Luận văn ảnh hưởng của nồng độ cơ chất lên quá trình lên men cellulose của vi khuẩn acetobacter xylinum

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NGUYỄN TẤT THÀNH KHOA KỸ THUẬT THỰC PHẨM VÀ MÔI TRƯỜNG LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP Tên đề tài: ẢNH HƯỞNG CỦA NỒNG ĐỘ CƠ CHẤT LÊN ĐỘNG HỌC LÊN MEN CELLULOSE CỦA VI KHUẨN ACETOBACTER XYLINUM Sinh viên thực : Hoàng Thị Lệ Hoa Chuyên ngành Tp.HCM, tháng 12 năm 2019 : Công nghệ thực phẩm TRƯỜNG ĐẠI HỌC NGUYỄN TẤT THÀNH KHOA KỸ THUẬT THỰC PHẨM VÀ MÔI TRƯỜNG ab LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP Tên đề tài: ẢNH HƯỞNG CỦA NỒNG ĐỘ CƠ CHẤT LÊN ĐỘNG HỌC LÊN MEN CELLULOSE CỦA VI KHUẨN ACETOBACTER XYLINUM Sinh viên thực : Hoàng Thị Lệ Hoa Mã số sinh viên : 1511539376 Lớp : 15DTP1A Chuyên ngành : Công nghệ thực phẩm Giáo viên hướng dẫn: ThS Nguyễn Quốc Duy Tp.HCM, tháng 12 năm 2019 TRƯỜNG ĐH NGUYỄN TẤT THÀNH KHOA KỸ THUẬT THỰC PHẨM & MÔI TRƯỜNG CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự - Hạnh phúc Tp Hồ Chí Minh, ngày 25 tháng 11 năm 2019 NHIỆM VỤ LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP Họ tên sinh viên: Hoàng Thị Lệ Hoa Mã số sinh viên: 1511539376 Chuyên ngành: Công nghệ thực phẩm Lớp: 15DTP1A Tên đề tài: ẢNH HƯỞNG CỦA NỒNG ĐỘ CƠ CHẤT LÊN ĐỘNG HỌC LÊN MEN CELLULOSE CỦA VI KHUẨN ACETOBACTER XYLINUM Nhiệm vụ luận văn ˗ Khảo sát ảnh hưởng nồng độ chất lên thay đổi pH độ acid tổng dịch lên men sinh tổng hợp cellulose vi khuẩn Acetobacter xylinum ˗ Khảo sát ảnh hưởng nồng độ chất lên thay đổi số lượng vi khuẩn dịch lên men sinh tổng hợp cellulose vi khuẩn Acetobacter xylinum ˗ Khảo sát ảnh hưởng nồng độ chất lên thay đổi hàm lượng glucose cellulose dịch lên men sinh tổng hợp cellulose vi khuẩn Acetobacter xylinum Ngày giao nhiệm vụ luận văn: 15/6/2019 Ngày hoàn thành nhiệm vụ luận văn: 15/11/2019 Người hướng dẫn: Họ tên Học hàm, học vị Đơn vị Phần hướng dẫn Nguyễn Quốc Duy Thạc sĩ BM CNTP 100% Nội dung yêu cầu luận văn thông qua môn Trưởng Bộ môn Người hướng dẫn (Ký ghi rõ họ tên) (Ký ghi rõ họ tên) ThS Nguyễn Thị Vân Linh ThS Nguyễn Quốc Duy LỜI CẢM ƠN Để có thành công ngày hôm nay, em nhận nhiều giúp đỡ, hỗ trợ thầy cơ, gia đình bạn bè Trước hết, em xin cảm ơn giáo viên hướng dẫn em, thầy Nguyễn Quốc Duy hướng dẫn lời khuyên có giá trị Em cảm thấy có động lực suốt ba tháng làm thí nghiệm Thầy truyền cảm hứng cho em nhiều để hoàn thành dự án Em xin chân thành cảm ơn thầy cô Khoa Kỹ thuật Thực phẩm Môi trường cung cấp cho em thông tin, hướng tảng kiến thức cần thiết cho em đạt mục đích học tập Em muốn cảm ơn anh chị phịng thí nghiệm giúp đỡ em khoảng thời gian qua Nếu hiểu biết anh chị thiết bị việc hồn thành dự án em khó khăn Cuối cùng, em dành cảm ơn đến gia đình, bạn bè cho tình yêu thương giúp đỡ Em xin kính chúc Quý thầy cô Khoa Kỹ thuật Thực phẩm Môi trường thầy Nguyễn Quốc Duy dồi sức khỏe, niềm tin để tiếp tục sứ mệnh trồng người cao đẹp truyền đạt kiến thức cho hệ mai sau iv LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan kết đề tài “Ảnh hưởng nồng độ chất lên trình lên men cellulose vi khuẩn Acetobacter xylinum” cơng trình nghiên cứu cá nhân thực hướng dẫn ThS Nguyễn Quốc Duy Các số liệu kết trình bày luận văn hồn tồn trung thực, không chép ai, chưa cơng bố cơng trình khoa học nhóm nghiên cứu khác thời điểm Nếu không nêu trên, tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm đề tài chấp nhận hình thức xử lý theo quy định Tp.HCM, ngày 25 tháng 11 năm 2019 Tác giả luận văn (Ký ghi rõ họ tên) Hồng Thị Lệ Hoa v TĨM TẮT LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP Trong nghiên cứu này, ảnh hưởng nồng độ chất lên trình lên men cellulose vi khuẩn