Đặc tính phân tử và phân bố mô bệnh học của gene FABP (fatty acid binding protein) ở sán máng Schistosoma Mekong

Nghiên cứu này tập trung vào việc tạo dòng gen, phân tích đặc tính, sự phân bố ở các mô và dự đoán tế bào B sinh miễn dịch của gen FABP ở S. mekongi. Điều này làm cơ sở cho việc nghiên cứu phát triển vắc-xin chống lại S. mekongi cũng như là giải pháp bền vững để phòng bệnh sán máng trong tương lai.

VIỆN NGHIÊN CỨU NI TRỒNG THỦY SẢN II ĐẶC TÍNH PHÂN TỬ VÀ PHÂN BỐ MÔ BỆNH HỌC CỦA GENE FABP (FATTY ACID BINDING PROTEIN) Ở SÁN MÁNG SCHISTOSOMA MEKONG Đỗ Thị Cẩm Hồng1*, Wanwisa Peonsamut2, Manaw Sangfuang2, Yanin Limpanont3, Charoonroj Chotwiwattanakun4, Prasert Sobhon5, Narin Preyavichyapugdee2 TÓM TẮT Fatty Acid-Binding Protein (FABP) protein liên kết lipid nội bào, có trọng lượng phân tử khoảng 14-15 kDa đóng vai trị quan trọng cho tổng hợp màng ngồi tái tạo da FABP sáu loại protein WHO lựa chọn làm ứng cử viên cho phát triển vắc-xin để phòng ngừa bệnh sán máng (Bilharziasis) giống Schistosoma sống máu người động vật gây vùng nhiệt đới, nơi mà cộng đồng người nghèo khơng có nguồn nước điều kiện vệ sinh đầy đủ Trong nghiên cứu này, trình tự ADN bổ sung (cADN) mã hố protein FABP Schistosoma mekongi trưởng thành (SmekFABP) tạo dòng phân tích trình tự Kết thu đoạn trình tự nucleotide gen SmekFABP với chiều dài 582 bp có chứa khung đọc mở mã hố gen SmekFABP với chiều dài 132 axít amin Trình tự axít amin protein SmekFABP có tương đồng với FABP S japonicum (GenBank: AA64426) đến 95,4%, với loài Schistosoma khác bao gồm S mannsoni S haematobium 91,7% 90,2% Trọng lượng phân tử protein SmekFABP 14.84 kDa protein FABP tái tổ hợp (rSmekFABP) có gắn histidine 15,5 kDa Kết điện di gel SDS-PAGE, ghi nhận vạch, vạch có trọng lượng 26 kDa; protein rSmekFABP dạng liên kết hai đơn vị (dimer) vạch mờ có trọng lượng 15,5 kDa protein rSmekFABP dạng đơn (monomer) Độ tương đồng đồng dạng protein SmekFABP so sánh với S japonicum cao, phân bố vị trí mơ bệnh học giống nhau, điều cho thấy gen FABP hai loài ký sinh trùng có chung nguồn gốc Trong khi, độ tương đồng đồng dạng protein FABP S mekongi ký chủ động vật hữu nhũ thấp Do đó, protein dùng để phát triển vắc-xin chống lại bệnh nhiễm trùng S mekongi mà không bị tương tác với protein FABP ký chủ đáp ứng sinh miễn dịch vắc-xin Thêm vào đó, nghiên cứu sử dụng chương trình tin sinh học khác bao gồm Hoop & Woods; Welling, Parker, B-EpiPred ABCpred để phân tích protein FABP thu được, kết là, epitope kháng nguyên dạng peptid có trình tự từ vị trí 87-DSESKITQTQKDAKN-101 ghi nhận Theo nghiên cứu trước đây, đoạn peptide loại epitope kháng nguyên tiềm đối protein kháng thể CTL MHC-I hệ thống miễn dịch ký chủ động vật hữu nhũ Từ khóa: FABP, Schistosoma mekongi, kháng nguyên, vắc xin, CTL (Cytotoxic T lymphocyte), MHC-I (Major Histocompatility Conplex –I) Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II Trường Đại học Silpakorn, Thái Lan Applied Malacology Unit, Faculty of Tropical Medicine, Mahidol University, Bangkok, Thailand Mahidol University, Nakhonsawan Campus, Nakhonsawan, Thailand Department of Anatomy, Faculty of Science, Mahidol University, Bangkok, Thailand * Email: camhong573@gmail.com TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 19 - THÁNG 6/2021 45 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II I GIỚI THIỆU Bệnh sán máng (được gọi Bilharziasis) giống Schistosoma sống máu người động vật gây vùng nhiệt đới nơi cộng đồng người nghèo khơng có nguồn nước điều kiện vệ sinh đầy đủ (Santos, 2011) Ước tính có khoảng 4.400 đến 200.000 người chết hàng năm bệnh sán máng gây toàn giới (Thétiot ‐ Laurent & ctv., 2013); lây truyền tồn 75 đến 76 quốc gia (Mohamed & ctv., 2018) Ít nhất, loài sán nhiễm người Schistosomam haematobium, Schistosoma intercalatum, Schistosoma guineesis, Schistsosoma japonicum, Schistosoma mansoni Schitosoma mekongi (Gordon & ctv., 2019) Năm 1978, S mekongi xác định lần (Voge & ctv., 1978); loài đặc hữu lưu vực sông Mekong, vài nơi