Luận văn thạc sĩ phân lập các chất từ dịch chiết vi khuẩn lam có khả năng ức chế tăng trưởng một số dòng tế bào ung thư

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ***** Bùi Thị Thùy Dung PHÂN LẬP CÁC CHẤT TỪ DỊCH CHIẾT VI KHUẨN LAM CÓ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ TĂNG TRƢỞNG MỘT SỐ DÒNG TẾ BÀO UNG THƢ LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – Năm 2016 Bùi Thị Thùy Dung PHÂN LẬP CÁC CHẤT TỪ DỊCH CHIẾT VI KHUẨN LAM CÓ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ TĂNG TRƢỞNG MỘT SỐ DÒNG TẾ BÀO UNG THƢ Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Cán hƣớng dẫn: TS Phạm Thị Lƣơng Hằng PGS TS Hoàng Thị Mỹ Nhung Luận văn cao học 2016 LỜ I CẢ M ƠN Bùi Thị Thùy Dung Lời đầu tiên, xin gƣ̉ i lời cảm ơn sâu sắc nhất tới TS Phạm Thị Lƣơng Hằng PGS.TS Hoàng Thị Mỹ Nhung, ngƣơì đã trƣc tiế p hƣơ ng ́ dân điều kiên thuân lơ , giúp đỡ suốt qua trình i hoc , tạo moi tâ và hoaǹ thaǹ h luân p văn Cac cô không ngƣời trùn đạt cho tơi kiến thức mà cịn hỗ trợ rất nhiều về vật chất Tôi thấy mình thật may mắn đƣợc học trò cac cô Tôi xin gƣ̉ i lơì cam ̉ ơn chân thaǹ h nhất tơí ThS Bùi Thị Vân Khánh, ThS Nguyê Đắ c Tu , nhƣñ g ngƣơi chi ̣, ngƣơi anh tân tinh hƣơ ng ́ ̀ ̀ ́ ̀ n dân thuâṭ đầ u tiên bƣớ c chân và o phò ng thí nghiêm cho nhƣ̃ ng kinh nghiêm công viêc cuôc nhƣñ g ki Anh, chị không truyền đạt mà cả nhƣ̃ ng kinh nghiêm quý baú sống, đó sẽ là nhƣn ̃ g haǹ h trang mà sẽ mang theo sau naỳ Xin gửi lời cảm ơn đến CN Nguyễn Thị Thu Hà, CN Hà Hữu Cƣờng, CN Nguyễn Thị Loan, CN Vũ Anh Công nhiệt tình giúp đỡ qua trình làm thí nghiệm Xin gƣ̉ i lờ i cả m ơn sâu sắ c nhấ t tớ i cá c thầ y cô và cá n bô ̣ Khoa Sinh học, đăc biêṭ la cac thầy cô ̀ ́ hoc Bô ̣môn Sinh tế bào Bộ môn Sinh lí Thực vật Hóa sinh đã giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho hoàn thành lu ận văn Và, xin chân thaǹ h cam ̉ ơn cać anh chi ̣, cac bạn cac em Phịng thí nghiệm Ni cấy Tế bào ngƣời động vật nhƣ Phịng thí nghiệm iii Luận văn cao học Bùi Thị Thùy Nuôi cấy Mô thực vật Vi tảo đã đồng hành , quan tâm và giúp đỡ 2016 Dung thời gian tham gia nghiên cƣ́ u taị Sƣ̣ quan tâm , chia sẻ cac bạn cac em động lực lớn lao với lúc mệt mỏi khó khăn nhất Tôi sẽ không quên thời gian làm việc đầ y ắp tiếng cƣơì cuǹ g cać ban gia đinh ̀ lớn trƣờng Đại học khoa học tự nhiên Hà Nội iv hai Xin gửi lời cảm ơn đến Quỹ phát triển Khoa học Công nghệ Quốc gia (NAFOSTED) tài trợ kinh phí cho nghiên cứu đề tài mang mã số 106.16-2012.24 Cuối cùng, xin gƣ̉ i lòng biết ơn sâu sắc và lớn lao nhất đến gia đình , nhƣñ g ngƣơì đã hy sinh cả vâṭ chất và tinh thần , yêu thƣơng , ủng hộ, đôn g viên và tôn tron g moi quyêt́ đin h cuả Mỗi nghĩ về gia điǹ h nhƣ đƣơc tiếp thêm sƣ́ c man h để vƣ̃ng tin hoàn thành tốt luận văn Hà Nội, tháng 12 năm 2016 Học viên Bùi Thị Thuỳ Dung BẢNG KÍ HIỆU CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT Tƣ̀ viết tắ t Tên tiếng Anh Tên tiếng Việt ED50 Median effective dose Liều có hiệu 50% số động vật thí nghiệm EtOAc Ethyl acetate Dung môi ethyl acetate HCT116 Human colon carcinoma cell Dòng tế bào ung thƣ đại trực tràng HepG2 Hepatocellular carcinoma G2 Dòng tế bào ung thƣ gan IC50 Half maximal inhibitory concetration Nồng độ ức chế 50% số tế bào LC/MS Liquid chromatography–mass spectrometry Sắc kí lỏng - khối phổ LD50 Median lethal dose 50% Liều gây chết trung bình MCF7 Breast adenocarcinoma cell Dòng tế bào ung thƣ vú MeOH Methanol Dung môi methanol Minimal inhibitory