Acetobacter xylinum khảo sát Nồng độ chất thay đổi giá trị 50, 100, 200 g/L Q trình lên men celulose mơ tả dựa thay đổi pH, độ acid tổng, hàm lượng glucose, số lượng vi sinh vật canh trường lên men hiệu suất sinh tổng hợp cellulose Với lượng đường ban đầu 100 g/L theo thời gian, hàm lượng acid tăng vi khuẩn A xylinum sử dụng đường tham gia vào q trình chuyển hóa ethanol thành acid acetic khiến pH giảm acid tăng, pH không thay đổi đáng kể ngày đầu từ (4.203–4.093); sau giảm đáng kể đến ngày 10 (3.346) khơng thay đổi ngày cuối q trình lên men Hàm lượng đường giảm mạnh từ ngày 0–5 từ (95.189–43.643 g/L) vi sinh vật pha phát triển bắt đầu sử dụng đường Với lượng đường ban đầu 200 g/L hàm lượng đường giảm dần từ ngày 0–8 từ (206.784–118.993 g/L) vi sinh vật pha tăng trưởng nên nguồn cung cấp carbon ban đầu giảm, vi khuẩn bắt đầu sử dụng acid gluconic trình trao đổi chất thời gian độ kết tinh màng BC tăng dần Khi hàm lượng đường giảm dẫn đến tổng hàm lượng vi sinh vật tăng thời gian lên men tăng tổng hàm lượng vi sinh vật tăng Theo khảo sát cho thấy hàm lượng glucose màng BC tỷ lệ nghịch với nhau, glucose nguyên liệu để tổng hợp màng BC vi MỤC LỤC NHIỆM VỤ LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP iii LỜI CẢM ƠN iv LỜI CAM ĐOAN v TÓM TẮT LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP vi MỤC LỤC vii DANH MỤC HÌNH ix DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT xi Chương MỞ ĐẦU 1.1 TÍNH CẤP THIẾT VÀ LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI 1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 1.2.1 Mục tiêu tổng quát 1.2.2 Mục tiêu cụ thể 1.3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU Chương TỔNG QUAN 2.1 VI KHUẨN ACETOBACTER XYLINUM 2.1.1 Đặc điểm hình thái 2.1.2 Đặc điểm sinh lý 2.2 QUÁ TRÌNH LÊN MEN CELLULOSE 2.2.1 Thành phần môi trường lên men 2.2.2 Phương pháp lên men 2.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng 2.3 CELLULOSE VI KHUẨN Chương NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 DỤNG CỤ – THIẾT BỊ – HÓA CHẤT 3.1.1 Dụng cụ - thiết bị 3.1.2 Hóa chất vii 3.2 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 3.2.1 Thời gian nghiên cứu 3.2.2 Địa điểm nghiên cứu 3.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.3.1 Quá trình nhân giống vi sinh vật 3.3.2 Quá trình lên men sinh tổng hợp cellulose 3.3.3 Bố trí thí nghiệm 3.4 PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 3.4.1 Xác định hàm lượng cellulose sinh tổng hợp 3.4.2 Xác định hàm lượng vi sinh vật 3.4.3 Xác định hàm lượng đường khử 3.4.4 Xác định độ acid tổng 10 3.5 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU 10 Chương KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 11 4.1 SỰ THAY ĐỔI pH VÀ ĐỘ ACID TỔNG 11 4.2 SỰ THAY ĐỔI SỐ LƯỢNG VI SINH VẬT 13 4.3 SỰ THAY ĐỔI HÀM LƯỢNG GLUCOSE VÀ CELLULOSE 15 Chương KẾT LUẬN VÀ KHUYẾN NGHỊ 19 5.1 KẾT LUẬN 19 5.2 KHUYẾN NGHỊ 19 TÀI LIỆU THAM KHẢO 20 viii DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Tế bào vi khuẩn A xylinum quan sát kính hiển vi Hình 3.1 Máy quang phổ UV-1800 (Shimadzu Schweiz GmbH) Hình 3.2 Máy ly tâm 80-2 (Wincom Company Ltd.) Hình 3.3 Cân phân tích PA (OHAUS Instruments Co.,Ltd.) Hình 3.4 Tủ sấy UN55 (Memmert GmbH + Co.KG) Hình 4.1 Sự thay đổi pH độ acid tổng (g acid acetic/L) dịch lên men sinh tổng hợp cellulose vi khuẩn A xylinum môi trường HS với hàm lượng glucose ban đầu 50 g/L 11 Hình 4.2 Sự thay đổi pH độ acid tổng (g acid acetic/L) dịch lên men sinh tổng hợp cellulose vi khuẩn A xylinum môi trường HS với hàm lượng glucose ban đầu 100 g/L 12 Hình 4.3 Sự thay đổi pH độ acid tổng (g acid acetic/L) dịch lên men sinh tổng hợp cellulose vi khuẩn A xylinum