Thái Lan (Sornmani & ctv., 1971) Bệnh sán máng gây phản ứng miễn dịch trứng Schistosoma bị nhiễm mô Trứng giải phóng kháng ngun dẫn đến kích thích phản ứng tạo u hạt liên quan đến tế bào T, đại thực bào bạch cầu dẫn đến dấu hiệu lâm sàng bệnh (Othman & Soliman, 2015; Webster & ctv., 2013) Hiện nay, Praziquantel (PZQ) lựa chọn để điều trị bệnh sán máng nhờ vào phổ rộng, an toàn hiệu cao (Vale & ctv., 2017) Mặc dù PZQ có hiệu quả, nhiên khơng ngăn ngừa tái nhiễm (Wu & ctv., 1994), việc sử dụng lặp lại PZQ điều trị dẫn tới thể schistosomes kháng PZQ (Cupit & Cunningham, 2015) Do đó, việc phát triển vắc-xin xem chiến lược bền vững để kiểm soát lây truyền bệnh cách lâu dài (Fonseca & ctv., 2012) FABP protein liên kết lipid nội bào, có trọng lượng phân tử thấp (14-15 kDa) đóng vai trị quan trọng cho tổng hợp màng tái tạo da Tuy nhiên, FABP tổng hợp thể giun sán, 46 mà hấp thụ từ ký chủ động vật (Bennett & Caulfield, 1991) FABP ứng cử viên phát triển vắc-xin WHO lựa chọn để chống lại bệnh sán máng (Bergquist N, 1995) Thêm vào đó, nghiên cứu Rahmani cộng (2019) cho thấy FABP có chứa epitope kháng nguyên để phát triển vắc-xin đa chủng chống lại S mansoni Kết phân tích tin sinh học, nhiều epiotpe kháng nguyên kích thích phản ứng sinh miễn dịch hệ thống miễn dịch ký chủ động vật hữu nhũ để sản xuất protein kháng thể bao gồm CTL (Cytotoxic T lymphocyte), MHC-I (Major Histocompatility Conplex –I) (Rahmani & ctv., 2019) Nghiên cứu tập trung vào việc tạo dịng gen, phân tích đặc tính, phân bố mơ dự đốn tế bào B sinh miễn dịch gen FABP S mekongi Điều làm sở cho việc nghiên cứu phát triển vắc-xin chống lại S mekongi giải pháp bền vững để phòng bệnh sán máng tương lai II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Tạo dòng giải trình tự gen FABP Schistosoma mekongi (SmekFABP) Sán máng S mekongi trưởng thành (nguồn sán máng Schistosoma mekongi thuộc chủng Lào cảm nhiễm vào ốc Neotricula aperta chuột chủng ICR, thực the Applied Malacology Unit, Department of Social Medicine and Environment, Faculty of Tropical Medicine, Mahidol University, Bangkok) RNA tổng số tách chiết thuốc thử TRIzol (Molecular Centre, Inc.), thực theo hướng dẫn nhà sản xuất Trình tự cADN phần SmekFABP khuếch đại PCR với mồi bao gồm mồi xuôi (5’-ACT TTA GGC GTT CAG TCA ATC GGA A-3’) mồi ngược (5’-GCA ATG TTT ATT GAA CAA AAG TGA AGC TG-3’) Các mồi thiết kế dựa vào GenBank (FN315763.1) TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ 19 - THÁNG 6/2021 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II S japonicum PCR thực 35 chu kỳ 940C 30 giây, 500C 30 giây 720C 90 giây Sản phẩm PCR gắn vào vector pGEM-T (Promega, Hoa Kỳ) trước giải trình tự 2.2 Xác định đặc tính protein SmekFABP Đặc tính protein SmekFABP xác định công cụ BLAST (http://ww.ncbi.nih.gov/ BLAST) chương trình máy tính Prot Thụy sĩ (https://swissmodel.expasy.org) So sánh độ tương đồng từ loài Schistosoma thực chương trình Clustal Omega (https:// www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo) Phương pháp phân tích Neighbourhood (Saitou & Nei, 1987) thực phần mềm Mega X (Kumar & ctv., 2018) với bootstrap 1.000 lần lặp lại (Felsenstein, 1985) Mô hình 3-D protein FABP dự đốn chương trình I-TASSER (Yang & Zhang, 2015) 2.3 Biểu gen SmekFABP tái tổ hợp (rSmekFABP) Phương pháp thực dựa theo phương pháp mô tả Sripa cộng (2017) Trình tự ADN gen FABP khuếch đại từ cADN sán máng trưởng thành S mekongi cách sử dụng mồi xi có gắn vị trí nhận dạng enzyme cắt giới hạn NdeI đầu 5’ mồi (5’-CATATGGCGACTTT GGGTACTGGGATGA-3’) mồi ngược có gắn vị trí nhận dạng enzyme cắt giới hạn XhoI với đoạn 6-histidine đầu 5’ mồi (5’- CTCGAGTTAATGATGATGATGAT GATGAACATTCTCATATTCTTTTATTTGT CG-3’), với sản phẩm khuếch đại 420 bp Sản phẩm PCR gắn vào vector pET-17b trước biến nạp vào chủng E coli BL21 để biểu protein rSmekFABP Vi khuẩn nuôi cấy mơi trường LB có chứa μg/ml ampicillin ủ 370C OD600 đạt đến 0,6–0,8 Sau cảm ứng IPTG 1mM ủ 300C Protein rSmekFABP thu cách ly giải tế bào vi khuẩn máy tán