MIC concentration Nồng độ ức chế tối thiểu n-Hex n-Hexan Dung môi n-Hexan OD Optical Density Mật độ quang học SRB Sulforhodamine B Sulforhodamine B TLC Thin-layer chromatography Sắc kí mỏng MỤC LỤC MỞ ĐẦU Chƣơng 1- TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Vi khuẩn lam 1.1.1 Đặc điểm hình thai sinh lí vi khuẩn lam 1.1.2 Phân loại vi khuẩn lam .3 1.2 Tiềm phat triển dƣợc phẩm điều trị ung thƣ từ vi khuẩn lam 1.3 Cac hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học từ vi khuẩn lam 1.4 Phân tach cac hợp chất thiên nhiên từ vi khuẩn lam 13 Chƣơng 2- VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1 Vật liệu .15 2.1.1 Cac chủng vi khuẩn lam 15 2.1.2 Dòng tế bào .16 2.2 Cac nội dung nghiên cứu 17 2.3 Cac phƣơng phap nghiên cứu .17 2.3.1 Đanh gia khả ức chế tăng sinh tế bào 17 2.3.2 Chuẩn bị dịch chiết từ sinh khối vi khuẩn lam Nostoc sp APD4 19 2.3.3 Phƣơng phap sắc kí cột silica gel 20 2.3.5 Phƣơng phap LC/MS 21 Chƣơng 3- KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .22 3.1 Đanh gia khả ức chế tăng sinh tế bào ung thƣ 22 3.1.1 Kết hoạt hóa tế bào 22 3.1.2 Xac định số IC50 cac dịch chiết từ vi khuẩn lam 22 3.2 Phân lập cac chất có hoạt tính ức chế tăng sinh tế bào từ vi khuẩn lam Nostoc sp APD4 29 3.2.1 Sự phân tach cột sắc ký silica gel 29 3.2.2 Sự phân tach cột sắc kí sillica gel lần 32 3.2.3 Sự phân tach cột sắc kí silica gel lần 35 3.3 Xac định khối lƣợng phân tử hoạt chất phƣơng phap LC/MS 37 KẾT LUẬN .43 KIẾN NGHỊ 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO 45 PHỤ LỤC DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cấu trúc hóa học Cryptophycin [36] Hình 1.2 Cấu trúc hóa học Borophycin [17] Hình 2.1 Cac chủng vi khuẩn lam dùng nghiên cứu 16 Hình 3.1 Cac dòng tế bào ung thƣ dùng phép thử hoạt tính 22 Hình 3.2 Tế bào MCF7 mẫu đối chứng sau 48h thử nghiệm 23 Hình 3.3 Tế bào MCF7 dƣới tac dụng dịch chiết APD4- EtOAc 24 Hình 3.4 Tế bào HCT116 dƣới tac dụng dịch chiết APD4- EtOAc .24 Hình 3.5 Tế bào HepG2 dƣới tac dụng dịch chiết APD4- EtOAc .24 Hình 3.6 Đƣờng cong đap ứng liều cac dịch chiết có hoạt tính hai dịng tế bào MCF7 HCT116 27 Hình 3.7 Đƣờng cong đap ứng liều dòng tế bào MCF7 đối với Taxol 28 Hình 3.8 Cac phân đoạn rửa giải từ dịch chiết APD4-Met 30 Hình 3.9 Hình dạng tế bào MCF7 đƣợc ủ với phân đoạn DE5 32 Hình 3.10 Sắc kí cột silica gel cho phân đoạn có hoạt tính (DM-E) 33 Hình 3.11 Tế bào MCF7 ủ với phân đoạn DP1 DP5 nờng độ 50µg/ml 34 Hình 3.12 Sắc ký đồ TLC phân đoạn DP1 DP5 .35 Hình 3.13 Tế bào MCF7 dƣới tac dụng phân đoạn DF4 36 Hình 3.14 Sắc kí đờ phân đoạn DF2 bƣớc sóng 256nm 37 Hình 3.15 Sắc kí đờ phân đoạn DF4 bƣớc sóng 256nm 38 Hình 3.16 Phổ khối lƣợng hợp chất P3 xuất phút 23,6 .39 Hình 3.17 Kết tra cứu hợp chất có trọng lƣợng phân tử từ 795-796 dalton thang 10/2016 40 Hình 3.18 Công thức cấu tạo Apratoxin E [26] 41 DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Một số chất có khả khang ung thƣ đƣợc phân lập từ vi khuẩn lam [39] Bảng 2.1 Cac chủng vi khuẩn lam dùng thí nghiệm đanh gia hoạt tính .15 Bảng 3.1 Gia trị tăng sinh A% cac dịch chiết có hoạt tính ức chế tăng sinh tế bào dòng MCF7 .25 Bảng 3.2 Gia trị tăng sinh A% cac dịch chiết có hoạt tính ức chế tăng sinh tế bào dòng HCT116 26 Bảng 3.3 Gia trị IC50 số dịch chiết có hoạt tính .27 Bảng 3.4 Gia trị IC50 Taxol ba dòng tế bào MCF7, HCT116 HepG2 28 Bảng 3.5 Khối lƣợng cac phân đoạn từ dịch chiết chủng APD4 31 Bảng Khối lƣợng khô cac phân đoạn thu đƣợc từ cột silica