Nghiên cứu điều kiện lên men cordyceps sinensis tạo sinh khối giàu selen và khảo sát hoạt tính sinh học

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - Lê Quốc Phong NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN LÊN MEN Cordyceps sinensis TẠO SINH KHỐI GIÀU SELEN VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH SINH HỌC LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC TP Hồ Chí Minh – Năm 2021 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - Lê Quốc Phong NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN LÊN MEN Cordyceps sinensis TẠO SINH KHỐI GIÀU SELEN VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH SINH HỌC Chun ngành: Cơng nghệ sinh học Mã số: 42 02 01 LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TSKH Ngơ Kế Sương TP Hồ Chí Minh – Năm 2021 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành chương trình Nghiên cứu sinh Luận án Tiến sĩ, tơi nhận quan tâm, chia sẻ, hỗ trợ nhiều thầy cô, anh chị, bạn bè khoá, đồng nghiệp đơn vị Xin trân trọng cám ơn PGS.TSKH Ngô Kế Sương, người thầy đáng kính ln động viên, hướng dẫn, góp ý kiến để tơi hồn thiện Luận án Trân trọng cám ơn TS Đinh Minh Hiệp hỗ trợ, giúp đỡ, chia sẻ suốt trình thực Luận án Xin trân trọng cám ơn thầy cô giáo Viện Sinh học Nhiệt đới, Học Viện Khoa học Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, Trường ĐH Khoa học Tự nhiên- Đại học Quốc gia Tp Hồ Chí Minh truyền đạt kiến thức, góp ý cho tơi suốt q trình học tập thực đề tài Trân trọng cám ơn bạn nhóm nghiên cứu (TS Trần Minh Trang, ThS Nguyễn Tài Hoàng) dành nhiều tâm huyết, thời gian, hỗ trợ tơi hồn thành Luận án Trân trọng cám ơn Trung ương Đồn TNCS Hồ Chí Minh, quan công tác suốt thời gian thực Luận án, chia sẻ, tạo điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành chương trình học tập nghiên cứu Và cuối cùng, tơi xin dành tình cảm, biết ơn gia đình, người ln mong mỏi, âm thầm quan tâm, động viên, khích lệ để tơi hồn thành Luận án Trân trọng cám ơn MỤC LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT i DANH MỤC HÌNH v DANH MỤC BẢNG vii MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Nấm Cordyceps sinensis 1.1.1 Đặc điểm, phân bố 1.1.2 Hoạt tính sinh học 1.2 Selen vai trò sinh học selen 1.2.1 Nguồn selen 1.2.2 Vai trò selen thể 1.2.3 Con đường chuyển hóa selen nấm 11 1.3 Nuôi trồng nấm Cordyceps 13 1.3.1 Nuôi trồng Cordyceps 13 1.3.2 Các nghiên cứu nuôi cấy Cordyceps bổ sung selen 15 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.1 Vật liệu 17 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 17 2.1.2 Hóa chất 17 2.1.3 Thiết bị 17 2.2 Nội dung nghiên cứu 18 2.3 Địa điểm thời gian thực 18 2.3.1 Địa điểm thực hiện: 18 2.3.2 Thời gian thực 18 2.4 Phương pháp nghiên cứu 18 2.4.1 Chuẩn bị giống 18 2.4.2 Khảo sát ảnh hưởng Se đến C sinensis môi trường PGA môi trường lỏng PS 18 2.4.2.1 Khảo sát ảnh hưởng Se đến C sinensis môi trường PGA 18 2.4.2.2 Khảo sát ảnh hưởng Se đến C sinensis môi trường lỏng PS 19 2.4.3 Phương pháp ni cấy thích nghi cải tiến 19 2.4.4 Tối ưu hóa mơi trường điều kiện ni cấy Cordyceps sinensis môi trường lỏng bổ sung selen 20 2.4.3.1 Sàng lọc thành phần môi trường Plackett – Burman 20 2.4.3.2 Tối ưu hóa thành phần mơi trường