siêu âm protein tinh phương pháp ly tâm qua cột Ni-NTA 15ml (Qiagen, Đức) Protein rSmekFABP tinh khiết thẩm tách PBS lạnh 2.4 Dự đốn vị trí epitope kháng ngun Các epitope kháng nguyên xác định cách sử dụng số chương trình dự đốn sau: Hopp & Woods (1981); Welling & cộng (1985); HPLC / Parker & cộng (1986); Kolaskar & Tongaonkar (1990); B-EpiPred (Larsen & ctv., 2006) ABCpred (Saha & Raghava, 2006) 2.5 Xác định phân bố SmekFABP mô ký sinh phương pháp lai In Situ Sán máng Schistosoma mekongi trưởng thành cố định môi trường paraformaldehyde 2% 40C 18 Sau đó, mơ xử lý thơng qua q trình xử lý mơ thơng thường trước đúc thành khối parafin Phần mô cắt lát có độ dày mm đính lame có tráng silan Các đoạn mồi xi ngược gen SmekFABP sử dụng để sản xuất mẫu dị có đánh dấu DIGoligonucleotide (Roche, Đức) từ cADN S mekongi Các mẫu dò dùng để lai với mô lame Phản ứng lai ủ 500C 12 Màu hình thành cách sử dụng chất NBT/BCIP Sau lát cắt nhuộm tương phản với màu nâu Bismarck brown Y (Sigma, Mỹ) Các lát cắt làm Xylene che phủ miếng lamen trước quan sát kính hiển vi (Salachan & ctv., 2017) III KẾT QUẢ 3.1 Phân tích gen SmekFABP Kết khuếch đại phương pháp PCR cho thấy trình tự đoạn ADN chứa gen SmekFABP có chiều dài 582 bp (Hình 1) Đoạn trình tự có chứa khung đọc mở mã hóa cho protein FABP có chiều dài 132 axít amin với khối lượng phân tử dự đốn 14,82 kDa (Hình 2) TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 19 - THÁNG 6/2021 47 VIỆN NGHIÊN CỨU NI TRỒNG THỦY SẢN II Hình Sản phẩm khuếch đại PCR đoạn cADN gen SmekFABP Giếng M: thang thị 100 bp; giếng 1-4: đoạn gen SmekFABP có kích thước 582 bp Hình Đoạn trình tự đoạn ADN trình tự axít amin gen SmekFABP Khung đọc mở bao gồm ba mở đầu ATG mã hoá Methionin (M) ba kết thúc TAA khơng mã hố 3.2 So sánh trình tự nucleotide axít amin SmekFABP Tỷ lệ tương đồng trình tự nucleotide axít amin SmekFABP so sánh với loài sán máng khác ký chủ động vật hữu nhũ trình bày Bảng Trong đó, tỷ lệ tương đồng trình tự nucleotide SmekFABP với FABP từ loài sán máng loài Schistosoma bao gồm S japonicum (SjFABP_L23322.1), S mansoni (SmFABP_M60895.1), S haematobium (ShFABP_AB114679.1) S bovis (SbFABP_AY615730.1) 88,7, 63,0, 62,6 57,2% (Bảng 1) Trong khi, tỷ lệ tương đồng trình tự axít amin so sánh 48 protein SmekFABP với proetin FABP S japonicum (SjFABP_AAA64426), S mansoni (Sm14FABP_2POA_A), S haematobium (ShFABP_BAF62288) S bovis (SbFABP_ AAT39384) giảm dần từ 95,4 - 89,4% (Bảng 2) Kết cho thấy độ tương đồng gen protein FABP loài Schistosoma cao, đó, độ tương đồng S mekongi S japonicum cao Kết so sánh SmekFABP với FABP loài sán Fasciola khác bao gồm F hepatica (Fh_AJ250098.1) F gigantica (Fg_U52908.1) có tỷ lệ tương đồng mức độ nucleotide 36,2 - 47,2% (Bảng 1); Trong mức độ axít amin có tỷ lệ tương TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ 19 - THÁNG 6/2021 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II đồng từ 39,3 - 48,4% F hepatica (Fh_ CAB65015) F gigantica (Fg_AAB06722) (Bảng 2) Điều cho thấy tỷ lệ tương đồng gen protein FABP S mekongi với loài sán khác tương đối thấp Kết so sánh SmekFABP với FABP ký chủ động vật hữu nhũ bao gồm chuột (RatFABP_BC086947.1) người (HumanFABP_BC032801.1) có tỷ lệ tương đồng mức độ nucleotide 26,6 - 27,1% (Bảng 1); Trong đó, mức độ axít amin có tỷ lệ tương đồng từ 25,7 - 27,2% chuột (RatFABP_2JU3_A) người (HumanFABP_3STN_A) (Bảng 2) Điều cho thấy tỷ lệ tương đồng gen protein FABP S mekongi với ký chủ động vật hữu nhũ thấp Bảng Tỷ lệ tương đồng trình tự nucleotide gen SmekFABP loài khác Bảng Tỷ lệ tương đồng trình tự axít amin protein SmekFABP loài khác Cây phát sinh loài xây dựng chương trình Bio Edit (Neighborhood 1.000 lần lặp lại) cho thấy SmekFABP nằm nhóm với FABP S japonicum (SjFABP_AAA64426) S japonicum (SjFABP_AAG50052) Cịn lồi S mansoni (Sm14FABP_2POA_A), S haematobium (ShFABP_BAF62288) S bovis (SbFABP_AAT39384) nằm nhóm khác nhánh kế cận phát sinh loài Trong khi, FABP động vật người nằm nhóm khác nhánh xa phân phát sinh lồi (Hình 3) TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 19 - THÁNG 6/2021 49 VIỆN NGHIÊN CỨU NI TRỒNG THỦY SẢN II Hình Cây phát sinh loài xây dựng từ gen FABP (kích thước 396 bp) S mekongi lồi khác SmekFABP nằm nhóm với FABP S Japonicum 3.3 Phân tích cấu trúc thứ cấp protein SmekFABP Cấu trúc thứ cấp protein SmekFABP phân tích chương trình I-TESSER (Zhang, 2008) Kết cho thấy protein có cấu trúc bậc ba phổ biến protein FABP khác, bao gồm 10 đoạn đối song song dạng phiến β đoạn dạng xoắn α, vòng cuộn kết nối đoạn tạo thành sợi peptide (TM-score = 0,91 ± 0,06, RMSD = 1,9 ± 1,6Å) (Hình 4) Hình Mơ hình cấu trúc bậc protein SmekFABP Màu vàng: mười đoạn đối song song dạng phiến β; màu hồng: đoạn dạng xoắn α; màu xanh: vòng cuộn kết nối đoạn tạo thành sợi peptide (TM-score = 0,91 ± 0,06, RMSD = 1,9 ± 1,6Å) 50 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ 19 - THÁNG 6/2021 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II 3.4 Biểu protein SmekFABP tái tổ hợp (rSmekFABP) Protein rSmekFABP biểu tế bào vi khuẩn E coli BL21 tinh cột Ni2+ điều kiện biến tính Kết điện di SDS-PAGE cho thấy vạch rSmekFABP vị trí khoảng 26 kDa vạch mờ khoảng 23 kDa (Hình 5) Trong đó, rSmekFABP sau thẩm tách, kết cho thấy có vạch mờ vị trí khoảng 15,5 kDa (Hình 6) 26 kDa 26 kDa 23 kDa 15,5 kDa Hình Bảng gel điện di SDS-PAGE Hình Bảng gel điện di SDS-PAGE rSmekFABP rSmekFABP sau thẩm tách (M): thang thị; (1): protein trước biểu E coli; (2): protein sau biểu E coli; (3): rSmekFABP tinh (M): thang thị; (1): protein trước biểu E coli; (2): protein sau biểu E coli 3.5 Xác định epitope kháng nguyên SmekFABP Dự đoán vùng epitope kháng nguyên bề mặt protein bước cần thiết để thiết kế vắc-xin dựa vào đoạn peptide có khả sinh miễn dịch Kết phân tích cho thấy vùng ưa nước protein SmekFABP có khả sinh miễn dịch bề mặt Một đoạn 87-DSESKITQTQKDAKN-101 nằm vùng phiến 𝛽 protein tìm thấy chương trình phân tích (Hopp & Woods; Welling, Parker, B-EpiPred ABCpred) (Bảng 3) Bảng Các vùng ưa nước tiềm vị trí dự đốn epitope sinh miễn dịch từ chương trình phân tích khác Hopp & Woods 9-11,13-16,18 Welling & al 6-7,9-15,18 26 47,49-51,55,5758 65,67-104 108-112,114-119 61-62,77 80,8285,87,90,94101 119 121, 126-128 Parker & al Kolaskar & Tangaokar B-Epipred ABCpred 9-22 13 30-39,4116-28 23-38 45 25-59 47 58-65 69-79 61-76 65-105 109-128 80-87 102-109,117-126 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ 19 - THÁNG 6/2021 87-101 88-103 115-120 51 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II 3.6 Sự phân bố FABP mô Schistosoma mekongi kỹ thuật lai In Situ Các mặt cắt dọc parafin S mekongi trưởng thành lai với mẫu dò ARN SmekFABP Các tín hiệu lai dương tính (tế bào bắt màu nâu thuốc nhuộm) phát tế bào biểu mô nhu mô manh tràng Trong đó, tế bào biểu mơ lame đối chứng khơng lai với mẫu dị khơng bắt màu nâu thuốc nhuộm (Hình 7) Kết cho thấy mARN gen SmekFABP diện biểu mô nhu mô manh tràng sán máng Hình Các mặt cắt dọc S mekongi giai đoạn trưởng thành lai với mẫu dò ARN SmekFABP (A): lame đối chứng khơng dùng mẫu dị, tế bào không bắt màu nâu thuốc nhuộm (B, C D): Các lame lai với mẫu dị cho thấy tế bào nhu mơ (Pc) tế bào biểu mô (Teg) manh tràng (Cae) bắt màu nâu thuốc nhuộm Bismarck brown Y Thanh tỷ lệ 50 μm IV THẢO LUẬN Kết so sánh trình tự nucleotide axít amin chương trình Omega Clastal BioEdit cho thấy trình tự axít amin FABP Schistosoma mekongi (SmekFABP) có tỷ lệ tương đồng mức độ cao với loài sán máng giống Stristosoma Trình tự axít amin SmekFABP có tỷ lệ tương đồng cao so sánh với S japonicum (GenBank: AAA64426) 95,4% với loài S mansoni S haematobium 91,7 90,2% 52 Điều cho thấy FABP S mekongi S japonicum có chung nguồn gốc Đặc tính sinh miễn dịch phân tử FABP từ S japonicum báo cáo có khả bảo vệ chống lại lây nhiễm S japonicum thơng qua thí nghiệm gây nhiễm (Tu & ctv., 2014; Wei & ctv., 2009) Vì vậy, phân tử SmekFABP dùng phát triển vắc-xin chống lại nhiễm trùng S mekongi Ngược lại, độ tương đồng trình tự axít amin SmekFABP ký chủ động vật hữu nhũ cho tỷ lệ thấp, dao TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ 19 - THÁNG 6/2021 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II động từ 25-27,2% Ngoài ra, kết phân tích phát sinh lồi cho thấy SmekFABP có mối quan hệ tiến hóa xa với lồi ký chủ động vật hữu nhũ Điều làm sở tốt để sử dụng SmekFABP phát triển vắc-xin chống lại nhiễm trùng S mekongi mà không bị ảnh hưởng đến protein FABP ký chủ động vật hữu nhũ trình sinh miễn dịch tiêm chủng Sự dung hợp protein SmekFABP tái tổ hợp (rSmekFABP) với đoạn axít amin histidine (6-histidine) tạo tế bào vi khuẩn sau cảm ứng với IPTG 1mM Kết phân tích gel SDS-PAGE nhuộm màu xanh Coomassie protein rSmekFABP tinh xuất băng (vạch) vị trí có trọng lượng phân tử khoảng 26 kDa vạch mờ vị trí có trọng lượng phân tử khoảng 23 kDa 15,5 kDa, trọng lượng phân tử dự đoán protein rSmekFABP với đoạn 6histidine 15,64 kDa Theo báo cáo trước đây, protein FABP có trọng lượng phân tử từ 13-15 kDa (Sripa & ctv., 2017) Trong nghiên cứu này, vạch có trọng lượng phân tử 26 kDa, điều tiên đoán rSmekFABP tạo thành protein phức hợp dạng đơn vị (dimer) Trong vạch mờ có trọng lượng phân tử 15,5 kDa rSmekFABP dạng đơn (monomer) Việc tiêm vắc-xin phòng bệnh sán máng chiến lược để loại trừ tiêu diệt tận gốc bệnh sán máng Nó sử dụng đơn kết hợp với thuốc tẩy giun sán để giảm tái nhiễm khu vực diễn bệnh Protein FABP sáu ứng cử viên chọn để phát triển vắc-xin WHO chống lại bệnh sán máng (Bergquist, 1995) Nghiên cứu này, chúng tơi dự đốn epitope kháng ngun phân tử protein SmekFABP cách sử dụng công cụ tin sinh học Kết cho thấy vùng 87-DSESKITQTQKDAKN-101 tìm chương trình tin sinh học (Hopp & Woods; Welling, Parker, B-EpiPred ABCpred), đoạn peptide 88 -SESKITQ-94 tương tự có peptide FABP S mansoni (EKNSESKLTQ) chứng minh trình tự có khả bảo vệ kép chống lại lây nhiễm S mansoni (sm14) Fasciola hepatica (Fh15) (Vilar & ctv., 2003) Đoạn peptide nghiên cứu có phần (93-TQTQKDAKN-100) tương đồng với đoạn peptide “TQTQVDPKNI” FABP S mansoni phát triển thành vắc-xin kết hợp đa peptide (polypeptide) trở thành vị trí sinh miễn dịch CTL (Cytotoxic T lymphocyte), MHC-I (Major Histocompatility Conplex –I) hệ thống miễn dịch ký chủ động vật hữu nhũ Vì vậy, đoạn peptide “87-DSESKITQTQKDAKN-101” SmekFABP sử dụng để phát triển vắc-xin chống lại nhiễm trùng S mekongi Fasciola spp mơ hình động vật tương lai Nghiên cứu chứng minh SmekFABP có diện tế bào biểu mô nhu mô giun đực trưởng thành Phát tương tự kết Gobert cộng (1997), nghiên cứu protein FABP S japonicum (Sj-FABP) Họ phát Sj-FABP khu trú tế bào nhu mô giọt lipid bên vùng biểu bì ký sinh trùng đực Brito cộng (2002) chứng minh protein FABP 14 kDa S mansoni (Sm14) khu trú mô gần bề mặt tiếp xúc ký sinh trùng vật chủ Điều cho thấy FABP đóng vai trị quan trọng việc vận chuyển axit béo, chưa rõ liệu hấp thu xảy thông qua mơ hay ruột hai mơ liên quan đến hấp thu axít béo (Brito & ctv., 2002) Hockley McLaren (1973) chứng minh axít béo hấp thụ S mansoni thực tế bào biểu mô lưu trữ ruột tuyến thực quản Trong nghiên cứu Sirisriro cộng (2002) sử dụng kỹ thuật immunoperoxidase để nghiên cứu phân bố TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 19 - THÁNG 6/2021 53 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II FABP F gigantica, kết cho thấy nồng độ protein diện cao mô nhu mô, tế bào nhu mơ dường có số lượng FABP khác V KẾT LUẬN 5.1 Kết luận Từ kết trên, nghiên cứu ghi nhận số kết luận sau: Trình tự ADN SmekFABP tạo dịng có kích thước 582 bp chứa khung đọc mở mã hóa protein FABP 132 axít amin trình tự có tương đồng cao với FABP từ Schistosome spp (57,2 - 88,7% nucleotide 89,4% 95,4% trình tự axít amin) Fasciola spp (36,2 - 47,5% trình tự nucleotide 39,3-48,4% trình tự axít amin) Ngồi ra, epitope kháng ngun có khả sinh miễn dịch dự đốn chương trình tin sinh học đoạn peptide nằm vị trí 87-DSESKITQTQKDAKN-101 Một phát ghi nhận nghiên cứu ARN thơng tin (mARN) SmekFABP có diện tế bào biểu mô nhu mô giun sán trưởng thành 5.2 Đề