môi trường HS với hàm lượng glucose ban đầu 200 g/L 13 Hình 4.4 Sự thay đổi số lượng vi sinh vật (mật độ quang bước sóng 600 nm) dịch lên men sinh tổng hợp cellulose vi khuẩn A xylinum môi trường HS với hàm lượng glucose ban đầu 50 g/L 14 Hình 4.5 Sự thay đổi số lượng vi sinh vật (mật độ quang bước sóng 600 nm) dịch lên men sinh tổng hợp cellulose vi khuẩn A xylinum môi trường HS với hàm lượng glucose ban đầu 100 g/L 14 Hình 4.6 Sự thay đổi số lượng vi sinh vật (mật độ quang bước sóng 600 nm) dịch lên men sinh tổng hợp cellulose vi khuẩn A xylinum môi trường HS với hàm lượng glucose ban đầu 200 g/L 15 Hình 4.7 Sự thay đổi hàm lượng glucose (g/L) dịch lên men sinh tổng hợp cellulose vi khuẩn A xylinum môi trường HS với hàm lượng glucose ban đầu 50 g/L 16 Hình 4.8 Sự thay đổi hàm lượng glucose (g/L) cellulose (g DW/L) dịch lên men sinh tổng hợp cellulose vi khuẩn A xylinum môi trường HS với hàm lượng glucose ban đầu 100 g/L 16 ix Hình 4.9 Sự thay đổi hàm lượng glucose (g/L) cellulose (g DW/L) dịch lên men sinh tổng hợp cellulose vi khuẩn A xylinum môi trường HS với hàm lượng glucose ban đầu 200 g/L 17 x tiến hành lên men tĩnh nhiệt độ 30C 15 ngày Sau ngày lên men, màng cellulose (nếu hình thành) tách trực tiếp khỏi mơi trường xử lý trước xác định khối lượng Phần dịch lên men lại sử dụng để phân tích tiêu khác bao gồm: pH, độ acid tổng, hàm lượng đường khử, hàm lượng vi khuẩn 3.3.2 Quá trình lên men sinh tổng hợp cellulose Quá trình lên men sinh tổng hợp cellulose vi khuẩn A xylinum thực môi trường HS mô tả phần với nồng độ chất ban đầu 50, 100 200 g/L với tỷ lệ giống cấy 10% Quá trình lên men tĩnh thực 15 ngày nhiệt độ 30C Sau trình lên men kết thúc, dịch lên men lớp màng cellulose tạo thành phân tích xác định tiêu hóa lý 3.3.3 Bố trí thí nghiệm HS, Giống o 10%, 30 C, ngày Cấy 10% HS (Glucose50g/L) HS (Glucose100g/L) HS (Glucose200g/L) Lên men tĩnh o 30 C, 15 ngày Màng cellulose Dịch lên men Xử lý pH Xác định khối lượng Vi sinh vật Đường khử Acid tổng 3.4 PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 3.4.1 Xác định hàm lượng cellulose sinh tổng hợp Đầu tiên, màng cellulose ngâm dung dịch NaOH 2% 30 phút nhiệt độ 80C để loại bỏ tạp chất tế bào bám màng Sau đó, màng tiếp tục ngâm dung dịch acid acetic 2% 30 phút nhiệt độ 80C để trung hòa lượng base rửa nước cất để đưa pH trung tính Màng cellulose sau rửa sấy tới khối lượng không đổi 105C để xác định khối lượng khô Hàm lượng cellulose sinh tổng hợp biểu diễn theo đơn vị g chất khô cellulose L dịch lên men [29] 3.4.2 Xác định hàm lượng vi sinh vật Canh trường (2 mL) định mức lên 10 mL sử dụng dung dịch đệm acetate 0.1 M (pH 5.0) có chứa cellulase 1% (v/v) tiến hành trình thủy phân 50C Sau trình thủy phân, hỗn hợp lọc qua giấy lọc Whatman No.2 hàm lượng vi sinh vật xác định cách đo độ hấp thu bước sóng 600 nm [30] 3.4.3 Xác định hàm lượng đường khử Hàm lượng đường khử xác định phương pháp dinitro salicylic acid (DNS) [31] Phương pháp dựa phản ứng tạo phức có màu vàng đường khử thuốc thử DNS có bước sóng hấp thu cực đại 540 nm 2mL dịch lên men sau pha loãng bổ sung mL thuốc thử DNS đun sôi 10 phút Sau làm nguội nhiệt độ phòng, mẫu đo độ hấp thu bước sóng 540 nm Hàm lượng đường khử tính tốn dựa vào đường chuẩn glucose biểu diễn đơn vị g/L 3.4.4 Xác định độ acid tổng Độ acid tổng dịch lên men xác định phương pháp chuẩn độ acidbase sử dụng dung dịch NaOH 0.05 N làm dung dịch chuẩn độ với thị màu phenolphthalein Độ acid tổng biểu diễn theo đơn vị gam acid acetic L dịch lên men 3.5 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU Dữ liệu thực nghiệm phân tích phần mềm SPSS 15 (SPSS Inc Chicago, U.S.A) sử dụng kỹ thuật thống kê Phân tích