Kết quả bước đầu phát triển bộ chỉ thị microsatellite mới từ hệ gen cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) bằng công cụ tin sinh học

Cá Tra (Pangasianodon hypophthalmus, Sauvage 1878) là một trong những đối tượng xuất khẩu chủ lực của ngành thủy sản ở Việt Nam. Các nghiên cứu trước đây đã phát triển thành công một số bộ chỉ thị microsatellite trên cá Tra và các loài khác thuộc họ Pangasiidae bằng các phương pháp truyền thống.

VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II KẾT QUẢ BƯỚC ĐẦU PHÁT TRIỂN BỘ CHỈ THỊ MICROSATELLITE MỚI TỪ HỆ GEN CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus) BẰNG CÔNG CỤ TIN SINH HỌC Nguyễn Văn Sáng1, Nguyễn Minh Thành2, Võ Hồng Lộc1, Nguyễn Hồng Thơng1, Lê Hồng Khơi Ngun2* TĨM TẮT Cá Tra (Pangasianodon hypophthalmus, Sauvage 1878) đối tượng xuất chủ lực ngành thủy sản Việt Nam Các nghiên cứu trước phát triển thành công số thị microsatellite cá Tra loài khác thuộc họ Pangasiidae phương pháp truyền thống Tuy nhiên, ứng dụng microsatellite chưa thỏa mãn yêu cầu cơng tác chọn giống cá Tra Vì vậy, nghiên cứu phát triển multiplex PCR gồm 10 thị microsatellite dựa hệ gen cá Tra công bố vào năm 2018 Kết phân tích 30 mẫu cá Tra cho thấy số lượng alen (NA) dao động từ đến 11 locus Hệ số đa dạng di truyền (PIC) trung bình, tỷ lệ dị hợp tử thực tế (HO) trung bình tỷ lệ dị hợp tử lý thuyết (HE) trung bình tất locus 0,729; 0,755 0,711 Mười thị microsatellite không cho thấy sai khác với cân Hardy-Weinberg (HWE) sau hiệu chỉnh Bonferroni Kết cho thấy thị microstellite phát triển có độ đa hình cao có tiềm phục vụ cho mục đích chọn giống lâu dài cá Tra Từ khóa: thị microsatellite, đa dạng di truyền, multiplex PCR, Pangasianodon hypophthalmus I MỞ ĐẦU Nghề nuôi cá Tra (Pangasianodon hypophthalmus, Sauvage 1878) phổ biến vùng Đồng sông Cửu Long từ năm 1960 trở thành đối tượng cho phát triển nuôi trông thủy sản nhờ hệ thủy sinh đặc thù khu vực (Phan ctv., 2009) Riêng Việt Nam, cá Tra loài xuất chủ lực với tổng giá trị xuất năm 2019 đạt tỷ USA Năm 2001, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II (RIA2) tiến hành chương trình chọn giống cá Tra nhằm nâng cao tính trạng tăng trưởng kháng bệnh cá Tra, góp phần phát triển bền vững nghề ni cá Tra Chương trình thành cơng nâng cao tốc độ tăng trưởng đạt 13% hệ (Nguyen ctv., 2012) Tuy nhiên, thách thức chương trình chọn giống xây dựng thơng tin phả hệ nhằm ước tính xác thơng số di truyền kiểm sốt cận huyết nhằm nâng cao hiệu chọn giống (Liu ctv., 2018) Microsatellite đoạn ADN ngắn chứa motif (từ đến bp) lặp lại nhiều lần (Kelkar ctv., 2010) Bởi microsatellite có tính đa hình cao phổ biến hệ gen hầu hết loài sinh vật nhân thực, thị thường ứng dụng nghiên cứu định danh loài, di truyền học quần thể, đồ di truyền truy xuất phả hệ (Mittal & Dubey, 2009; Miah ctv., 2013) Trước đây, số cơng trình phát triển thị microsatellite cho P hypophthalmus (Volckaert ctv., 1999; Viện Nghiện cứu Nuôi trồng Thủy sản II