xuất - Sử dụng protein SmekFABP để phát triển vắc-xin phòng bệnh nhiễm S mekongi - Phát triển phương pháp chuẩn đoán kỹ thuật ELISA để phát kháng nguyên nhiễm giai đoạn sớm để giúp việc phòng bệnh nhiễm giun sán tốt LỜI CẢM ƠN Đề tài hỗ trợ Chương trình học bổng sau đại học quốc tế Thái Lan “Thạc sĩ Khoa học Sinh học cho Nông Nghiệp Bền Vững” thuộc Cơ quan Hợp tác Quốc tế Thái Lan (TICA) - Chính phủ Thái Lan TÀI LIỆU THAM KHẢO Bennett, M., & Caulfield, J., (1991) Specific binding of human low-density lipoprotein to the surface of schistosomula of Schistosoma mansoni and ingestion by the parasite The American journal of pathology, 138(5), 1173 54 Bergquist, N., (1995) Schistosomiasis vaccine development: approaches and prospects Mem Inst Oswaldo Cruz, 221-227 Brito, Oliveira, G., Oliveira, S., Street, M., Riengrojpitak, S., Wilson, R., Simpson, A., & Correa-Oliveira, R., (2002) Sm14 gene expression in different stages of the Schistosoma mansoni life cycle and immunolocalization of the Sm14 protein within the adult worm Brazilian journal of medical and biological research, 35(3), 377-381 Cupit, P M., & Cunningham, C., (2015) What is the mechanism of action of praziquantel and how might resistance strike? Future medicinal chemistry, 7(6), 701-705 Felsenstein, J., (1985) Confidence limits on phylogenies: an approach using the bootstrap evolution, 39(4), 783-791 Fonseca, C T., Braz Figueiredo Carvalho, G., Carvalho Alves, C., & de Melo, T T., (2012) Schistosoma tegument proteins in vaccine and diagnosis development: an update Journal of parasitology research, 2012 Gobert, G., Stenzel, D., Jones, M., & McManus, D., (1997) Immunolocalization of the fatty acid-binding protein Sj-FABPc within adult Schistosoma japonicum Parasitology, 115(1), 33-39 Gordon, C A., Kurscheid, J., Williams, G M., Clements, A C., Li, Y., Zhou, X.-N., Utzinger, J., McManus, D P., & Gray, D J., (2019) Asian schistosomiasis: current status and prospects for control leading to elimination Tropical medicine and infectious disease, 4(1), 40 Hockley, D J., & McLaren, D J., (1973) Schistosoma mansoni: changes in the outer membrane of the tegument during development from cercaria to adult worm International journal for parasitology, 3(1), 13-20 Hopp, T P., & Woods, K R (1981) Prediction of protein antigenic determinants from amino acid sequences Proceedings of the National Academy of Sciences, 78(6), 3824-3828 Knopp, S., Person, B., Ame, S M., Mohammed, K A., Ali, S M., Khamis, I S., Rabone, M., Allan, F., Gouvras, A., & Blair, L., (2013) Elimination of schistosomiasis transmission in Zanzibar: baseline findings before the onset of a randomized intervention trial PLoS Negl Trop Dis, 7(10), e2474 Kolaskar, A., & Tongaonkar, P C., (1990) A semi‐ TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ 19 - THÁNG 6/2021 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II empirical method for prediction of antigenic determinants on protein antigens FEBS letters, 276(1-2), 172-174 Kumar, S., Stecher, G., Li, M., Knyaz, C., & Tamura, K., (2018) MEGA X: molecular evolutionary genetics analysis across computing platforms Molecular biology and evolution, 35(6), 15471549 Larsen, J E P., Lund, O., & Nielsen, M., (2006) Improved method for predicting linear B-cell epitopes Immunome research, 2(1), 1-7 Mohamed, I., Kinung’hi, S., Mwinzi, P N., Onkanga, I O., Andiego, K., Muchiri, G., Odiere, M R., Vennervald, B J., & Olsen, A., (2018) Diet and hygiene practices influence morbidity in schoolchildren living in Schistosomiasis endemic areas along Lake Victoria in Kenya and Tanzania—A cross-sectional study PLoS neglected tropical diseases, 12(3), e0006373 Othman, A A., & Soliman, R H., (2015) Schistosomiasis in Egypt: A never-ending story? Acta tropica, 148, 179-190 Parker, J., Guo, D., & Hodges, R., (1986) New hydrophilicity scale derived from highperformance liquid chromatography peptide retention data: correlation of predicted surface residues with