phương sai nhân tố (oneway ANOVA) áp dụng để xác định khác chế độ xử lý mẫu Tukey’s Multiple Range test áp dụng để xác định khác biệt có ý nghĩa giá trị trung bình mức ý nghĩa 5% Tất thí nghiệm tiêu phân tích lặp lại lần 10 Chương KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 4.1 SỰ THAY ĐỔI pH VÀ ĐỘ ACID TỔNG Trong nghiên cứu này, ảnh hưởng nồng độ chất lên trình lên men cellulose vi khuẩn A xylinum khảo sát Nồng độ chất thay đổi giá trị 50, 100, 200 g/L Quá trình lên men cellulose mô tả dựa thay đổi pH, độ acid tổng, hàm lượng glucose, số lượng vi sinh vật canh trường lên men 4.5 3.5 pH 2.5 1.5 0.5 TA (g acetic acid/L) hiệu suất sinh tổng hợp BC 0 10 11 12 13 Day pH TA Hình 4.1 Sự thay đổi pH độ acid tổng (g acid acetic/L) dịch lên men sinh tổng hợp cellulose vi khuẩn A xylinum môi trường HS với hàm lượng glucose ban đầu 50 g/L Sự thay đổi pH độ acid tổng dịch lên men môi trường HS biểu thị qua Hình 4.1 Kết cho thấy thay đổi pH dịch lên men mơi trường HS có chiều hướng giảm giảm mạnh từ ngày đến ngày Do pH giảm nên lượng acid tổng môi trường tăng Sự thay đổi pH hàm lượng acid tổng dịch lên men cellulose với nồng độ chất 100 g/L thể qua Hình 4.2 Kết cho thấy pH giảm hàm lượng acid tổng canh trường lên men tăng [32] Theo thời gian, hàm lượng acid tăng vi khuẩn A xylinum sử dụng đường tham gia vào q trình chuyển hóa ethanol thành acid acetic khiến pH giảm acid tăng [33] pH không thay đổi đáng 11 kể ngày đầu, sau giảm đáng kể đến ngày 10 khơng thay đổi ngày cuối q trình lên men 14 4.5 12 10 3.5 pH 2.5 1.5 TA (g acetic acid/L) 0.5 0 10 11 12 13 14 15 Day pH TA Hình 4.2 Sự thay đổi pH độ acid tổng (g acid acetic/L) dịch lên men sinh tổng hợp cellulose vi khuẩn A xylinum môi trường HS với hàm lượng glucose ban đầu 100 g/L Kết nghiên cứu tìm thấy báo cáo Kamide et al (1990) ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy vi khuẩn A xylinum sinh tổng hợp cellulose Báo cáo cho thấy pH không thay đổi 64 lên men giảm tương đối nhanh thời gian 1giờ Sau đó, pH giảm chậm gần không đổi 120 sau cho thấy giảm nhanh chóng khơng thay đổi 150 lên men [34] Vi khuẩn A xylinum ưa thích mơi trường acid nhẹ để tổng hợp cellulose [35] Do đó, việc tăng giá trị pH môi trường lên men làm giảm đáng kể trình tổng hợp cellulose sinh trưởng vi khuẩn điều kiện việc ức chế enzyme tham gia vào trình hình thành cellulose [28] Với mơi trường có nồng độ chất 200 g/L, thời gian lên men tăng lên, có gia tăng tổng lượng acid qua ngày, tổng lượng acid tăng dần 14 đầu lên men tăng mạnh ngày 15 Điều A xylinum chuyển hóa carbohydrate thành acid acetic cách tổng hợp sợi cellulose Quá trình chuyển hóa hơ hấp tế bào, bao gồm q trình oxy hóa ethanol thành acid acetic chuyển đổi glucose thành acid gluconic Acid acetic sản phẩm phụ cellulose có ảnh hưởng đến giảm pH mơi trường ni cấy [36] Sự 12 giảm pH có ảnh hưởng lên sinh tổng hợp cellulose sinh trưởng vi sinh vật [37] Hình 4.3 cho thấy pH có xu hướng thay đổi khơng đáng kể từ ngày 0–4 vi khuẩn thích nghi với mơi trường có xu hướng giảm từ ngày 4–6 nồng độ acid gluconic tăng Kết là, nồng độ acid gluconic cao thay đổi hoạt động trình trao đổi chất [38] Trong khoảng thời gian lên men 10–15 ngày, oxi hóa glucose tạo thành gluconate dẫn đến giảm suất cellulose giảm pH ức chế 18 4.5 16 14 3.5 12 pH 10 2.5 1.5 0.5 TA (g acetic acid/L) tăng trưởng tế bào sản xuất cellulose Những nghiên cứu khác cho pH giảm xuống 4.0, trình lên men tĩnh tạo cellulose bắt đầu xảy [10] 0 10 11 12 13 14 15 Day pH TA Hình 4.3 Sự thay đổi pH độ acid tổng (g acid acetic/L) dịch lên men sinh tổng hợp cellulose vi khuẩn A xylinum môi trường HS với hàm lượng glucose ban đầu 200 g/L Việc điều chỉnh pH môi trường quan trọng để thu hiệu suất thu hồi cellulose cao [39], [40] Sự oxy hóa glucose enzyme glucose dehydrogenase liên kết màng tế bào tạo nên acid gluconic làm giảm pH môi trường Nếu pH môi trường giảm xuống 3.0, trình tổng hợp cellulose bị ức chế [14] 4.2 SỰ THAY ĐỔI SỐ LƯỢNG VI SINH VẬT Sự thay đổi số lượng vi sinh vật dịch lên men môi trường HS với 50 g/L chất biểu thị qua Hình 4.4 Kết cho thấy số lượng vi sinh vật phát triển liên tục từ ngày đến ngày từ ngày giảm nhẹ ngày ngày 10 vi sinh vật khơng tăng nhiều từ ngày 11 đến ngày 13 vi sinh vật bắt đầu giảm 13 0.12 0.1 OD600 0.08 0.06 0.04 0.02 0 10 11 12 13 Day Hình 4.4 Sự thay đổi số lượng vi sinh vật (mật độ quang bước sóng 600 nm) dịch lên men sinh tổng hợp cellulose vi khuẩn A xylinum môi trường HS với hàm lượng glucose ban đầu 50 g/L 0.12 0.1 OD600 0.08 0.06 0.04 0.02 0 10 11 12 13 14 15 Day Hình 4.5 Sự thay đổi số lượng vi sinh vật (mật độ quang bước sóng 600 nm) dịch lên men sinh tổng hợp cellulose vi khuẩn A xylinum môi trường HS với hàm lượng glucose ban đầu 100 g/L 14 Sự thay đổi số lượng vi sinh vật canh trường lên men với nồng độ chất ban đầu 100 g/L theo thời gian thể qua Hình 4.5 Sự phát triển vi sinh vật tăng đáng kể ngày lên men đầu bắt đầu có xu hướng suy thối sau ngày thứ 0.18 0.16 0.14 OD600 0.12 0.1 0.08 0.06 0.04 0.02 0 10 11 12 13 14 15 Day Hình 4.6 Sự thay đổi số lượng vi sinh vật (mật độ quang bước sóng 600 nm) dịch lên men sinh tổng hợp cellulose vi khuẩn A xylinum môi trường HS với hàm lượng glucose ban đầu 200 g/L Ảnh hưởng thời gian lên men lên số lượng vi sinh vật canh trường lên men với nồng độ chất ban đầu 200 g/L biểu thị Hình 4.6 So với mơi trường có nồng độ chất thấp 200 g/L, số lượng vi sinh vật môi trường 200 g/L glucose cao đáng kể 4.3 SỰ THAY ĐỔI HÀM LƯỢNG GLUCOSE VÀ CELLULOSE Ở mơi trường HS có nồng độ chất 50 g/L, hàm lượng đường giảm đáng kể ngày lên men thứ trì khơng đổi sau khoảng ngày kên men Hàm lượng đường sót lại dịch lên men thấp Điều đáng lưu ý mơi trường 50 g/L, khơng có phát cellulose canh trường lên men Điều giải thích vi sinh vật sử dụng glucose để tăng sinh khối 15 60 50 Glucose (g/L) 40 30 20 10 0 10 11 12 13 Day 120 25 100 20 80 15 60 10 40 20 0 BC (g DW/L) Glucose (g/L) Hình 4.7 Sự thay đổi hàm lượng glucose (g/L) dịch lên men sinh tổng hợp cellulose vi khuẩn A xylinum môi trường HS với hàm lượng glucose ban đầu 50 g/L -5 10 11 12 13 14 15 Day Glucose BC Hình 4.8 Sự thay đổi hàm lượng glucose (g/L) cellulose (g DW/L) dịch lên men sinh tổng hợp cellulose vi khuẩn A xylinum môi trường HS với hàm lượng glucose ban đầu 100 g/L 16 Sự thay đổi hàm lượng đường khử cellulose canh trường lên men với nồng độ chất khô ban đầu 100 g/L thể qua Hình 4.8 Khi hàm lượng đường giảm, tổng hàm lượng vi sinh vật tăng Hàm lượng đường giảm mạnh từ ngày 0–5 vi sinh vật pha phát triển bắt đầu sử dụng đường Kết nghiên cứu tương tự báo cáo Tsouko et al (2015) sử dụng vi sinh vật Komagataeibacter sucrofermentans DSM 15973 lên men sinh tổng hợp cellulose từ bã dầu hướng dương [41] Báo cáo cho thấy lượng đường giảm hàm lượng vi sinh vật tăng thời gian lên men tăng hàm lượng vi sinh vật tăng 250 45 40 200 35 150 25 20 100 15 BC (g DW/L) Glucose (g/L) 30 10 50 0 -5 10 11 12 13 14 15 Day Glucose BC Hình 4.9 Sự thay đổi hàm lượng glucose (g/L) cellulose (g DW/L) dịch lên men sinh tổng hợp cellulose vi khuẩn A xylinum môi trường HS với hàm lượng glucose ban đầu 200 g/L Trong nghiên cứu này, việc sử dụng môi trường có hàm lượng chất ban đầu 10% có khả thúc đẩy việc cải thiện sinh tổng hợp cellulose Kết phù hợp với kết tác giả Jagannath et al (2008) [42] Tuy nhiên, tác giả Embuscado et al (1994) lại kết luận nồng độ chất