bổ sung selen mơ hình đáp ứng bề mặt Box -Behnken 21 2.4.3.3 Tối ưu hóa điều kiện ni cấy mơ hình đáp ứng bề mặt Doptimal 23 2.4.5 Phương pháp thu nhận cao chiết 24 2.4.5.1 Cao chiết tổng 24 2.4.5.2 Cao chiết phân đoạn 25 2.4.5.3 Cao chiết CPS 25 2.4.5.4 Thu nhận EPS 25 2.4.5.5 Thu nhận IPS 26 2.4.6 Khảo sát hoạt tính sinh học cao chiết 26 2.4.6.1 Khả bắt gốc tự ABTS 26 2.4.6.2 Khả bắt gốc tự DPPH 26 2.4.6.3 Xác định lực khử 27 2.4.6.4 Xác định khả bảo vệ DNA 27 2.4.6.5 Hoạt tính ức chế xanthine oxidase 27 2.4.6.6 Đánh giá hoạt tính kháng viêm 28 2.4.6.7 Hoạt tính ức chế α-glucosidase 28 2.4.6.8 Khảo sát khả gây độc tế bào 28 2.7 Định lượng selen nấm Cordyceps sinensis 29 2.7.1 Phân tích selen tổng 29 2.7.2 Phân tích selen nguyên dạng 29 2.7.3 Phân tích FT-IR 30 2.8 Thử nghiệm độc tính cấp sinh khối nấm Cordyceps sinensis giàu selen 30 2.9 Phương pháp xử lý số liệu 30 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 31 3.1 Về ảnh hưởng selen đến phát triển nấm Cordyceps sinensis 31 3.1.1 Ảnh hưởng selen đến phát triển tơ nấm Cordyceps sinensis 31 3.1.2 Ảnh hưởng selen đến sản xuất sinh khối nấm Cordyceps sinensis 33 3.1.3 Về nâng cao khả phát triển sản xuất sinh khối nấm Cordyceps sinensis môi trường bổ sung selenate phương pháp nuôi cấy thích nghi cải tiến 36 3.2 Tối ưu hóa mơi trường điều kiện ni cấy để nâng cao chuyển hóa selen sinh khối nấm Cordyceps sinensis 41 3.2.1 Sàng lọc thành phần môi trường ảnh hưởng đến sản xuất sinh khối tích lũy selen nấm Cordyceps sinensis 41 3.2.2 Tối ưu hóa thành phần mơi trường 48 3.2.3 Tối ưu hóa điều kiện ni cấy 52 3.2.4 Thảo luận 57 3.3 Xác định thành phần hoạt chất dạng selen chuyển hóa nấm Cordyceps sinensis 60 3.3.1 Thu nhận cao chiết từ sinh khối nấm dịch nuôi cấy 60 3.3.2 Hàm lượng selen cao chiết 61 3.3.3 Sự diện selen cao chiết chứa polysaccharide .62 3.4 Về hoạt tính sinh học nấm Cordyceps sinensis giàu selen 64 3.4.1 Hoạt tính kháng oxy hóa 64 3.4.1.1 Hoạt tính bắt gốc tự ABTS 64 3.4.1.2 Hoạt tính bắt gốc tự DPPH 66 3.4.1.3 Hoạt tính kháng oxy hóa thơng qua lực khử 67 3.4.1.4 Hoạt tính kháng oxy hóa dựa khả bảo vệ tính nguyên vẹn DNA 68 3.4.2 Khả ức chế xanthine oxidase 69 3.4.3 Hoạt tính kháng viêm in vitro 70 3.4.4 Hoạt tính ức chế α–glucosidase 72 3.4.5 Hoạt tính ức chế tăng sinh tế bào ung thư 73 3.4.6 Thảo luận chung hoạt tính sinh học 76 3.5 Đề xuất quy trình nuôi cấy sản xuất nấm Cordyceps sinensis giàu selen 81 3.5.1 Thành phần hoạt chất sinh học nấm 81 3.5.2 Đánh giá độc tính cấp sinh khối C sinensis giàu Se chuột 83 3.5.3 Đánh giá tiêu an toàn thực phẩm 84 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 89 NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN 90 DANH MỤC CƠNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ 91 TÀI LIỆU THAM KHẢO 93 PHỤ LỤC 104 MỞ ĐẦU Nấm Đông trùng Hạ thảo Cordyceps sinensis (đồng tên: Ophiocordyceps sinensis) loài nấm dược liệu quý sử dụng phổ biến Y học cổ truyền Trung Hoa Adenosine cordycepin hai dược chất quý xem chất thị hoạt tính sinh học quan trọng cho loài nấm Các nghiên cứu đại chứng minh hoạt chất từ C sinensis có khả tăng cường miễn dịch, chống lão hóa, kháng viêm, kháng ung thư hỗ trợ điều trị bệnh liên quan đến phổi, thận, bệnh mạn tính