Khoa Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Quốc tế - ĐHQG Tp HCM * Email: lhknguyen98@gmail.com 14 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ 18 - THÁNG 12/2020 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II Nguyễn Văn Sáng ctv., 2013) loài thuộc họ Pangasiidae (Hogan May, 2002; Na-Nakorn ctv., 2006) Tại thời điểm đó, trình tự hệ gen cá Tra chưa công bố nên tất thị phát triển phương pháp truyền thống gồm bước xây dựng thư viện hệ gen, xác định microsatellite lai phân tử giải trình tự để xác định vùng thiết kế mồi (Zane ctv., 2002) Phương pháp nhiều thời gian chi phí với hiệu phát triển microsatellite thấp (Abdelkrim ctv., 2009) Các thị không phát triển thành multiplex gây bất tiện cho việc xác định alen xử lý số liệu (Guichoux ctv., 2011) Cho đến năm 2019, tổng cộng thị phát triển từ nghiên cứu trước tối ưu thành hai multiplex PCR để phục vụ cho truy xuất phả hệ (Nguyen ctv., 2019) Các thị microsatellite trước sử dụng nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền quần thể cá Tra (Ha ctv., 2009; Na-Nakorn ctv., 2009; Trần Thị Phương Dung ctv., 2020; Bùi Thị Liên Hà ctv., 2016) truy xuất phả hệ phục vụ cho chọn giống cá Tra (Bùi Thị Liên Hà ctv., 2017; Nguyen ctv., 2019) Với trình tự hệ gen cá Tra công bố vào năm 2018 (Kim ctv., 2018), microsatellite xác định nhanh chóng cơng cụ tin sinh học Các mồi thiết kế để hoạt động điều kiện PCR đồng nhằm phát triển phản ứng multiplex PCR Trong nghiên cứu này, để khắc phục khuyết điểm phương pháp phát triển thị microsatellite truyền thống, thị microsatellite phát triển theo phương pháp đại dựa hệ gen cá Tra công bố Các thơng số di truyền tính tốn để đánh giá sơ mức độ đa hình thị, từ cho thấy tiềm ứng dụng nghiên cứu đa dạng di truyền quần đàn truy xuất phả hệ, phục vụ cho mục đích chọn giống lâu dài cá Tra II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Thu mẫu ly trích ADN Mẫu cá Tra sử dụng nghiên cứu có nguồn gốc từ tự nhiên theo quần đàn: quần đàn (10 cá thể) thu thập từ biển Hồ, Campuchia; quần đàn (10 cá thể) từ trại giống Đồng sông Cửu Long, thu thập từ cá bột cá trưởng thành từ tự nhiên; quần đàn (10 cá thể) từ thác Kratie, Campuchia Tất mẫu cá thuộc Chương trình chọn giống cá Tra thực Trung tâm Quốc gia Giống Thủy sản Nước Nam Bộ, Cái Bè, Tiền Giang (trực thuộc Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thuỷ sản II) Các mẫu vây ngực thu thập ngâm ethanol 80% bảo quản nhiệt độ -20°C Phương pháp kết tủa muối (Gaaib ctv., 2011) sử dụng để ly trích ADN (có điều chỉnh để phù hợp với điều kiện RIA2) Mẫu mô vây sau cắt nhỏ ủ 500 µl dung dịch ly trích SDS 2% có chứa 10 µl Proteinase K (Bioline) nhiệt độ 55°C Sau bổ sung 250 µl NaCl 5M, mẫu ủ 4°C 15 phút ly tâm 13.000 vòng/ phút 15 phút Chuyển tiếp 300 µl dịch nổi, bổ sung ml ethanol 90% giữ mẫu 4°C 15 phút Kết tủa thu sau ly tâm 10.000 vòng 15 phút Tiếp tục bổ sung 500 µl ethanol 70%, ly tâm 10.000 vòng/ phút 15 phút thu kết tủa ADN Mẫu ADN làm khô bảo quản 100 µl nước cất khơng chứa