khơ 5% khơng có ảnh hưởng lên sinh tổng hợp cellulose [20] Tiền chất cellulose trình lên men A xylinum uridine diphosphoglucose nên tổng hợp BC có liên quan tới việc sử dụng chất glucose fructose nguồn carbon [12] Cellulose hình thành có hàm lượng chất khô 1% với khả ưa nước giữ nước tốt [43] 17 Lượng vi sinh vật, hàm lượng đường thời gian lên men ba yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến trình lên men cellulose vi khuẩn Hình 4.9 cho thấy hàm lượng đường thời gian lên men hàm lượng vi sinh vật Khi hàm lượng đường giảm dẫn đến tổng hàm lượng vi sinh vật tăng thời gian lên men tăng tổng hàm lượng vi sinh vật tăng Hàm lượng đường giảm dần từ ngày 0–8 vi sinh vật pha tăng trưởng nên nguồn cung cấp carbon ban đầu giảm, vi khuẩn bắt đầu sử dụng acid gluconic trình trao đổi chất thời gian độ kết tinh màng BC tăng dần Hàm lượng đường từ ngày 0–9 giảm mạnh từ ngày 9–15 dần ổn định Theo tác giả Jagannath et al (2008), khơng có hình thành cellulose giai đoạn đầu trình lên men vi khuẩn A xylinum Cellulose hình thành sau ngày thứ Trong suốt thời gian đầu, canh trường lên men trở nên đục [42] So với ni cấy tĩnh, q trình lên men có khuấy đảo cải thiện sinh trưởng vi sinh vật Tuy nhiên, phương pháp lên men lại hạn chế hình thành cellulose cellulose hình thành dạng hạt khơng phải dạng lớp nuôi cấy tĩnh [44] 18 Chương KẾT LUẬN VÀ KHUYẾN NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN Trong nghiên cứu này, ảnh hưởng nồng độ chất lên trình lên men cellulose vi khuẩn A xylinum khảo sát Nồng độ chất thay đổi giá trị 50, 100, 200 g/L Quá trình lên men cellulose mô tả dựa thay đổi pH, độ acid tổng, hàm lượng glucose, số lượng vi sinh vật canh trường lên men hiệu suất sinh tổng hợp BC Môi trường HS với nồng độ chất 50 g/L khơng có hình thành cellulose lượng đường vi sinh vật sử dụng tăng sinh khối không sản xuất cellulose Sự giảm pH tăng hàm lượng acid tổng môi trường 200 g/L chất cao đáng kể so với môi trường 100 g/L Điều thúc đẩy việc sinh khối tổng hợp cellulose 5.2 KHUYẾN NGHỊ Trong trình nghiên cứu, thời gian thí nghiệm điều kiện trang thiết bị hạn chế nên nghiên cứu cịn nhiều khía cạnh khảo sát chưa thực Những vấn đề cần nghiên cứu kỹ nghiên cứu bao gồm: ˗ So sánh loài vi khuẩn sinh tổng hợp cellulose khác; ˗ Tính tốn thơng số động học trình lên men; ˗ Khảo sát tiêu hiển vi liên quan tới cấu trúc cellulose thu nhận 19 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] D N.-S Hon, “Cellulose: a random walk along its historical path,” Cellulose, vol 1, no 1, pp 1–25, 1994 [2] P Béguin and J.-P Aubert, “The biological degradation of cellulose,” FEMS Microbiol Rev., vol 13, no 1, pp 25–58, 1994 [3] J Bi et al., “Morphology and structure characterization of bacterial celluloses produced by different strains in agitated culture,” J Appl Microbiol., vol 117, no 5, pp 1305–1311, 2014 [4] D Klemm, B Heublein, H Fink, and A Bohn, “Cellulose: fascinating biopolymer and sustainable raw material,” Angew chemie Int Ed., vol 44, no 22, pp 3358–3393, 2005 [5] R M Brown Jr, “Cellulose structure and biosynthesis: what is in store for the 21st century?,” J Polym Sci Part A Polym Chem., vol 42, no 3, pp 487–495, 2004 [6] P Ross, R Mayer, and M Benziman, “Cellulose biosynthesis and function in bacteria.,” Microbiol Mol Biol Rev., vol 55, no 1, pp 35–58, 1991 [7] L R Lynd, P J Weimer, W H Van Zyl, and I S Pretorius, “Microbial cellulose utilization: fundamentals and biotechnology,” Microbiol Mol Biol Rev., vol 66, no 3, pp 506–577, 2002 [8] A Hirai, M Tsuji, H Yamamoto, and F Horii, “In situ crystallization of bacterial cellulose III Influences of different polymeric additives on the formation of