detoxification of estrogen quinones by NAD(P)Hdependent quinone oxidoreductase and glutathione-S-transferase.", Chem Res Toxicol, 21(7), pp 1324-1329 27 Deller S, Macheroux P, Sollner S (2008), "Flavin-dependent quinone reductases", Cell Mol Life Sci, 65(1), pp 141-160 28 Dinkova-Kostova AT, Cheah J, Samouilov A, Zweier JL, Bozak RE, Hicks RJ, Talalay P (2007), "Phenolic Michael reaction acceptors: combined direct and indirect antioxidant defenses against electrophiles and oxidants.", Med Chem, 3, pp 261-268 29 Dinkova-Kostova AT, Fahey JW, Talalay P (2004), "Chemical structures of inducers of nicotinamide quinone oxidoreductase (NQO1).", Methods Enzymol., 382, pp 423-448 30 Dinkova-Kostova AT, Talalay P (2008 ), "Direct and indirect antioxidant properties of inducers of cytoprotective proteins", Mol Nutr Food Res, 52, pp 128-138 31 Fagerholm Retal (2008), "NAD(P)H:quinone oxidoreductase NQO1*2 genotype (P187S) is a strong prognostic and predictive factor in breast cancer.", Nat Genet, 40(7), pp 844-853 32 Fahey JW, Dinkova-Kostova AT, Stephenson KK, Talalay P (2004), "The "Prochaska" microtiter plate bioassay for inducers of NQO1", Methods Enzymol., 382, pp 243-258 33 Faig M, Bianchet MA, Talalay P, Chen S, Winski S, Ross D, Amzel LM (2000), "Structures of recombinant human and mouse NAD(P)H:quinone oxidoreductases: species comparison and structural changes with substrate binding and release.", Proc Natl Acad Sci USA, 97(7), pp 3177-3182 34 Fridovich I (1995), "Superoxide radical and superoxide dismutases", Annu Rev Biochem, 64, pp 97-106 35 Gaikwad A, Long DJ 2nd, Stringer JL, Jaiswal AK (2001), "In vivo role of NAD(P)H:quinone oxidoreductase (NQO1) in the regulation of intracellular redox state and accumulation of abdominal adipose tissue.", J Biol Chem, 276(25), pp 22559-22564 36 Gaikwad NW, Rogan EG, Cavalieri EL (2007), "Evidence from ESI-MS for NQO1-catalyzed reduction of estrogen ortho-quinones.", Free Radic Biol Med, 43(9), pp 1289-1299 37 Garate M, Wong RP, Campos EI, Wang Y, Li G (2008), "NAD(P)H quinone oxidoreductase inhibits the proteasomal degradation of the tumour suppressor p33(ING1b).", EMBO Rep, 9(6), pp 576-581 38 Gong X, Kole L, Iskander K, Jaiswal AK (2007), "NRH:quinone oxidoreductase and NAD(P)H:quinone oxidoreductase protect tumor suppressor p53 against 20s proteasomal degradation leading to stabilization and activation of p53.", Cancer Res, 67(11), pp 5380-5388 39 Hayes JD, McMahon M (2009), "NRF2 and KEAP1 mutations: permanent activation of an adaptive response in cancer", Trends Biochem Sci, 34(4), pp 176-188 40 Holtzclaw WD, Dinkova-Kostova AT, Talalay P (2004), "Protection against electrophile and oxidative stress by induction of phase genes: the quest for the elusive sensor that responds to inducers.", Adv Enzyme Regul., 44, pp 335-367 41 Iskander K, Gaikwad A, Paquet M, Long DJ 2nd, Brayton C, Barrios R, Jaiswal AK (2005), "Lower induction of p53 and decreased apoptosis in NQO1-null mice lead to increased sensitivity to chemical-induced skin carcinogenesis.", Cancer Res, 65(6), pp 2054-2058 42 Itoh K, Wakabayashi N, Katoh Y, Ishii T, O'Connor T, Yamamoto M (2003), "Keap1 regulates both cytoplasmic-nuclear shuttling and degradation of Nrf2 in response to electrophiles.", Genes Cells, 8(4), pp 379-391 43 Jia Z, Zhu H, Misra BR, Li Y, Misra HP (2008), "Dopamine as a potent inducer of cellular glutathione and NAD(P)H:quinone oxidoreductase in PC12 neuronal cells: a potential adaptive mechanism for dopaminergic neuroprotection.", Neurochem Res, 33(11), pp 205 44 Kensler TW, Wakabayashi N, Biswal S (2007), "Cell survival responses to environmental stresses via the Keap1-Nrf2-ARE pathway", Annu Rev Pharmacol Toxicol, 47, pp 89-127 45 Lim JH, Kim KM, Kim SW, Hwang O, Choi HJ (2008 ), "Bromocriptine activates NQO1 via Nrf2-PI3K/Akt signaling: novel cytoprotective mechanism against oxidative damage.", Pharmacol Res, 57(5), pp 325331 46 Liu F, Luo L, Wei Y, Wang W, Li B, Yan L, Wen T (2013), "A functional NQO1 609C:T polymorphism and risk of hepatocellular carcinoma in a Chinese population.", Tumour Biol, 34(1), pp 47-53 47 Long DJ 2nd, Gaikwad A, Multani A, Pathak S, Montgomery CA, Gonzalez FJ, Jaiswal AK (2002), "Disruption of the NAD(P)H:quinone oxidoreductase (NQO1) gene in mice causes myelogenous hyperplasia.", Cancer Res, 62(11), pp 3030-3036 48 Lu F, Zahid M, Wang C, Saeed M, Cavalieri EL, Rogan EG (2008), "Resveratrol prevents estrogen-DNA adduct formation and neoplastic transformation in MCF-10F cells", Cancer Prev Res (Phila), 1(2), pp 135-145 49 Montano MM, Chaplin LJ, Deng H, Mesia-Vela S, Gaikwad N, Zahid M, Rogan E (2007), "Protective roles of quinone reductase and tamoxifen against estrogen-induced mammary tumorigenesis.", Oncogene, 26(24), pp 3587-3590 50 Motohashi H, Yamamoto M (2004), "Nrf2-Keap1 defines a physiologically important stress response mechanism.", Trends Mol Med, 10(11), pp 549-557 51 Nguyen T, Nioi P, Pickett CB (2009), "The Nrf2-antioxidant response element signaling pathway and its activation by oxidative stress.", J Biol Chem, 284(20), pp 13291-13295 52 Nioi P, McMahon M, Itoh K, Yamamoto M, Hayes JD (2003), "Identification of a novel Nrf2-regulated antioxidant response element (ARE) in the mouse NAD(P)H:quinone oxidoreductase gene: reassessment of the ARE consensus sequence", Biochem J, 374, pp 337-348 53 Oshrat Hershkovitz, Rokah Ofer Shpilberg, Galit Granot (2010), "NAD(P)H quinone oxidoreductase protects TAp63γ from proteasomal degradation and regulates TAp63γ-dependent growth arrest", PLoS One, 5(6), pp e11401 54 Patrick BA, Gong X, Jaiswal AK (2011), "isruption of NAD(P)H:quinone oxidoreductase gene in mice leads to 20S proteasomal degradation of p63 resulting in thinning of epithelium and chemical-induced skin cancer", Oncogene, 30, pp 1098-1107 55 Prochaska HJ, Santamaria AB, Talalay P (1992), "Rapid detection of inducers of enzymes that protect against carcinogens", Proc Natl Acad Sci USA, 89(6), pp 2394-2398 56 Ross D (2004), "Quinone reductases multitasking in the metabolic world", Drug Metab Rev, 36, pp 639-654 57 Ross D, Siegel D (2004), "NAD(P)H:quinone oxidoreductase (NQO1, DTdiaphorase), functions and pharmacogenetics", Methods Enzymol., 382, pp 115-144 58 SantaCruz KS, Yazlovitskaya E, Collins J, Johnson J, DeCarli C (2004), "Regional NAD(P)H:quinone oxidoreductase activity in Alzheimer's disease.", Neurobiol Aging, 25(1), pp 63-69 59 Siegel D, Bolton EM, Burr JA, Liebler DC, Ross D (1997), "The reduction of alpha-tocopherolquinone by human NAD(P)H: quinone oxidoreductase: the role of alpha-tocopherolhydroquinone as a cellular antioxidant.", Mol Pharmacol , 52(2), pp 300-305 60 