gel lần 34 Bảng 3.7 Khối lƣợng cac phân đoạn thu đƣợc từ cột sắc ký silica gel lần 36 Bảng 3.8 Tỷ lệ tƣơng đối về hàm lƣợng cac chất phân đoạn DF4 .38 Hình 1.2 Cấu trúc hóa học Borophycin [17] Apratoxin A chất chuyển hóa thứ cấp đƣợc phân lập lần đầu tiên từ vi khuẩn lam Lyngbya majuscule Apratoxin A có cấu trúc hỗn hợp peptidepolyketide dạng vịng, gờm vòng thiazoline Đây chất có khả gây độc mạnh đối với tế bào ung thƣ khả kích thích tế bào phân chia bị bắt giữ pha G1, gây qua trình apoptosis (chết theo chƣơng trình) Mặc dù chất có khả gây độc 60 dòng tế bào khối u nhƣng cac nhà nghiên cứu chƣa tìm chế hoạt động chúng [4] Theo nghiên cứu Martins cộng cho tế bào HL-60 tiếp xúc với dịch chiết cac chủng vi khuẩn lam Synechocytis sp Synechococcus sp có tƣợng apoptosis xuất tế bào thử nghiệm Cụ thể, có biến đổi phần màng tế bào, tế bào bị co rút bắt đầu xuất hiện tƣợng phân mảnh nhân Bên cạnh đó, glycoside đƣợc phân lập từ Lyngbya sp hay Anabaena sp tham gia vào qua trình thúc đẩy tế bào ung thƣ tham gia vào chu trình apoptosis với dấu hiệu ban đầu ngƣng tụ chất nhiễm sắc phân mảnh nhân Cac sản phẩm từ dịch chiết vi khuẩn lam (Bảng 1.1) gây ảnh hƣởng đến sinh trƣởng phat triển cac dòng tế bào ung thƣ, đƣa chúng vào chu trình chết tế bào thông qua cac hoạt động nhƣ: bắt giữ tế bào chu kì tế bào, làm rối loạn chức ty thể, lạp thể, gây cac hoạt động oxi hóa, thay đổi caspase để ngăn chặn không cho chúng tham gia vào cac qua trình cắt nối hay thay đổi họ protein Bcl-2 thay đổi hoạt động cac kênh vận chuyển màng ty thể, đều đƣờng trực tiếp dẫn tới apoptosis [7] Bảng 1.1 Một số chất có khả khang ung thƣ đƣợc phân lập từ vi khuẩn lam [37] STT Tên chất Từ vi khuẩn lam Dòng tế bào tac động Ankaraholide A Geitlerinema sp Cac dòng tế bào ung thƣ: phổi H460, vú MDA-MB 435, đại trƣc tràng LoVo, vòm họng KB Apratoxin A-G Belamide A Lyngbya majuscule Ung thƣ mau U2OS, Lyngbya sp cổ tử cung HeLa, phổi Lyngbya sordida H460, đại trực tràng Lyngbya bouilloni HCT116 Symploca sp Ung thƣ đại trực tràng HCT116 Calothrixin A Calothrix sp Ung thƣ cổ tử cung HeLa Caylobolide A Lyngbya majuscula Ung thƣ đại trực tràng HCT116 Dolastatin 10 Symploca sp Ung thƣ phổi cac dòng: H69, H82, H446 H510, ung thƣ mau lympho Cryptophycin Nostoc sp Ung thƣ vú ngƣời MDA-MB-435, ung thƣ phổi A549 Curacin A Lyngbya majuscula Ung thƣ phổi A549 Symplostatin Symploca hydnoides Ung thƣ vú ngƣời MDA-MB-435 10 Malevamide D Symploca hydnoides Ung thƣ phổi A549, HT29, ung thƣ da SKMEL-28 1.3 Các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học từ vi khuẩn lam Hợp chất tự nhiên (hay hợp chất thiên nhiên) cac chất hóa học có nguồn từ tự nhiên đƣợc ngƣời tach từ cac loài động vật, thực vật có tự nhiên có thể có hoạt tính sinh học tac dụng dƣợc học dùng để làm thuốc [5] Chúng nguồn cung cấp cac cấu trúc dẫn đƣờng để tổng hợp cac chất tƣơng tự nhƣng đạt hiệu dƣợc lí an tồn cao hơn, đƣợc xem mốc khởi đầu qua trình tổng hợp sản xuất thuốc Vào năm 1891, Albrecht Kossel đề xuất chia cac hợp chất tự nhiên thành hai nhóm chính, đó là: cac hợp chất sơ cấp cac hợp chất thứ cấp [22] Trong đó, cac hợp chất thứ cấp không thực cần thiết cho sống thân sinh vật nhƣng chúng gây tac động đến cac sinh vật khac, làm tăng khả cạnh tranh cac sinh vật môi trƣờng sống Do có khả điều chỉnh đƣờng truyền sinh hóa tín hiệu, vài chất chuyển hóa thứ cấp có tính chất dƣợc liệu hữu ích Cac hợp chất sinh học vi khuẩn lam cung cấp nguồn dƣợc liệu mới, nhiều tiềm Sự đa dạng mới lạ cac chất tìm thấy vi khuẩn lam đƣợc so sanh với xạ khuẩn- nhóm vi khuẩn cung cấp nhiều dƣợc phẩm quan trọng [3, 34] Cac chất đƣợc tìm thấy vi khuẩn lam gồm nhiều nhóm chất khac bao gồm: alkaloid, terpenoid, polyketide peptide không phụ thuộc ribosome Phần lớn cac sản phẩm đƣợc sản xuất thông qua đƣờng sinh tổng hợp polyketide (PKS) peptide không phụ thuộc vào ribosome (NRPS) phối hợp hai [24] Cac nhóm chất từ vi khuẩn lam thể nhiều hoạt tính sinh học khac nhau: khang khuẩn, khang ung thƣ, khang virus, ức chế miễn dịch, ức chế hoạt động proteinase, đều mục tiêu nghiên cứu quan trọng sinh y học 1.3.1 Nhóm chất alkaloid Sự phân lập định tính alkaloid đƣợc bắt đầu từ rất sớm, vào năm 1960 Đây nhóm cac chất có độc tính cao, với liều vài milligram có thể gây tử vong cho ngƣời Cac alkaloid có tac dụng sinh học rất đa dạng, chủ yếu làm dƣợc phẩm nhƣ: cac thuốc ức chế thần kinh trung ƣơng (morphin, scopolamine, L- tetrahydropalmatin), cac thuốc điều trị bệnh tim (ajmalin), cac thuốc điều trị bệnh cao huyết ap (reserpine, ajmalixin),…Mỗi alkaloid khac có hoạt tính sinh học khac nhau, đó, vài chục alkaloid đƣợc sử dụng rộng rãi y học nông nghiệp [1] Anatoxin-a sản phẩm đƣợc phat vào năm đầu thập niên 1960 đƣợc phân lập lần đầu tiên vào năm 1972 J P Devlin từ chủng vi khuẩn lam Anabeana flos aquae Chúng đƣợc biết đến với cai tên “Yếu tố gây chết nhanh” (Very Fast Death Factor), chúng có khả gây độc nhanh mạnh lên hệ thần kinh làm co giật tử vong liệt hô hấp Bằng cach liên kết với thụ thể nicotinic acetylcholine (nAchR) màng tế bào thần kinh, Anatoxin-a thay đổi hoạt động cac kênh vận chuyển ion qua màng làm cho cac cation qua màng, cuối dẫn đến tắc nghẽn truyền tín hiệu xung thần kinh [10] Cylindrospermopsin alkaloid tự nhiên mang độc tính đƣợc phân lập từ cac lồi vi khuẩn lam: Cylindrospermopsis raciborskii, Umezakia natans, Aphanizomenon ovalisporum, Anabaena bergii Raphidiopsis curvata Cấu trúc hóa học chất đƣợc phat vào năm 1992, bao gồm trycyclic guanidine liên kết với hydroxymethyluracil Dựa cấu trúc nucleotide khả phản ứng guanine nhóm sulphate Cyclindrospermopsin, cac nhà nghiên cứu rằng, chất có khả liên kết với DNA/RNA đối tƣợng thí nghiệm Cụ thể, có liên kết chúng với DNA gan chuột mô hình nghiên cứu in vivo, Cyclindrospermopsin gây pha vỡ DNA gan đồng thời làm tăng số lƣợng cac nucleic nhỏ tế bào ung thƣ mau lympho dòng WIL2-NS [38] 1.3.2 Nhóm chất terpenoid Cac terpenoid có vai trị chức đa dạng cac hoạt động sinh học Chúng có thể cac hormones (gibberellins, abscisic acid), cac sắc tố quang hợp (phytol, carotenoids), cac chất dẫn truyền điện tử (ubiquinone, plastoquinon) hay cac chất tham gia cấu trúc màng tế bào (phytosterol) Ngoài cac chức về sinh lí, trao đổi chất xây dựng cấu trúc, số hợp chất terpenoid đặc biệt, chủ yếu thuộc gia đình terpenoid có mạch cacbon C10, C15, C20 tham gia vào qua trình “giao tiếp” “phòng vệ” nhƣ: chất hấp dẫn côn trùng thụ phấn, hỗ trợ qua trình phat tan hạt giống, khang sinh, tạo chất độc đối với động vật ăn cỏ Ở vi khuẩn lam, terpenoid đƣợc tổng hợp đƣờng methylerythritolphosphate (MEP) Nghiên cứu Kaneko cộng cho thấy, cac gen mã hóa cho enzyme tham gia vào đƣờng sinh tổng hợp MEP đƣợc tìm thấy genome Synechocystis sp nhƣ genome nhiều loài vi khuẩn lam khac [30] Đƣợc phân lập từ vi khuẩn lam Tolypothrix nodosa, Tolypodiol diterpenoid đƣợc nhận diện NMR phân tích khối phổ Tolypodiol thể hoạt tính khang viêm mạnh tai chuột với ED50 30µg/tai [32] 1.3.3 Nhóm chất