nuclease Chất lượng ADN kiểm tra gel agrarose 1%, ADN không đứt gãy hay lẫn tạp đủ tiêu chuẩn để thực phản ứng PCR Ngoài ra, nồng độ ADN đo máy quang phổ (Genova Nano Micro-volume Life Science™, Jenway, Anh) điều chỉnh thành 100 ng/µl 2.2 Xác định thị microsatellite Trình tự hệ gen cá Tra (VN_pangasius) thu thập từ sở liệu NCBI (GenBank TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ 18 - THÁNG 12/2020 15 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II assembly accession: GCA_003671635.1) dạng 29 scaffold tương ứng với 29 nhiễm sắc thể (NST) giả định (Bảng 1) Vì NST giả định xây dựng với nhiều scaffold (Kim ctv., 2018), ưu tiên lựa chọn scaffold xa vùng tâm động có chứa gen định danh liên quan đến tăng trưởng cá Tra Trên scaffold, thị microsatellite (các motif ADN từ đến nucleotide) xác định công cụ Phobos (Mayer & Christoph, 2006-2010) phần mềm Geneious Prime 2020.0.5 Các microsatellite có chứa motif 10 lần lặp lại lựa chọn để phát triển mồi Những cặp mồi khuếch đại microsatellitte thiết kế thông số mặc định phần mềm Geneious Prime 2020.0.5 với nhiệt độ bắt cặp tối ưu 55°C độ dài mồi từ 18 đến 24 bp Độ dài sản phẩm PCR mong muốn nằm khoảng từ 100 dến 400 bp 2.3 Kiểm định mồi đánh giá thị microsatellite Để sàn lọc nhanh, cặp mồi kiểm định cá thể, cá thể từ quần đàn Phản ứng PCR thực với tổng thể tích 10 µl bao gồm 1,0 µl ADN khn (100 ng/µl), 8,8 µl BIOTAQ Master Mix (Bioline), 0,1 µM mồi xi mồi ngược Điều kiện phản ứng PCR sau: 94°C phút, 35 chu kì bao gồm 94°C 30 giây, 55°C 30 giây, 72°C 60 giây, giai đoạn kéo dài cuối 72°C 10 phút Sản phẩm PCR nhuộm với GelRed (Biotium) điện di gel agarose 4% 200 V (6.7 V/ cm) Các mồi cho sản phẩm PCR đặc hiệu (sản phẩm nằm khoảng thiết kế từ 100 đến 400 bp, có tối đa vạch thể cá thể dị hợp) đa hình (ít mẫu cá thể có dị hợp tử locus tương ứng) lựa chọn cho bước phát triển Bảng Các scaffold (Sc) NST giả định tương ứng lựa chọn để thiết kế mồi* NST Scaffold NST Scaffold NST Scaffold Số Sc62 Số 11 Sc46 Số 21 Sc26 Số Sc68 Số 12 Sc66 Số 22 Sc20 Số Sc31 Số 13 Sc61 Số 23 Sc29 Số Sc15 Số 14 Sc56 Số 24 Sc18 Số Sc47 Số 15 Sc09 Số 25 Sc42 Số Sc55 Số 16 Sc40 Số 26 Sc21 Số Sc58 Số 17 Sc39 Số 27 Sc63 Số Sc07 Số 18 Sc30 Số 28 Sc10 Số Sc24 Số 19 Sc70 Số 29 Sc45 Số 10 Sc71 Số 20 Sc34 * Dữ liệu thu thập NCBI, công bố Kim ctv., (2018) 16 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ 18 - THÁNG 12/2020 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ 18 - THÁNG 12/2020 Số Số Số Số Số 16 Số 19 Số 21 Số 23 Số 25 Pahy-02 Pahy-03 Pahy-04 Pahy-06 Pahy-10 Pahy-13 Pahy-15 Pahy-17 Pahy-18 R:   TGTGAGCTCATCCTCCCTCA CTTCGACTTCCAAGGCACCT GATGCTGCCAGACACTGAGT R: F: GCGCTGATGTGCTTTTATACTGA GGGACTCTGTGGAGCGTAAC R: F: ACCCTCTGTGGTGTCCTTCA TGCTTTCCCATGATGCACCT R: F: CACGCTGAGTGTGAAATGCC TATGGCTATGGCTGCTGAGC R: F: TCTTGAACACGTGGAGGAGC GTAACCGTTTCTGGGGCTCA R: F: TGAAGCGTGGAGAGAAGCTG CGTTGTGTGCCCTCAAAGTG R: F: TCAGTGCACGTCTTACCCAC TCCCGATGCCAGAGAACCTA R: F: AGGTGAAAATCCCCGAGCAG CAGACAGTTTCCCTGGTGGT