antigenicity and X-ray-derived accessible sites Biochemistry, 25(19), 54255432 Rahmani, A., Baee, M., Rostamtabar, M., Karkhah, A., Alizadeh, S., Tourani, M., & Nouri, H R., (2019) Development of a conserved chimeric vaccine based on helper T-cell and CTL epitopes for induction of strong immune response against Schistosoma mansoni using immunoinformatics approaches International journal of biological macromolecules, 141, 125-136 Roy, A., Kucukural, A., & Zhang, Y., (2010) I-TASSER: a unified platform for automated protein structure and function prediction Nature protocols, 5(4), 725-738 Saha, S., & Raghava, G P S., (2006) Prediction of continuous B‐cell epitopes in an antigen using recurrent neural network Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics, 65(1), 40-48 Salachan, P,V., Jaroenlak, P., Thitamadee, S., Itsathitphaisarn, O., Sritunyalucksana, K., (2017) Laboratory cohabitation challenge model for shrimp hepatopancreatic microsporidiosis (HPM) caused by Enterocytozoon hepatopenaei (EHP) BMC Vet Res; 13(1):9 Saitou, N., & Nei, M., (1987) The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees Molecular biology and evolution, 4(4), 406- 425 Santos, F K d., (2011) Desenvolvimento e caracterização de carreadores lipídicos nanoestruturados contendo praziquantel Sirisriro, A., Grams, R., Vichasri-Grams, S., Ardseungneon, P., Pankao, V., Meepool, A., Chaithirayanon, K., Viyanant, V., Tan-Ariya, P., & Upatham, E., (2002) Production and characterization of a monoclonal antibody against recombinant fatty acid binding protein of Fasciola gigantica Veterinary parasitology, 105(2), 119-129 Sornmani, S., Kitikoon, V., Harinasuta, C., & Pathammavong, O., (1971) Epidemiological study of Schistosomiasis japonica on Khong Island, southern Laos South East Asian Journal of Tropical Medicine and Public Health, 2(3), 365-374 Sripa, J., Laha, T., & Sripa, B., (2017) Characterization and functional analysis of fatty acid binding protein from the carcinogenic liver fluke, Opisthorchis viverrini Parasitology international, 66(4), 419-425 Thétiot‐Laurent, S A L., Boissier, J., Robert, A., & Meunier, B., (2013) Schistosomiasis chemotherapy Angewandte Chemie International Edition, 52(31), 7936-7956 Vale, N., Gouveia, M J., Rinaldi, G., Brindley, P J., Gärtner, F., & da Costa, J M C., (2017) Praziquantel for schistosomiasis: singledrug metabolism revisited, mode of action, and resistance Antimicrobial agents and chemotherapy, 61(5) Voge, M., Bruckner, D., & Bruce, J I., (1978) Schistosoma mekongi sp n from man and animals, compared with four geographic strains of Schistosoma japonicum The Journal of parasitology, 577-584 Waghmare, S., & Chavan, R., (2012) Prediction of Major Histocompatibility Complex Binding Peptides and Epitopes from Fatty-Acid-Binding Protein of the Human Blood Fluke Schistosoma Japonicum Metabolomics, 2(113), 21530769.1000113 Webster, B L., Diaw, O T., Seye, M M., Faye, D S., Stothard, J R., Sousa- Figueiredo, J C., & Rollinson, D., (2013) Praziquantel treatment of school children from single and mixed infection TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ 19 - THÁNG 6/2021 55 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II foci of intestinal and urogenital schistosomiasis along the Senegal River Basin: monitoring treatment success and re-infection patterns Acta tropica, 128(2), 292-302 Welling, G W., Weijer, W J., van der Zee, R., & Welling-Wester, S., (1985) Prediction of sequential antigenic regions in proteins FEBS letters, 188(2), 215-218 Wu, Z., Shaoji, Z., Pan, B., Hu, L., Wei, R., Gao, Z., Li, J., & Uwe, B., (1994) Reinfection with 56 Schistosoma japonicum after treatment with praziquantel in Poyang lake region, China The Southeast Asian journal of tropical medicine and public health, 25(1), 163-169 Yang, J., & Zhang, Y., (2015) I-TASSER server: new development for protein structure and function predictions Nucleic acids research, 43(W1), W174-W181 Zhang, Y (2008) I-TASSER