polyketide Là nhóm cac sản phẩm thứ cấp có đa dạng về cấu trúc chức đƣợc phân lập từ nguồn sinh vật khac nhau: vi khuẩn, nấm, thực vật, côn trùng Cac sản phẩm phân lập có đặc tính dƣợc lí quan trọng nhƣ: khang khuẩn, khang nấm, chống kí sinh trùng, chống khối u với phổ hoạt động rộng, có tac dụng nhiều đối tƣợng Ở vi khuẩn lam, polyketide đƣợc tổng hợp chuỗi cac phản ứng liên tục đƣợc xúc tac cac enzyme polyketide synthenase (PKS)- nhóm lớn cac đa enzyme chứa nhóm phối hợp với vị trí hoạt động Cac phản ứng diễn theo bƣớc cach hoạt hóa 2; 3; 4-cacbon khởi đầu nhƣ acetyl-CoA, propionyl, CoA, butyryl-CoA thành malonyl-, methylmalonyl- ethylmalonyl- CoA Cac gen PKS đƣợc phat vi khuẩn lam nhờ nghiên cứu đột biến gen transposon tế bào dị hình có khả cố định ni-tơ [11] Coibacin A-D polyketide đƣợc phân lập từ loài vi khuẩn lam Oscillatoria sp biển Panama Nghiên cứu chứng minh, Coibacin A-D có khả ức chế tăng sinh dòng tế bào ung thƣ H460 với gia trị IC50 từ 11,4-34,5µM Chúng có khả khang viêm dựa khảo nghiệm nitric oxide, đó, Coibacin B thể khả khang viêm mạnh nhất Ngoài ra, có mặt Coibacin A làm giảm cac cytokine nhƣ TNF-α IL-6 tế bào chuột RAW264.7 đƣợc kích thích lipopolysaccharide [2] 1.3.4 Nhóm chất peptide không phụ thuộc ribosome Là sản phẩm hệ thống sinh tổng hợp cac enzyme nonribosomal peptides synthetase Cac peptide không phụ thuộc ribosome bao gồm D- Lamino acid, protein axit amin, axit hydroxyl, ornithine, acid β-amin cac thành phần dị biệt khac Chúng có thể đƣợc sửa đổi glycosyl hóa, N-methyl hóa, acyl hóa Ngoài đa dạng về cấu trúc, cac peptide không phụ thuộc ribosome có phổ rộng cac hoạt động sinh học, số đó có nhiều hữu ích y học, nơng nghiệp nghiên cứu sinh học Cac peptide không phụ thuộc ribosome bao gồm cac khang sinh tiếng, chất ức chế miễn dịch, tac nhân khang u cac độc tố [25] Microcystin là chất chuyển hóa đầu tiên khẳng định có tồn tại đƣờng chuyển hóa không phụ thuộc ribosome Theo bao cao Chorus Bartram, Microcystin sản phẩm cac vi khuẩn lam Microcytis aeruginosa, Anabaena flos-aquae, Oscillatoria agardhii số loài thuộc chi Nostoc [19] Chúng đặc biệt ức chế protein phosphatase loại 2A sinh vật nhân thực Eukaryote Microcystis có thể gây tổn thƣơng gan nghiêm trọng vận chuyển tích cực chúng vào tế bào gan nguyên nhân gây ngộ độc cho ngƣời [28] 1.4 Phân tách hợp chất thiên nhiên từ vi khuẩn lam Sự phat triển kĩ thuật sắc kí giúp bƣớc tiến lớn cho qua trình phân tach cac hợp chất thiên nhiên có vi khuẩn lam Cac hợp chất thiên nhiên từ vi khuẩn lam đƣợc tồn tại hỗn hợp phức tạp gồm nhiều chất với cấu tạo khac Với cac hợp chất quan tâm khac nhau, ngƣời ta sẽ sử dụng cac phƣơng phap khac để thu đƣợc hiệu tối ƣu nhất Ví dụ lồi vi khuẩn lam Spirulina sp., cac chất có khả chống ô-xi hóa đƣợc phân tach cach sử dụng sắc kí cột có điều chỉnh tốc độ chảy ap suất dung môi phƣơng phap chƣng cất đƣợc sử dụng để thu lấy cac chất có khả khang virus Sự phân tach cac hợp chất phụ thuộc vào cac yếu tố nhƣ: tính tan dung mơi, độ ổn định chất, lƣợng chất có hỗn hợp [23] Cac hợp chất thiên nhiên có cấu trúc hóa học khac đƣợc phân tach từ chủng vi khuẩn lam Spirulina platensis phƣơng phap chiết lỏng cao ap (PLEPressurized Liquid Extraction) Cac yếu tố nhƣ: dung môi phân cực (methanol, ethanol, n- hexan, nƣớc), nhiệt độ tach chiết, thời gian phân bố mẫu bên tế bào tach chiết đƣợc tối ƣu Bằng cach kết hợp PLE với cac kĩ thuật sắc kí khac nhƣ: sắc kí mỏng TLC để kiểm tra độ phân tach cac băng chất, sắc kí