R: F: AGCGTTTCTTATCCCGCCTC GTTGCAGGAAAACACCACGG R: F: GCACGTTTCACCTCCATCCA Trình tự mồi (5’-3’) F: (GT)20 (AC)17 (AC)20 (AC)17 (TC)20 (AC)20 (GT)15 (TG)23 (TG)24 (TCA)11 Motif* F: mồi xuôi, R: mồi ngược *Cách ký hiệu: (Loại motif) Số lần lặp lại   Số Pahy-01   NST Chỉ thị   VIC PET VIC 6FAM NED NED 6FAM VIC PET 6FAM Loại huỳnh quang   0,2 0,2 0,4 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,4 0,2 Nồng độ mồi tối ưu (µM) Bảng Thơng tin 10 thị microsatellite phát triển từ trình tự hệ gen cá Tra P hypophthalmus VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II 17 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II Những mồi xuôi microsatellite cho kết đặc hiệu đa hình gel agarose đánh dấu huỳnh quang đuôi 5’ (Life Technologies) Mồi xuôi từ cặp mồi lựa chọn phải cho sản phẩm PCR có kích thước phù hợp: khoảng cách hai sản phẩm PCR có màu huỳnh quang cách 50 bp để khơng bị trùng lặp phân tích đoạn ADN phản ứng multiplex Phản ứng singleplex PCR cặp mồi khuếch đại thị tối ưu cá thể Mỗi 10 µl phản ứng bao gồm 1,0 µl ADN khn (5 ng/ µl), µl Multiplex PCR Master Mix (QIAGEN Multiplex PCR Kit™), 0,2 μM hỗn hợp mồi (gồm 0,1 μM mồi xi 0,1 μM mồi ngược) 3,8 µl nước cất không chứa nuclease Điều kiện phản ứng PCR sau: 95°C 15 phút, 30 chu kỳ bao gồm 95°C 30 giây, 55°C 90 giây, 72°C 60 giây, giai đoạn kéo dài cuối 60°C 30 phút Sản phẩm PCR phân tích đoạn ADN hệ thống điện di mao quản 3500 Genetic Analyzer (Applied Biosystems) Công ty TNHH Dịch Vụ Và Thương Mại Nam Khoa (Quận 7, Thành phố Hồ Chí Minh) Thiết bị xác định alen nhiều locus microsatellite với độ xác lên đến base (Butler ctv., 2004) Xác định alen thực phần mềm GeneMapper (Applied Biosystems) Các mồi sau tối ưu phản ứng singleplex PCR, nhóm lại thành multiplex PCR Các thông số di truyền số lượng alen (NA), hệ số đa dạng di truyền (PIC), tỷ lệ dị hợp tử thực tế (HO), tỷ lệ dị hợp tử lý thuyết (HE) mức độ sai khác so với cân Hardy-Weinberg (HWE) tính tốn phần mềm Cervus 3.0.7 (Marshall ctv., 1998) để đánh giá thị multiplex PCR phát triển 30 cá thể cá Tra (10 cá thể/quần đàn) III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Từ 29 scaffold với tổng kích thước 226,9 Mb thu nhận từ NCBI, nghiên cứu xác định 47,499 thị microsatellite lựa chọn ngẫu nhiên 145 thị (5 thị/scaffold) để phát triển mồi Kết kiểm định mồi cá thể cho thấy 63 thị (43,5%) có sản phẩm đặc hiệu đa hình Các cặp mồi có kích thước sản phẩm PCR phù hợp phân bố scaffold khác (tương ứng với nhiễm sắc thể khác nhau) lựa chọn để phát triển thành multiplex PCR gồm mười thị (Bảng 2, xem trang 17) Bảng Kết phân tích microsatellite từ phản ứng multiplex PCR gồm 10 thị Chỉ thị NA Pahy-01 Pahy-02 Pahy-03 Pahy-04 Pahy-06 Pahy-10 Pahy-13 Pahy-15 Pahy-17 Pahy-18 Trung bình 11 10 8 11 11 8,7 Vùng kích thước alen (bp) 104 - 119 286 - 317 204 - 232 271 - 291 304 - 324 216 - 226 194 - 206 308 - 338 205 - 223 114 - 136   HO HE PIC PHWE 0,733 0,533 0,867 0,867 0,800 0,600 0,800 0,677 0,677 0,733 0,729 