khác đái tháo đường Hiện nay, C sinensis tự nhiên ngày việc khai thác mức kèm với biến đổi khí hậu Do đó, nghiên cứu ni cấy nhân tạo loại nấm quý nhận nhiều quan tâm vài thập kỷ qua Sử dụng môi trường bán rắn tạo thể môi trường lỏng nhân thu sinh khối loài nấm hai hướng tiếp cận phổ biến Trong đó, nhân ni sinh khối nấm mang tính ứng dụng thực tiễn cao cơng nghệ khơng sản xuất sinh khối nấm có thành phần hoạt chất tương tự tự nhiên, mà cịn triển khai sản xuất quy mô công nghiệp thời gian ngắn với chi phí thấp so với kỹ thuật ni cấy thể Nhiều phương pháp nuôi cấy lỏng cải tiến thử nghiệm để nâng cao giá trị hoạt chất hoạt tính sinh học sinh khối nấm C sinensis Nghiên cứu ảnh hưởng nguyên tố khoáng vi lượng đến khả sản xuất sinh khối hợp chất thứ cấp chủ đề nhận nhiều quan tâm Trong đó, selen (Se) xem tiền chất đầy tiềm việc nâng cao dược tính sinh học nấm Đơng trùng Hạ thảo Hơn nữa, Se thành phần acid amin 21 gọi selenocysteine Nguyên tố tham gia vào cấu trúc nhiều enzyme kháng oxy hóa glutathione peroxidase, iodothyronine deiodinases thioredoxin reductase có chức sinh lý quan trọng kháng oxy hóa, kháng ung thư, tăng cường miễn dịch, ức chế HIV chống lão hóa Sự tham gia Se hệ thống miễn dịch kết hợp với số chế, bao gồm hoạt động gia tăng sản xuất tế bào miễn dịch NK (Natural killer cell), tế bào lympho T, lympho B, interferon C làm thụ thể có lực cao với interleukin-2, kích thích miễn dịch vắc-xin gây Bên cạnh đó, Se cịn có vai trị quan trọng chuyển hóa iốt, nghiên cứu nồng độ Se huyết trẻ bị bướu cổ thường thấp so với trẻ có kích thước tuyến giáp bình thường Như vậy, thiếu hụt Se tác động xấu đến sức khỏe Mặc dù nước ta có số dược liệu chứa Se như: tỏi, nấm linh chi nhàu hàm lượng Se loại dược liệu thường thấp không ổn định Từ năm 2003 – 2005, Bộ Y tế khuyến khích định hướng nghiên cứu sản xuất Se hữu có khả dụng sinh học cao Đề án “Chiến lược quốc gia dinh dưỡng giai đoạn 2011-2020 tầm nhìn đến năm 2030” (689/TH ngày 29/6/2011) nhấn mạnh phòng chống thiếu vi chất dinh dưỡng nay, có liên quan đến Se Chính lẽ đó, đề tài “Nghiên cứu điều kiện lên men Cordyceps sinensis tạo sinh khối giàu selen khảo sát hoạt tính sinh học” thực với: Mục tiêu tổng quát nghiên cứu: Sản xuất sinh khối nấm C sinensis giàu Se có hoạt tính sinh học cải thiện tạo nguồn Se có khả dụng sinh học cao Mục tiêu cụ thể nghiên cứu: (1) Xây dựng quy trình lên men sản xuất sinh khối nấm C sinensis giàu Se (2) Đánh giá số hoạt tính sinh học hoạt chất chứa Se từ sinh khối nấm C sinensis giàu Se Ý nghĩa khoa học thực tiễn: Ý nghĩa khoa học: Kết nghiên cứu cung cấp liệu khoa học ảnh hưởng Se đến sản xuất sinh khối hoạt tính sinh học sinh khối nấm Cordyceps sinensis, khả tích lũy Se sinh khối nấm Đồng thời, cơng trình giúp hiểu rõ thêm dạng Se hữu nấm Ý nghĩa thực tiễn: Kết tạo tiền đề sở kỹ thuật nhằm chuyển giao công nghệ để sản xuất ứng dụng sinh khối C sinensis giàu Se có hoạt tính sinh học cao việc phát triển sản phẩm thực phẩm bổ sung, bảo vệ sức khỏe CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Nấm Cordyceps sinensis 1.1.1 Đặc điểm, phân bố Cordyceps sinensis lồi nấm kí sinh ấu trùng lồi bướm đêm Thitarodes (Hepialus) armoricanus thuộc họ Hepialidae sống đất (hình 1.1) [1] Đây lồi