lỏng hiệu cao kết hợp với đầu dò (HPLC-DAD) để xac định chất đƣợc phân tach băng, cac chất đƣợc phat có thể α- β-carotene, βcryptoxanthin,…Ngoài ra, TLC đƣợc dùng phối hợp với phƣơng phap điện di mao quản kết hợp khối phổ (EC/MS- Capillary electrophoresis - Mass spectrometry) để tăng hiệu tach chiết lƣợng chất giàu phycobiliprotein thời gian ngắn nhất [18] Hàm lƣợng carotenoid có mặt loài vi khuẩn lam S platensis đƣợc xac định phƣơng phap chiết siêu tới hạn (SFE- Supercritical fluid extraction) Đây phƣơng phap sử dụng dung môi CO nhiệt độ ap suất vƣợt qua giới hạn chất Kết cho thấy, hàm lƣợng carotenoid thu đƣợc từ loài vi khuẩn lam cao hẳn sử dụng cac phƣơng phap khac [18] Nhƣ vậy, cac phƣơng phap tach chiết truyền thống nhƣ: chiết lỏngrắn (SLE- Solid liquid extraction), chiết lỏng-lỏng (LLE- Liquid–liquid extraction) với nhƣợc điểm sử dụng lƣợng lớn dung môi tốn nhiều thời gian tach chiết nhƣng hiệu tach chiết không cao thì đời số phƣơng phap mới nhƣ: chiết lỏng cao ap, chiết chất lỏng siêu tới hạn,…để tăng hiệu tach chiết phân đoạn cac hợp chất thiên nhiên từ vi khuẩn lam Ngoài ra, ngƣời ta có thể dùng phối hợp cac phƣơng phap phân tích để đem lại hiệu nghiên cứu tốt nhất nhƣ: sắc kí lỏng hiệu cao kết hợp với khối phổ (LC/MS- Liquid chromatography- mass spectrometry), sắc kí khí kết hợp khối phổ GC/MS (Gas chromatography- mass spectrometry), sắc kí lỏng hiệu cao kết hợp hai lần khối phổ (LC/MS-MS- Liquid chromatography- mass spectrometry/mass spectrometry) nhằm dự đoan khối lƣợng cấu trúc phân tử hợp chất quan tâm Lịch sử nghiên cứu việc phân lập cac chất tinh khiết từ vi khuẩn lam có hƣớng thay đổi tiến theo thời gian, thay vì sử dụng phƣơng phap vật lí, hóa học để tìm nhiệt độ sôi, khac biệt so với cac chất biết xac định khối lƣợng phân tử cần lƣợng mẫu lớn, thời gian xử lí mẫu lâu, phức tạp thì cac phƣơng phap đại đƣợc sử dụng nhƣ khối phổ, công hƣởng từ hạt nhân giúp xac định chất quan tâm nhanh chóng, dễ dàng với lƣợng mẫu nhỏ giúp qua trình phân tach chất đạt hiệu tối đa Luận văn cao học 2016 Bùi Thị Thùy Dung TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT Phan Quốc Kinh, (2011), "Giao trình cac hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học" Nhà xuất giáo dục Việt Nam TIẾNG ANH Balunas M.J., Grosso M.F., Villa F.A., Engene N., Mcphail K.L., Tidgewell K., Pineda M.L., Gerwick L., Spadafora C., Kyle D.E., and Gerwick W.H., (2012), "Coibacins A-D, antileishmanial marine cyanobacterial polyketides with intriguing biosynthetic origins", Organic letters, 14(15), pp 3878-81 Burja A.M., B Banaigs, E Abou-Mansour, J Grant Burgess, and P.C Wright, (2001), "Marine cyanobacteria - a prolific source of natural products", Tetrahedron, 57(46), pp 9347-9377 Chen J and Forsyth C.J., (2004), "Total synthesis of the marine cyanobacterial cyclodepsipeptide apratoxin A", Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 101(33), pp 12067-72 Chin Y.-W., Balunas M J., Chai H B., and Kinghorn A.D., (2006), "Drug discovery from natural sources", The AAPS journal, 8(2), pp E239- E253 Chun G., Lee Y.B., Kim D.J., Cho W.J, Lee S.K., Chung H.J., and Ahn C.H., (2014), "Characterization of a novel small molecule inhibitor with potent anticancer activity", Cancer research, 70(8), pp 3562 Costa M., Costa-Rodrigues J.,Fernandes M.H., Barros P., Vasconcelos V., and Martins R., (2012), "Marine cyanobacteria compounds with anticancer properties: a review on the implication of apoptosis", Mar Drugs, 