0,775 0,766 0,821 0,872 0,731 0,538 0,773 0,741 0,753 0,775 0,755 0,725 0,734 0,784 0,841 0,672 0,488 0,731 0,689 0,710 0,731 0,711 0,799 0,216 0,095 0,413 0,328 0,343 0,882 0,632 0,399 0,212 bp: base pairs, NA: số lượng alen, HO: tỷ lệ dị hợp tử thực tế, HE: tỷ lệ dị hợp tử lý thuyết, PIC: hệ số đa dạng di truyền, PHWE: giá trị P đánh giá cân Hardy-Weinberg 18 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ 18 - THÁNG 12/2020 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II Bảng trình bày kết phân tích microsatellite 30 cá thể cá Tra Tổng cộng 87 alen phát 10 locus với số lượng alen dao động từ đến 11 alen locus, trung bình 8,7 ± 2,1 alen locus Tỷ lệ dị hợp tử (HO HE) hệ số PIC dao động từ 0,533 đến 0,867 (trung bình 0,729 ± 0,110); 0,538 đến 0,872 (trung bình 0,755 ± 0,086) 0,488 đến 0,841 (trung bình 0,711 ± 0,092) Trong số 10 thị microsatellite phát triển, thị có mức độ đa hình cao (PIC > 0,5) thị (Pahy-10) có mức độ đa hình trung bình (0,25 < PIC < 0,5) (Botstein ctv., 1980) Ngoài ra, tất microsatellite phát triển không cho thấy sai lệch đáng kể so với cân Hardy-Weinberg sau hiệu chỉnh Bonferroni (PHWE > 0,05) Với kết đánh giá sơ mức độ đa hình 30 mẫu cá Tra, thị microsatellite phát triển cho thấy tiềm ứng dụng lớn nghiên cứu đa dạng di truyền quần thể truy xuất phả hệ nhằm phục vụ cho chọn giống cá Tra So với phương pháp phát triển từ nghiên cứu trước, nghiên cứu có tính nhờ phát triển thị microsatellite dựa vào hệ gen cá Tra công bố công cụ tin sinh học cơng nghệ điện di mao quản có đánh dấu huỳnh quang kết hợp hệ thống phân tích đoạn ADN Từ đó, ngồi việc giảm thời gian phát triển thị, nghiên cứu đồng điều kiện phản ứng PCR bước sàn lọc mồi, thuận lợi cho việc nhóm cặp mồi thành multiplex PCR, xác định xác kích thước alen thơng qua phân tích đoạn ADN, đồng thời cịn xác định tương đối vị trí thị microsatellite hệ gen cá Tra, mở triển vọng cho nghiên cứu việc tìm thị liên kết tính trạng mong muốn dễ dàng Các ưu điểm kể vượt trội so với thị miocrosatellite phát triển theo phương pháp truyền thống nghiên cứu trước Tuy vậy, để đánh giá xác khả ứng dụng, thị phát triển cần thử nghiệm số lượng mẫu lớn quần đàn khác IV KẾT LUẬN Bằng phương pháp phát triển microsatellite đại với việc kết hợp công cụ tin sinh học công nghệ điện di mao quản có đánh dấu huỳnh quang, nghiên cứu phát triển thành công multiplex gồm 10 thị microsatellite dựa scaffold hệ gen cá Tra P hypophthalmus có độ đa hình cao (hệ số PIC trung bình đạt 0,711) khơng có sai khác so với quy luật di truyền Hardy-Weinberg Các microsatellite phát triển từ nghiên cứu cho thấy tiềm cho nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền truy xuất phả hệ phục vụ cho chương trình chọn giống cá Tra Tuy nhiên, kết ban đầu đánh giá mức độ đa hình thị Do đó, để so sánh với kết từ nghiên cứu trước, thị cần đánh giá ứng dụng khác quy mô mẫu lớn quần đàn khác LỜI CẢM ƠN Nghiên cứu tài trợ kinh phí chương trình VLIR-UOS South Initiatives (mã số