microfibrils as revealed by transmission electron microscopy,” Cellulose, vol 5, no 3, pp 201–213, 1998 [9] M Schramm and S Hestrin, “Factors affecting production of cellulose at the air/liquid interface of a culture of Acetobacter xylinum,” Microbiology, vol 11, no 1, pp 123–129, 1954 [10] P G Verschuren, T D Cardona, M J R Nout, K D De Gooijer, and J C Van den Heuvel, “Location and limitation of cellulose production by Acetobacter xylinum established from oxygen profiles,” J Biosci Bioeng., vol 89, no 5, pp 414–419, 2000 [11] M Schramm, Z Gromet, and S Hestrin, “Synthesis of cellulose by Acetobacter Xylinum Substrates and inhibitors,” Biochem J., vol 67, no 4, p 669, 1957 [12] E J Vandamme, S De Baets, A Vanbaelen, K Joris, and P De Wulf, “Improved production of bacterial cellulose and its application potential,” Polym Degrad Stab., vol 59, no 1–3, pp 93–99, 1998 [13] M Iguchi, S Yamanaka, and A Budhiono, “Bacterial cellulose—a masterpiece of nature’s arts,” J Mater Sci., vol 35, no 2, pp 261–270, 2000 [14] A Krystynowicz et al., “Molecular basis of cellulose biosynthesis disappearance in submerged culture of Acetobacter xylinum,” ACTA Biochim Pol Ed., vol 52, no 3, p 691, 2005 [15] K V Ramana, A Tomar, and L Singh, “Effect of various carbon and nitrogen sources on cellulose synthesis by Acetobacter xylinum,” World J Microbiol Biotechnol., vol 16, no 3, pp 245–248, 2000 [16] P R Chawla, I B Bajaj, S A Survase, and R S Singhal, “Fermentative production of microbial cellulose,” Food Technol Biotechnol, vol 47, no 2, pp 107–124, 2009 [17] E P Çoban and H Biyik, “Evaluation of different pH and temperatures for bacterial cellulose production in HS (Hestrin-Scharmm) medium and beet molasses medium,” Afr J Microbiol Res, vol 5, no 9, pp 1037–1045, 2011 [18] S Tantratian, P Tammarate, W Krusong, P Bhattarakosol, and A Phunsri, “Effect of dissolved oxygen on cellulose production by Acetobacter sp,” J Sci Res Chula Univ, vol 30, pp 179–186, 2005 [19] A Ishikawa, M Matsuoka, T Tsuchida, and F Yoshinaga, “Increase in cellulose production by sulfaguanidine-resistant mutants derived from Acetobacter xylinum subsp sucrofermentans,” Biosci Biotechnol Biochem., vol 59, no 12, pp 2259– 2262, 1995 [20] M E Embuscado, J S Marks, and J N BeMiller, “Bacterial cellulose I Factors affecting the production of cellulose by Acetobacter xylinum,” Topics in Catalysis, vol 8, no pp 407–418, 1994 [21] D P Delmer and Y Amor, “Cellulose biosynthesis.,” Plant Cell, vol 7, no 7, p 987, 1995 [22] D P Delmer, “Cellulose biosynthesis: exciting times for a difficult field of study,” Annu Rev Plant Biol., vol 50, no 1, pp 245–276, 1999 [23] I I Shamolina, “Prospects for use of microbial raw material for fabrication of fibre and film materials Review,” Fibre Chem., vol 29, no 1, pp 1–8, 1997 [24] R M Brown, J H Willison, and C L Richardson, “Cellulose biosynthesis in Acetobacter xylinum: visualization of the site of synthesis and direct measurement of the in vivo process,” Proc Natl Acad Sci., vol 73, no 12, pp 4565–4569, 1976 [25] Y.-C Hsieh, H Yano, M Nogi, and S J Eichhorn, “An estimation of the Young’s modulus of bacterial cellulose filaments,” Cellulose, vol 15, no 4, pp 507–513, 2008 [26] A N Nakagaito, S Iwamoto, and H Yano, “Bacterial cellulose: the ultimate nano-scalar cellulose morphology for the production of high-strength composites,” Appl Phys A, vol 80, no 1, pp 93–97, 2005 [27] E Trovatti et al., “Novel bacterial cellulose–acrylic resin nanocomposites,” Compos Sci Technol., vol 70, no 7, pp 1148–1153, 2010 [28] J Ye et al., “Bacterial cellulose production by Acetobacter xylinum ATCC 23767 using tobacco waste extract as