10(10): pp 2181-207 26 Luận văn cao học Bùi Thị Thùy and Ascaso C., (2007), 2016 De Los Rios A., Grube M., Sancho L.G., Dung "Ultrastructural and genetic characteristics of endolithic cyanobacterial 27 biofilms colonizing Antarctic granite rocks", FEMS microbiology ecology, 59(2), pp 386-95 Devi T.I., Koijam L.,Singh O.A.,Tiwari O.N and Sharma G.D., (2010), "Assessment of cyanobacterial biodiversity through molecular approaches and possible exploitation for value addition", Assam University Journal of Science & Technology : Biological and Environmental Sciences, (1), pp 93-101 10 Dittmann E and Wiegand C., (2006), "Cyanobacterial toxins-occurrence, biosynthesis and impact on human affairs", Molecular nutrition & food research, 50(1), pp 7-17 11 Dittmann E., Neilan B.A., and Borner T., (2001), "Molecular biology of peptide and polyketide biosynthesis in cyanobacteria", Applied Microbiol Biotechnol, 57(4), pp 467-73 12 Elliott A and Pace D.M., (1963), "Observations on the effects of Methanol and formaldehyde on estabilished cell lines cultivated in vitro”, Canadian Journal of Biochemistry and Physiology, 41(2), pp 299-304 13 Fang W., Liu S., and Nie Y., (2011), "Anticancer activity of chamaejasmine: effect on tubulin protein", Molecules, 16(8), pp 624354 14 Ferlay J.,Soerjomataram I., Dikshit R., Eser S., Mathers C., Rebelo M, Parkin D., Forman D., and Bray F., (2015), "Cancer incidence and mortality worldwide: sources, methods and major patterns in GLOBOCAN 2012", International journal of cancer, 136(5), pp E35986 15 Gerwick W.H., Proteau P.J., Nagle D.G., Hamel E., Blokhin A., and Slate D.L., (1994), "Structure of Curacin A, a Novel Antimitotic, Antiproliferative and Brine Shrimp Toxic Natural Product from the Marine Cyanobacterium Lyngbya majuscula", The Journal of Organic Chemistry, 59(6), pp 1243-1245 16 Gerwick, W.H., Byrum T., Carland T., (2008),“Integratingchemical and biochemical approaches to natural products drug discovery from marine cyanobacteria”, International Conference on Newer Developments in Drug Discovery from Natural Products and Traditional Medicines, pp 33-43 17 Hemscheidt T., Puglisi M.P., Larsen L.K., Patterson G.M., Moore R., Rios J., and Clardy J., (1994), "Structure and biosynthesis of borophycin, a new boeseken complex of boric acid from a marine strain of the bluegreen alga Nostoc linckia", The Journal of Organic Chemistry, 59(12), pp 3467-3471 18 Ibañez E., Herrero M., Mendiola J.A., and Castro-Puyana M (2012), “Extraction and Characterization of Bioactive Compounds with Health Benefits from Marine Resources: Macro and Micro Algae, Cyanobacteria, and Invertebrates”, Marine Bioactive Compounds: Characterization and Applications, pp 55-98 19 Ingrid Chorus, Jamie Bartram, (1999), Toxic Cyanobacteria in Water: A Guide to their Public Health Consequences, Monitoring and Management, Chemical Rubber Company Press 20 James J Pitt (2009), “Principles and Applications of Liquid Chromatography- Mass Spectrometry in Clinical Biochemistry”, Clin Biochem Reviews, 30(1), pp.19–34 21 Kenneth G Macleod and Simon P Langdon, (2011), “Essential Techniques of Cancer Cell Culture”, Cancer cell culture- Methods and Protocol, 88, pp.17-23 22 Kossel A., (1981), "The chemical composition of the cell", Archiv für Physiologie, 61(10), pp 181-186 23 Kwei C.K.,(2012), Elucidation and isolation of specific bioactive compound in cyanobacteria isolates, Thesis (Ph.D): Chemical Engineering, University