SI-2019-01-26) Chúng xin gửi lời cảm ơn đến Laboratory of Biodiversity and Evolutionary Genomics (LBEG), Department of Biology, Faculty of Sciences, KU Leuven, Bỉ với hỗ trợ công nghệ kỹ thuật TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Trần Thị Phương Dung, Bùi Thị Liên Hà, Nguyễn Hồng Thơng, Nguyễn Ngọc Thùy Trang, Trần Hoàng Gia Linh, Nguyễn Văn Sáng, 2020 Hiệu chỉnh thành phần cho phản ứng PCR microsatellite nghiên cứu đa dạng di truyền quần thể cá Tra (Pangasianodon hypophthalmus) Tạp chí Khoa học, 17(9), 1575-1587, Trường Đại học Sư Phạm Tp Hồ Chí Minh Bùi Thị Liên Hà, Trì Thanh Thảo, Nguyễn Huỳnh Duy, Nguyễn Thanh Vũ, Trịnh Quốc Trọng, 2016 Nghiên cứu đa dạng di truyền phục vụ chọn TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ 18 - THÁNG 12/2020 19 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II giống cá Tra (Pangasianodon hypophthalmus) Tạp chí Nơng nghiệp & Phát triển Nơng thơn, 21, 94-101 Bùi Thị Liên Hà, Lê Ngọc Thùy Trang, Nguyễn Văn Sáng, 2017 Thử nghiệm xác định phả hệ thị phân tử microsatellite quần đàn chọn giống cá Tra (Pangasianodon hypophthalmus) Tạp chí Nơng nghiệp & Phát triển Nông thôn, 5, 88-97 Nguyễn Văn Sáng, Trịnh Quốc Trọng, Nguyễn Thanh Vũ, Bùi Thị Liên Hà, Nguyễn Thế Vương, Nguyễn Thị Đang, Nguyễn Huỳnh Duy, Ngô Hồng Ân, Trần Hữu Phúc, 2013 Đánh giá hiệu chọn giống cá Tra (Pangasianodon hypophthalmus) tăng trưởng tỷ lệ phi lê Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II Báo cáo tổng kết đề tài VASEP Xuất cá Tra năm 2019 đạt tỷ USD, 2020 Truy cập tại: http://vasep.com.vn/TinTuc/1207_58983/Xuat-khau-ca-tra-nam-2019dat-2-ty-USD.htm [Ngày truy cập: 06/12/2020] Tài liệu tiếng Anh Abdelkrim, J., Robertson, B., Stanton J.A., Gemmell, N., 2009 Fast, cost-effective development of species-specific microsatellite markers by genomic sequencing Biotechniques, 46(3), 185-192 Botstein, D., White, R.L., Skolnick, M., Davis, R.W., 1980 Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms Am J Hum Genet, 32(3), 314-331 Butler, J.M., Buel, E., Crivellente, F., McCord, B.R., 2004 Forensic DNA typing by capillary electrophoresis using the ABI Prism 310 and 3100 genetic analyzers for STR analysis Electrophoresis, 25(10-11), 1397-1412 Gaaib, J., And, A., Al-Assie, A., 2011 Simple salting – out method for genomic DNA extraction from whole blood Guichoux, E., Lagache, L., Wagner, S., Chaumeil, P., Leger, P., Lepais O., Lepoittevin, C., Malausa, T., Revardel, E., Salin, F., Petit R.J., 2011 Current trends in microsatellite genotyping Mol Ecol Resour, 11(4), 591-611 Ha, H.P., Nguyen, T.T.T., Poompuang, S., NaNakorn, U., 2009 Microsatellites revealed no genetic differentiation between hatchery and contemporary wild populations of striped catfish, Pangasianodon hypophthalmus (Sauvage 1878) in Vietnam Aquaculture, 291(3-4), 154-160 Hogan, Z.S., May, B.P., 2002 Twenty-seven new microsatellites for the migratory Asian catfish 20 family Pangasiidae Molecular Ecology Notes, 2(1), 38-41 