server for protein 3D structure prediction BMC bioinformatics, 9(1), 40 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ 19 - THÁNG 6/2021 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II MOLECULAR CHARACTERIZATION AND TISSUE DISTRIBUTION OF FABP (FATTY ACID BINDING PROTEIN) IN SCHISTOSOMA MEKONGI Hong Thi Cam Do1*, Wanwisa Peonsamut2, Manaw Sangfuang2, Yanin Limpanont3, Charoonroj Chotwiwattanakun4, Prasert Sobhon5, Narin Preyavichyapugdee2 ABSTRACT Fatty acid-binding protein (FABP) belongs to a large family of intracellular lipid-binding proteins It has a low molecular weight (14-15 kDa) and plays a functional role in the synthesis of the outer cell membrane that is continually shedding off It is one of the six candidate vaccine antigens that was selected by the WHO to study against schistosomiasis, with various degrees of therapeutic effects The cDNA encoding SmekFABP of adult Schistosoma mekongi was cloned and sequenced The nucleotide sequence of SmekFABP was 582 bp in length The nucleotide sequence of SmekFABP showed an open reading frame encoding FABP containing 132 amino acids The SmekFABP amino acid sequences showed the highest degree of identity with the S japonicum (GenBank: AAA64426) at 95.4% The identity of SmekFABP amino acid sequences with other schistosomes (S mansoni, and S haematobium showed at 91.7 and 90.2 respectively The expected molecular weight of rSmekFABP determined from its constituent amino acids is 14.82 kDa and the predicted molecular weight of rSmekFABP protein with histidine tag is 15.5 kDa In this study, we got one major band at 26 kDa, that could be rSmekFABP that form a complex protein and the faint band that was 15.5 kDa, which is possible to be the rSmekFABP A high degree of similarity and identity of S mekongi with S japonicum FABP in both nucleic and amino acid, and similarity in localization of worm tissue, indicates that they share a common ancestor The low degree of conservation observed from amino acid sequences of mammalian hosts could reveal its applicable for using as the vaccine candidate against the schistosome infection which may not interfere with the host’s FABP molecule during the vaccination Based on bioinformatic approach, one immunogenic epitope was predicted by five programs (Hopp & Woods; Welling, Parker, B-EpiRred and ABCpred), it was 87-DSESKITQTQKDAKN-101, According to previous researches, this peptide fragment has a potential immunogenic to CTL (Cytotoxic T lymphocyte) and Major Histocompatibility Complex – I (MHC-I) in immune system of mammalian’s host Keywords: FABP, Schistosoma mekongi, immunogenic, vaccination, CTL, MHC-I (Major Histocompatibility Complex –I) Người phản biện: TS Ngô Huỳnh Phương Thảo Người phản biện: TS Lê Hồng Phước Ngày nhận bài: 28/5/2021 Ngày nhận bài: 28/5/2021 Ngày thông qua phản biện: 15/6/2021 Ngày thông qua phản biện: 10/6/2021 Ngày duyệt đăng: 25/6/2021 Ngày duyệt đăng: 25/6/2021 Research Institute for Aquaculture No Silpakorn University, Phetchaburi - Thailand Applied Malacology Unit, Faculty of Tropical Medicine, Mahidol University, Bangkok, Thailand Mahidol University, Nakhonsawan Campus, Nakhonsawan, Thailand Department of Anatomy, Faculty of Science, Mahidol University, Bangkok, Thailand * Email: camhong573@gmail.com TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ 19 - THÁNG 6/2021 57 ... phòng bệnh sán máng tương lai II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Tạo dòng giải trình tự gen FABP Schistosoma mekongi (SmekFABP) Sán máng S mekongi trưởng thành (nguồn sán máng Schistosoma mekongi... cứu tập trung vào việc tạo dịng gen, phân tích đặc tính, phân bố mơ dự đốn tế bào B sinh miễn dịch gen FABP S mekongi Điều làm sở cho việc nghiên cứu phát triển vắc-xin chống lại S mekongi giải... ABCpred (Saha & Raghava, 2006) 2.5 Xác định phân bố SmekFABP mô ký sinh phương pháp lai In Situ Sán máng Schistosoma mekongi trưởng thành cố định môi trường paraformaldehyde 2% 40C 18 Sau đó,