of Adelaide 24 Mandal S and Rath J., (2015), “Secondary Metabolites of Cyanobacteria and Drug Development”, Extremophilic Cyanobacteria For Novel Drug Development, pp 23-43 25 Martínez-Núđez M.A, (2016), "Nonribosomal peptides synthetases and their applications in industry", Sustainable Chemical Processes, 4(1), pp 13 26 Matthew S., Schupp P., and Luesch H., (2008), "Apratoxin E, a cytotoxic peptolide from a guamanian collection of the marine cyanobacterium Lyngbya bouillonii", Journal of natural products, 71(6), pp 1113-6 27 Moore R.E., Corbett, T H., Patterson, G M L., and Valeriote, F A , (1996), “The Search for New Antitumor Drugs from Blue-Green Algae”, Current Pharmaceutical Design, 2(3),pp 317-330 28 Neilan B.A., Dittmann E., Rouhiainen L., Bass L.A., Schaub V., Sivonen K., and Börner T., (1999), "Nonribosomal Peptide Synthesis and Toxigenicity of Cyanobacteria", Journal of Bacteriology, 181(13), pp 4089-4097 29 Newman D.J and G.M Cragg, (2007), "Natural Products as Sources of New Drugs over the Last 25 Years", Journal of natural products, 70(3), pp 461-477 30 Pattanaik B and P Lindberg, (2015), "Terpenoids and their biosynthesis in cyanobacteria", Life (Basel, Switzerland), 5(1), p 269-93 31 Patterson G.M.L, (1991), "Atineoplastic activity of cultured blue-green algae (Cyanpphyta)" Journal of Phycology, 27(4), pp 530-536 32 Prinsep M.R., Thomson R.A., West M.L., and Wylie B.L., (1996), "Tolypodiol, an antiinflammatory diterpenoid from the cyanobacterium Tolypothrix nodosa", Journal of natural products, 59(8), pp 786-8 33 Sherma J., (2006), Thin-Layer Chromatography, in Encyclopedia of Analytical Chemistry, John Wiley & Sons, Ltd 34 Shimizu Y., (1996), "Microalgal metabolites: a new perspective", Annual review of microbiology, 50, pp 431-65 35 Simmons T.L., Andrianasolo E., Mcphail K., Flatt P., and Gerwick W.H, (2005), "Marine natural products as anticancer drugs", Molecular cancer therapeutics, 4(2), pp 333-42 36 Smith C.D., Zhang X., Mooberry S.L., Patterson G.M., and Moore R.E., (1994), "Cryptophycin: a new antimicrotubule agent active against drugresistant cells", Cancer research, 54(14), pp 3779-84 37 Subramaniyan Vijayakumar M.M., (2015), "Pharmaceutical applications of cyanobacteriad-A review", 5(1), Journal of Acute Medicine, pp.1-9 38 Vasas G., G Borbely, P Nanasi, and P.P Nanasi, (2010), "Alkaloids from cyanobacteria with diverse powerful bioactivities", Medicinal Chemistry, 10(10), pp 946-55 39 Voigt W., (2005), "Sulforhodamine B assay and chemosensitivity", Molecular Medicine, 110, pp 39-48 40 Wipf P., Reeves J.T and Day B.W., (2004), "Chemistry and biology of curacin A", Current pharmaceutical design, 10(12), pp 1417-37 41 Zakhia F., Jungblut A.J., Taton A.,Vincent W.F., and Wilmotte A., (2008), “Cyanobacteria in Cold Ecosystems”, Psychrophiles: from Biodiversity to Biotechnology, pp 121-135 ... ức chế tăng trưởng dịch chiết từ chủng vi khuẩn lam lên dòng tế bào ung thư phổ biến Vi? ??t Nam 11 Luận văn cao học Bùi Thị Thùy Tìm hợp chất có khả kháng ung thư từDung dịch chiết vi khuẩn lam. .. Thị Thùy Dung PHÂN LẬP CÁC CHẤT TỪ DỊCH CHIẾT VI KHUẨN LAM CÓ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ TĂNG TRƢỞNG MỘT SỐ DÒNG TẾ BÀO UNG THƢ Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC... sinh tế bào ung thƣ 22 3.1.1 Kết hoạt hóa tế bào 22 3.1.2 Xac định số IC50 cac dịch chiết từ vi khuẩn lam 22 3.2 Phân lập cac chất có hoạt tính ức chế tăng sinh tế bào từ vi khuẩn