Kelkar, Y.D., Strubczewski, N., Hile, S.E., Chiaromonte, F., Eckert, K.A., Makova, K.D., 2010 What is a microsatellite: a computational and experimental definition based upon repeat mutational behavior at A/T and GT/AC repeats Genome Biol Evol, 2, 620-635 Kim, O.T.P., Nguyen, P.T., Shoguchi, E., Hisata, K., Vo, T.T.B., Inoue, J., Shinzato, C., Le, B.T.N., Nishitsuji, K., Kanda, M., Nguyen, V.H., Nong, H.V., Satoh, N., 2018 A draft genome of the striped catfish, Pangasianodon hypophthalmus, for comparative analysis of genes relevant to development and a resource for aquaculture improvement BMC Genomics; 19(1), 733 Liu, Q., Cui, F., Hu, P., Yi, G., Ge, Y., Liu, W., Yan, H., Wang, L., Liu, H., Song, J., Jiang, Y., Zhang, L., Tu, Z., 2018 Using of microsatellite DNA profiling to identify hatchery-reared seed and assess potential genetic risks associated with large-scale release of swimming crab Portunus trituberculatus in Panjin, China Fisheries Research, 207, 187-196 Marshall, T.C., Slate, J., Kruuk, L.E.B., Pemberton, J.M., 1998 Statistical confidence for likelihoodbased paternity inference in natural populations 7(5), 639-655 Mayer, C., 2006-2010 Phobos 3.3.11 http://www rub.de/ecoevo/cm/cm_phobos.htm Miah, G., Rafii, M.Y., Ismail, M.R., Puteh, A.B., Rahim, H.A., Islam, N., Latif, M.A., 2013 A review of microsatellite markers and their applications in rice breeding programs to improve blast disease resistance Int J Mol Sci, 14(11), 22499-22528 Mittal, N., Dubey, A., 2009 Microsatellite markers - A new practice of DNA based markers in molecular genetics Pharmacognosy Reviews, 3, 235-246 Na-Nakorn, U., Moeikum, T., 2009 Genetic diversity of domesticated stocks of striped catfish, Pangasianodon hypophthalmus (Sauvage 1878), in Thailand: Relevance to broodstock management regimes Aquaculture; 297(1-4): 70-77 doi:10.1016/j.aquaculture.2009.09.014 Na-Nakorn, U., Sriphairoj, K., Sukmanomon, S., Poompuang, S., Kamonrat, W., 2006 Polymorphic microsatellite primers developed from DNA of the endangered Mekong giant catfish, Pangasianodon gigas (Chevey) and cross-species amplification in TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ 18 - THÁNG 12/2020 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II three species of Pangasius Molecular Ecology Notes, 6(4), 1174-1176 Nguyen, M.T., Le, N.T.P., Nguyen, T.L., Duong, A.L., 2019 Parentage Assignment in Striped Catfish (Pangasianodon hypophthalmus) Based on Microsatellite Markers The Israel Journal of Aquaculture - Bamidgeh; 71 Nguyen, V.S., Klemetsdal, G., Ødegård, J., Gjøen, H., 2012 Genetic parameters of economically important traits recorded at a given age in striped catfish (Pangasianodon hypophthalmus) Aquaculture, 344–349, 82–89 Phan, L.T., Bui, T M., Nguyen, T T T., Gooley, G J., Ingram, B A., Nguyen, H V., Nguyen, P T., De Silva, S S., 2009 Current status of farming practices of striped catfish, Pangasianodon hypophthalmus in the Mekong Delta, Vietnam Aquaculture, 