nấm đặc hữu vùng cao nguyên Tây Tạng vùng đồng cỏ núi cao xung quanh khu vực dãy Himalaya Bhutan, Trung Quốc Nepal độ cao 3500-5000 m so với mực nước biển [2] Giá trị dược liệu loài nấm ghi nhận cách 2000 năm Trung Quốc nước phương Đông với tác dụng cải thiện chức gan thận, chữa đổ mồ hôi đêm, bệnh tiểu đường, máu nhiễm mỡ, bệnh tim, hồi phục sức khỏe, tăng tuổi thọ nâng cao thể trạng thể [3] [4] C sinensis ngồi tự nhiên Hình có nguồn gốc từ công bố Shrestha cộng (2013) [5] Đến năm 2007, Sung cộng tiến hành phân tích mối quan hệ 162 lồi Cordyceps việc phân tích - locus bao gồm ribosome tiểu phần nhỏ tiểu phần lớn (nrSSU dnrLSU), nhân tố kéo dài 1α (tef1), hai tiểu đơn vị lớn RNA polymerase II (rpb1 rpb2), β-tubulin (tub) ti thể ATP6 (atp6) xếp Cordyceps sinensis vào chi Ophiocordyceps đổi tên Ophiocordyceps sinensis 119 O sinensis giàu selen Cao chiết Cao H2O Cao CPS Cao IPS EPS Phụ lục 16: Khả ức chế α-glucosidase cao chiết C sinensis O, sinensis giàu selen Cao chiết Cao EtOH 120 O, sinensis giàu selen Cao chiết Cao PE Cao EtOAc Cao BuOH Cao H2O Cao CPS Cao IPS EPS 121 Phụ lục 17: Môi trường nuôi khuẩn, môi trường thực kháng khuẩn Môi trường thực kháng khuẩn: Môi trường Muller Hinton Agar (MHA): Cao thịt 2g/L; Casein 17,5g/L;Tinh bột 1,5g/L; Agar 17g/L Phụ lục 18: Kết khảo sát khả ức chế XO cao chiết từ sinh khối nấm C sinensis nồng độ 4000µg/mL Mẫu EtOH PE EtOAc BuOH Nước CPS IPS EPS Phụ lục 19: Kết thử độc tính cấp chuột C sinensis giàu Se CS-Se liều 2500mg/kg STT Ngày 1 21,2 22,1 21,5 19,3 20,7 19,1 23 122 CS-Se liều 2500mg/kg STT Ngày 19,3 19,4 10 20,6 11 21,5 12 22 13 22 14 21,6 Phụ lục 20: Phần trăm gây độc tế bào (%) fibroblast C sinensis giàu Se C sinensis ĐC 123 Phụ lục 21: Phần trăm gây độc tế bào MCF-7 nồng độ khác Mẫu C sinensis giàu Se C sinensis ĐC 124 Mẫu 125 Phụ lục 22: Phần trăm gây độc tế bào Jurkat nồng độ khác STT C sinensis giàu Se C sinensis ĐC 126 Phụ lục 23: Mật độ tế bào ung thư sau xử lý với mẫu cao từ C sinensis ĐC 48 (200x) A: CPT 0,05mgSe/L; B: Cao EtOH 100mgSe/L; C: Cao PE100mgSe/L; D: Cao EtOAc100mgSe/L; E: Cao BuOH100mgSe/L Phụ lục 24: Sự phát triển nấm Cordyceps sinensis môi trường PGA bổ sung selenourea từ đến 40 mgSe/L thời điểm 15 ngày 127 Phụ lục 25: Sắc kí đồ selen nguyên dạng SeCysa 128 Phụ lục 26: Sắc kí đồ phân tích selen nguyên dạng mẫu sinh khối nấm C sinensis C sinensis theo PP1 Sắc kí đồ SeMet, SeCys2, Se4+, Se6+, SeMetCys C sinensis theo PP1 Sắc kí đồ SeCysa 129 C sinensis theo PP2 Sắc kí đồ SeMet, SeCys2, Se4+, Se6+, SeMetCys C sinensis theo PP2 Sắc kí đồ SeCysa 130 Phụ lục 27: Kết phân tích thành phần dinh dưỡng, hoạt chất tiêu ATTP ... ? ?Nghiên cứu điều kiện lên men Cordyceps sinensis tạo sinh khối giàu selen khảo sát hoạt tính sinh học? ?? thực với: Mục tiêu tổng quát nghiên cứu: Sản xuất sinh khối nấm C sinensis giàu Se có hoạt. .. DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - Lê Quốc Phong NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN LÊN MEN Cordyceps sinensis TẠO SINH KHỐI GIÀU SELEN VÀ... hoạt tính sinh học cải thiện tạo nguồn Se có khả dụng sinh học cao Mục tiêu cụ thể nghiên cứu: (1) Xây dựng quy trình lên men sản xuất sinh khối nấm C sinensis giàu Se (2) Đánh giá số hoạt tính sinh