TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
LỜI CẢM ƠN
Võ Thị Phƣơng
DANH MỤC HÌNH
DANH MỤC BẢNG
DANH MỤC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
MỞ ĐẦU
CHƢƠNG 1- TỔNG QUAN TÀI LIỆU
Hình 1.3. Ty thể và quá trình trao đổi năng lƣợng trong tế bào [62]
1.2. Hệ gen ty thể và cơ chế di truyền của các gen ty thể
Hình 1.4. Hệ gen ty thể ngƣời
Bảng 1.1. Các gen trong hệ gen ty thể [8]
Hình 1.5. Thuyết nút cổ chai di truyền [63]
1.3. Đột biến gen ty thể và các bệnh liên quan
Hình 1.6. Sơ đồ các đột biến gen ty thể liên quan đến một số bệnh phổ biến [51]
1.4. Gen MT-TK và các đột biến A8344G, T8356C, G8363A
1.5. Gen ND6 và đột biến T14484C
1.5.1. Gen ND6
1.5.2. Đột biến T14484C
1.6. Một số phƣơng pháp tạo đột biến điểm định hƣớng
1.6.1. Phương pháp Kunkel
1.6.2. Tạo đột biến điểm định hướng bằng phương pháp thiết kế vector tái tổ hợp
1.6.3. Tạo đột biến điểm định hướng bằng phương pháp PCR
Hình 1.7. Tạo đột biến điểm (thay thế) định hƣớng sử dụng PCR truyền thống
Hình 1.8. Tạo đột biến điểm định hƣớng sử dụng PCR primer extention
Hình 1.9. Tạo đột biến điểm định hƣớng sử dụng PCR đảo
1.7.1. Phát hiện đột biến điểm ADN ty thể bằng PCR- RFLP
1.7.2. Phát hiện đột biến điểm ty thể bằng xác định trình tự gen
1.7.3. Phát hiện đột biến điểm ty thể bằng phương pháp SSCP (single-stranded conformational polymorphism)
1.8. Tình hình nghiên cứu đột biến ADN ty thể ở Việt Nam
1.9. Mục tiêu và nội dung nghiên cứu của đề tài
CHƢƠNG 2 – VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Tách chiết ADN tổng số
2.2.1.1. Quy trình tách chiết
2.2.1.2. Kiểm tra và định lượng ADN tách chiết
2.2.2. Nhân bản các đoạn gen từ nucleotide 14455-14578, 8155-8366, 8166-8385, 8342-8582 bằng kĩ thuật PCR (polymerase chain reaction)
Bảng 2.1. Trình tự các cặp mồi đặc hiệu cho PCR nhân bản các đoạn ADN trên gen ND6 và MT-TK
Bảng 2.2. Thành phần phản ứng PCR nhân bản các đoạn gen 14455- 14578, 8155-8366, 8166-8385, 8342-8582
Bảng 2.4.Dự đoán sản phẩm phản ứng cắt các đoạn ADN với enzyme giới hạn.
Bảng 2.5. Thành phần của phản ứng cắt enzyme giới hạn
2.2.4. Nhân dòng sản phẩm PCR từ khuôn là ADN bình thường (không chứa các đột biến quan tâm)
2.2.4.1. Chuẩn bị tế bào khả biến E.coli DH5α
2.2.4.2. Phản ứng gắn các đoạn ADN đã được nhân bản bằng PCR vào vector PTZ57R/T
Hình 2.2. Bản đồ vector PTZ57R/T và vị trí đa điểm cắt Bảng 2.6. Thành phần phản ứng ligase
Bảng 2.7. Trình tự mồi M13
Bảng 2.10. Kích thƣớc sản phẩm PCR trực tiếp từ khuẩn lạc với mồi đoạn chèn và mồi vector M13 của các loại đột biến
2.2.4.5. Tách chiết plasmid
2.2.4.6. Giải trình tự các plasmid nhân dòng
2.2.5. Thiết kế đối chứng dương cho các phản ứng sàng lọc
Hình 2.3. Quy trình tạo đột biến điểm định hƣớng
Hình 2.4. PCR plasmid đích với cặp mồi đột biến và nối 2 đầu sản phẩm PCR
Bảng 2.12. Thành phần phản ứng PCR plasmid nhân dòng với mồi chứa
Bảng 2.14. Thành phần phản ứng đóng vòng sản phẩm PCR
2.2.5.4. Biến nạp plasmid đã được đóng vòng vào tế bào khả biến E. coli DH5α và tách chiết plasmid từ khuẩn lạc mang đoạn gen đột biến