culture medium,” Bioresour Technol., vol 274, pp 518–524, 2019 [29] Z Lu, Y Zhang, Y Chi, N Xu, W Yao, and B Sun, “Effects of alcohols on bacterial cellulose production by Acetobacter xylinum 186,” World J Microbiol Biotechnol., vol 27, no 10, pp 2281–2285, 2011 [30] L L Zhou, D P Sun, L Y Hu, Y W Li, and J Z Yang, “Effect of addition of sodium alginate on bacterial cellulose production by Acetobacter xylinum,” J Ind Microbiol Biotechnol., vol 34, no 7, p 483, 2007 [31] G L Miller, “Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar,” Anal Chem., vol 31, no 3, pp 426–428, 1959 [32] S Masaoka, T Ohe, and N Sakota, “Production of cellulose from glucose by Acetobacter xylinum,” J Ferment Bioeng., vol 75, no 1, pp 18–22, 1993 [33] M Gullo, C Caggia, L De Vero, and P Giudici, “Characterization of acetic acid bacteria in ‘traditional balsamic vinegar,’” Int J Food Microbiol., vol 106, no 2, pp 209–212, 2006 [34] K Kamide, Y Matsuda, H Iijima, and K Okajima, “Effect of culture conditions of acetic acid bacteria on cellulose biosynthesis,” Br Polym J., vol 22, no 2, pp 167–171, 1990 [35] J H Ha, N Shah, M Ul-Islam, T Khan, and J K Park, “Bacterial cellulose production from a single sugar α-linked glucuronic acid-based oligosaccharide,” Process Biochem., vol 46, no 9, pp 1717–1723, 2011 [36] S Kongruang, “Bacterial cellulose production by Acetobacter xylinum strains from agricultural waste products,” in Biotechnology for Fuels and Chemicals, Springer, 2007, pp 763–774 [37] A Seto, Y Kojima, N Tonouchi, T Tsuchida, and F Yoshinaga, “Screening of bacterial cellulose-producing Acetobacter strains suitable for sucrose as a carbon source,” Biosci Biotechnol Biochem., vol 61, no 4, pp 735–736, 1997 [38] J K Park, S H Hyun, and J Y Jung, “Conversion ofG hansenii PJK into noncellulose-producing mutants according to the culture condition,” Biotechnol Bioprocess Eng., vol 9, no 5, p 383, 2004 [39] G Joseph, G E Rowe, A Margaritis, and W Wan, “Effects of polyacrylamideco-acrylic acid on cellulose production by Acetobacter xylinum,” J Chem Technol Biotechnol Int Res Process Environ Clean Technol., vol 78, no 9, pp 964–970, 2003 [40] S T Park, E Kim, and Y M Kim, “Overproduction of cellulose in Acetobacter xylinum KCCM 10100 defective in GDP-mannosyltransferase,” J Microbiol Biotechnol., vol 16, no 6, pp 961–964, 2006 [41] E Tsouko et al., “Bacterial cellulose production from industrial waste and byproduct streams,” Int J Mol Sci., vol 16, no 7, pp 14832–14849, 2015 [42] A Jagannath, A Kalaiselvan, S S Manjunatha, P S Raju, and A S Bawa, “The effect of pH, sucrose and ammonium sulphate concentrations on the production of bacterial cellulose (Nata-de-coco) by Acetobacter xylinum,” World J Microbiol Biotechnol., vol 24, no 11, p 2593, 2008 [43] S Yamanaka et al., “The structure and mechanical properties of sheets prepared from bacterial cellulose,” J Mater Sci., vol 24, no 9, pp 3141–3145, 1989 [44] R E Cannon and S M Anderson, “Biogenesis of bacterial cellulose,” Crit Rev Microbiol., vol 17, no 6, pp 435–447, 1991 [45] ... hợp cellulose vi khuẩn Acetobacter xylinum Khảo sát ảnh hưởng nồng độ chất lên thay đổi số lượng vi khuẩn dịch lên men sinh tổng hợp cellulose vi khuẩn Acetobacter xylinum Khảo sát ảnh hưởng nồng. .. sát ảnh hưởng nồng độ chất lên thay đổi số lượng vi khuẩn dịch lên men sinh tổng hợp cellulose vi khuẩn Acetobacter xylinum ˗ Khảo sát ảnh hưởng nồng độ chất lên thay đổi hàm lượng glucose cellulose. .. MEN CELLULOSE CỦA VI KHUẨN ACETOBACTER XYLINUM Nhiệm vụ luận văn ˗ Khảo sát ảnh hưởng nồng độ chất lên thay đổi pH độ acid tổng dịch lên men sinh tổng hợp cellulose vi khuẩn Acetobacter xylinum