Siegel D, Gustafson DL, Dehn DL, Han JY, Boonchoong P, Berliner LJ, Ross D (2004), "NAD(P)H:quinone oxidoreductase 1: role as a superoxide scavenger", Mol Pharmacol, 65(5), pp 1238-1247 61 Siegel D, Kepa JK, Ross D (2012), "NAD(P)H:quinone oxidoreductase (NQO1) localizes to the mitotic spindle in human cells", PLoS ONE, 7(9), pp e44861 62 Singh S, Chakravarti D, Edney JA, Hollins RR, Johnson PJ, West WW, Higginbotham SM, Cavalieri EL, Rogan EG (2005), "Relative imbalances in the expression of estrogen-metabolizing enzymes in the breast tissue of women with breast carcinoma.", Oncol Rep, 14(4), pp 1091-1096 63 Singh S, Zahid M, Saeed M, Gaikwad NW, Meza JL, Cavalieri EL, Rogan EG, Chakravarti D (2009), "NAD(P)H:quinone oxidoreductase Arg139Trp and Pro187Ser polymorphisms imbalance estrogen metabolism towards DNA adduct formation in human mammary epithelial cells.", J Steroid Biochem Mol Biol, 117(1-3), pp 56-66 64 Su XL, Yan MR, Yang L; Qimuge-Suyila (2012), "NQO1 C609T polymorphism correlated to colon cancer risk in farmers from western region of Inner Mongolia", Chin J Cancer Res, 24(4), pp 317-322 65 Thomas P, Smart TG (2005), "HEK293 cell line: a vehicle for the expression of recombinant proteins.", J Pharmacol Toxicol Methods, 51(3), pp 187200 66 van Muiswinkel FL, de Vos RA, Bol JG, Andringa G, Jansen Steur EN, Ross D, Siegel D, Drukarch B (2004), "Expression of NAD(P)H:quinone oxidoreductase in the normal and Parkinsonian substantia nigra.", Neurobiol Aging, 25(9), pp 1253-1262 67 Wang B, Jin F, Xie Y, Tang Y, Kan R, Zheng C, Yang Z, Wang L (2006), "Association analysis of NAD(P)H:quinone oxidoreductase gene 609 C/T polymorphism with Alzheimer's disease.", Neurosci Lett, 409(3), pp 179-181 68 Williams-Ashman HG, Higgins C (1961), "Oxydation of reduced pyridine nucleotides in mammary gland and adipose tissue following treatment with polynuclear hydrocarbons", Med Exp Int J Exp Med., 4, pp 223226 69 Zafar KS, Inayat-Hussain SH, Siegel D, Bao A, Shieh B, Ross D (2006), "Overexpression of NQO1 protects human SK-N-MC neuroblastoma cells against dopamine-induced cell death.", Toxicol Lett, 166(3), pp 261-267 70 Zhang DD, Lo SC, Cross JV, Templeton DJ, Hannink M (2004), "Keap1 is a redox-regulated substrate adaptor protein for a Cul3-dependent ubiquitin ligase complex.", Mol Cell Biol, 24(24), pp 10941-10953 71 Zhu H, Jia Z, Mahaney JE, Ross D, Misra HP, Trush MA, Li Y (2007), "The highly expressed and inducible endogenous NAD(P)H:quinone oxidoreductase in cardiovascular cells acts as a potential superoxide scavenger", Cardiovasc Toxicol, 7(3), pp 202-211 Trang web tham khảo: 72 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ 73 http://www.lifetechnologies.com ... mã h? ?a NQO1 3.3 Tạo dịng thiết kế vector biểu gen NQO1 3.3 .1 Thiết kế c? ?p mồi PCR Để phân l? ?p đoạn cDNA mã h? ?a cho protein NQO1 từ cDNA tổng số, cần phải có c? ?p mồi đặc hiệu cho phản ứng nhân... H? ?nh Mật độ điện tích mơ h? ?nh NQO1 tinh thể liên kết với 16 phân tử H? ?nh Cấu trúc vector biểu pcDNA3 .1( +)myc-his B 21 (Theo h? ?ng Invitrogen) H? ?nh Sơ đồ quy trình phân l? ?p thiết kế vector biểu mang. .. khác biệt: liên kết FAD, liên kết phần adenine ribose NAD( P) , phần khác liên kết với chất nhận H hay chất cho H Sự kh? ?p nối chất nhận H vị trí cho phù h? ? ?p với chế ping-pong NQO1 [33] A B H? ?nh