2.2.6. Sàng lọc kiểm tra sự có mặt của các đột biến T14484C, A8344G, T8356C, G8363A ở 128 mẫu bệnh phẩm.
2.2.7. Điện di trên gel agarose
2.2.8. Điện di trên gel polyacrylamide
Bảng 2.15. Thành phần trong bản gel polyacrylamide
CHƢƠNG 3 – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Hình 3.1. Điện di sản phẩm ADN tổng số từ mẫu máu của các bệnh nhân
3.2. Kết quả nhân bản bằng PCR các đoạn gen từ nucleotide 14455-14578, 8155-8366, 8166-8385, 8342-8582.
Hình 3.2. Kết quả điện di sản phẩm PCR đoạn gen 14455-14578 (A) (ND6), 8155-8366 (B), 8166-8385 (C), 8342-8582 (D) (MT-TK)
3.3. Nhân dòng các đoạn gen 14455-14578, 8155-8366, 8166-8385, 8342-8582
(A) (B)
(C) (D)
(E) (F)
Hình 3.5. Kết quả tách chiết plasmid nhân dòng
M: marker 1kb; 1: plasmid chưa mang đoạn chèn; 2,3: plasmid tái tổ hợp chứa đoạn gen 14455-14578 (A), 8155-8366 (B), 8166-8385 (C), 8342-8582 (D)
3.3.3. Giải trình tự các đoạn gen 14455-14578, 8155-8366, 8166-8385, 8342-8582
3.3.3.1. Trình tự đoạn gen 14455-14578
3.3.3.2. Trình tự đoạn gen 8155-8366
Hình 3.7. So sánh trình tự đoạn gen 8155-8366 với trình tự gen tham chiếu
Hình 3.8. So sánh trình tự đoạn gen 8166-8385 với trình tự gen tham chiếu
3.4. Tạo đột biến điểm nhân tạo A8344G, T8356C, G8363A, T14484C
3.4.1. PCR plasmid chứa đoạn gen 14455-14578, 8155-8366, 8166-8385, 8342-
8582 với 4 cặp mồi chứa điểm đột biến tương ứng
Hình 3.10. Kết quả điện di sản phẩm PCR plasmid đích với cặp mồi tạo đột biến
(A)
(C) (D)
Hình 3.12. Kết quả điện di cắt enzyme giới hạn sản phẩm PCR trực tiếp kiểm tra khuẩn lạc với mồi LHTC (A), MRAG (B), MRTC (C), MRGA (D).
Hình 3.13. Kết quả tách plasmid mang đoạn gen 14455-14578 (hình A), 8166- 8385 (hình B), 8155-8366 (hình C), 8342-8582 (hình D) chứa các vị trí đột biến T14484C, A8344G, T8356C, G8363A
(A) (B)
Hình 3.15. Kết quả so sánh trình tự plasmid chứa đoạn gen 14455-14578 sau khi tạo đột biến với trình tự plamid trƣớc khi tạo đột biến và trình tự gen tham chiếu NC_012920.1
Hình 3.17. Kết quả so sánh trình tự plasmid chứa đoạn gen 8155-8366 sau khi tạo đột biến với trình tự plamid trƣớc khi tạo đột biến và trình tự gen tham chiếu NC_012920.1
Hình 3.18. Một phần trình tự tạo đột biến A8344G
Hình 3.19. Kết quả so sánh trình tự plasmid chứa đoạn gen 8166-8385 sau khi tạo đột biến với trình tự plamid trƣớc khi tạo đột biến và trình tự gen tham chiếu NC_012920.1
Hình 3.20. Một phần trình tự tạo đột biến T8356C
Hình 3.21. Kết quả so sánh trình tự plasmid chứa đoạn gen 8342-8582 sau khi tạo đột biến với trình tự plamid trƣớc khi tạo đột biến và trình tự gen tham chiếu NC_012920.1
3.5. Khẳng định sự có mặt của các đột biến A8344G, T8356C, G8353A, T14484C bằng PCR-RFLP
Hình 3.23. Điện di sản phẩm PCR-RFLP đoạn gen 14455-14578 của các mẫu bệnh phẩm
Hình 3.24. Kết quả điện di sản phẩm PCR-RFLP từ đoạn gen 8155-8366 của các mẫu bệnh phẩm
Hình 3.25. Kết quả điện di sản phẩm PCR-RFLP từ đoạn gen 8166-8385 của các mẫu bệnh phẩm
3.5.4. Sàng lọc đột biến G8363A
Hình 3.26. Kết quả điện di sản phẩm PCR-RFLP đoạn gen 8342-8582 từ các mẫu bệnh phẩm
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
Kiến nghị
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Trang web:
PHỤ LỤC