296(3-4), 227-236 Volckaert, F., Hellemans, B., Pouyaud, L, 1999 Nine polymorphic microsatellite markers in the SE Asian catfishes Pangasius hypophthalmus and Clarias batrachus Animal Genetics - ANIM GENET, 30, 383-384 Zane, L., Bargelloni, L., Patarnello, T., 2002 Strategies for microsatellite isolation: a review Mol Ecol, 11(1), 1-16 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ 18 - THÁNG 12/2020 21 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II PRIMARY DEVELOPMENT AND CHARACTERIZATION OF NOVEL MICROSATELLITES FROM GENOME OF THE STRIPED CATFISH (Pangasianodon hypophthalmus) USING DATA MINING APPROACH Nguyen Van Sang1, Nguyen Minh Thanh2, Vo Hong Loc1, Nguyen Hoang Thong1, Le Hoang Khoi Nguyen2* ABSTRACT The striped catfish (Pangasianodon hypophthalmus) (Sauvage, 1878), locally known as tra catfish, is one of the iconic species for aquaculture development in Vietnam A number of microsatellites were previously developed using traditional methods However, these microsatellites did not meet the requirements of the selective breeding program for the striped catfish The current study succesfully developed a multiplex PCR of 10 novel microsatellites based on the striped catfish genomic sequences which were published in 2018 Microsatellite analysis for 30 striped catfish individuals demonstrated that the number of alleles (NA) ranged from to 11 alleles per locus The average polymorphic information content (PIC), the average observed heterozygosity (HO) and the average expected heterozygosity (HE) were 0.729; 0.755 and 0.711, respectively None of the loci was observed deviated from Hardy–Weinberg equilibrium after Bonferroni correction This new set of microsatellites was highly polymorphic and will be useful in the selective breeding programs for the striped catfish Keywords: genetic diversity, microsatellites, multiplex PCR, Pangasianodon hypophthalmus Người phản biện: TS Nguyễn Viết Dũng Người phản biện: TS Ngô Huỳnh Phương Thảo Ngày nhận bài: 22/11/2020 Ngày nhận bài: 22/11/2020 Ngày thông qua phản biện: 12/12/2020 Ngày thông qua phản biện: 16/12/2020 Ngày duyệt đăng: 25/12/2020 Ngày duyệt đăng: 25/12/2020 Research Institure for Aquaculture No.2 School of Biotechnology, International University, Ho Chi Minh city * Email: lhknguyen98@gmail.com 22 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 18 - THÁNG 12/2020 ... giống cá Tra So với phương pháp phát triển từ nghiên cứu trước, nghiên cứu có tính nhờ phát triển thị microsatellite dựa vào hệ gen cá Tra công bố công cụ tin sinh học công nghệ điện di mao quản... dụng, thị phát triển cần thử nghiệm số lượng mẫu lớn quần đàn khác IV KẾT LUẬN Bằng phương pháp phát triển microsatellite đại với việc kết hợp công cụ tin sinh học công nghệ điện di mao quản có... pháp phát triển thị microsatellite truyền thống, thị microsatellite phát triển theo phương pháp đại dựa hệ gen cá Tra công bố Các thông số di truyền tính tốn để đánh giá sơ mức độ đa hình thị, từ