Thử nghiệm và đánh giá các phương pháp thu hoạch sinh khối vi tảo Thalassiosira weissflogii (Grunow fryxell Hasle 1977) phục vụ sản xuất giống hải sản

Nghiên cứu được thực hiện nhằm thử nghiệm và đánh giá các phương pháp thu hoạch để thu sinh khối, tạo sản phẩm tảo cô đặc của vi tảo Thalassiosira weissflogii, ứng dụng làm thức ăn trong nuôi trồng thủy sản.

VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II THỬ NGHIỆM VÀ ĐÁNH GIÁ CÁC PHƯƠNG PHÁP THU HOẠCH SINH KHỐI VI TẢO Thalassiosira weissflogii (Grunow Fryxell Hasle 1977) PHỤC VỤ SẢN XUẤT GIỐNG HẢI SẢN Hồ Hồng Nhung1∗, Trần Văn Nhiên1, Nguyễn Thị Mai Anh1, Nguyễn Hữu Thanh1 TÓM TẮT Nghiên cứu thực nhằm thử nghiệm đánh giá phương pháp thu hoạch để thu sinh khối, tạo sản phẩm tảo cô đặc vi tảo Thalassiosira weissflogii, ứng dụng làm thức ăn nuôi trồng thủy sản Sinh khối tảo nuôi quy mô pilot (thể tích m3) thu hoạch phương pháp kết bơng sử dụng hóa chất hữu ly tâm Kết cho thấy, phương pháp ly tâm (ở tốc độ 3000 rpm) cho hiệu suất thu hồi cao (97 ±1,7%) với tỷ lệ sống tế bào đạt 99,2 ±0,8% Ở thí nghiệm kết bơng, nồng độ Chitosan Magnafloc LT25 thích hợp để đạt hiệu suất thu hồi cao 90%, 20 mg/L 0,10% Tuy nhiên, thử nghiệm tách kết bơng tỷ lệ tế bào tách khối thấp, đạt 12-13% (ở nghiệm thức kết Chitosan) 26% (ở nghiệm thức kết Magnafloc LT25) Bên cạnh đó, sản phẩm tảo đặc thu phương pháp kết bơng thường có kích thước hạt lớn, tế bào khó phân tách trở lại thành tế bào riêng lẻ nên không phù hợp để làm thức ăn ương nuôi số đối tượng thủy sản Trái lại, phương pháp ly tâm chi phí đầu tư chi phí vận hành cao hiệu thu hoạch cao, không cần bổ sung hóa chất nên áp dụng để thu sinh khối vi tảo Thalassiosira weisflogii Sản phẩm sau ly tâm có mật độ tế bào cao, tế bào dễ dàng tách rời, thích hợp làm thức ăn ni trồng thủy sản Từ khóa: kết bơng, ly tâm, tảo cô đặc, Thalassiosira weissflogii, thu hoạch I GIỚI THIỆU Vi tảo Thalassiosira weissflogii lồi có giá trị dinh dưỡng cao, đặc biệt chứa hàm lượng acid béo không no EPA, DHA cao so với loài tảo khác (Pratoomyot ctv., 2005) Với ưu điểm kích thước tế bào nhỏ, dễ tiêu hóa nên lồi tảo sử dụng làm thức ăn ương nuôi ấu trùng tôm, ấu trùng nhuyễn thể, artemia… T weissflogii nguồn thức ăn tốt cho ấu trùng tôm mà khơng cần kết hợp với lồi tảo khác (Heimaiswarya ctv., 2011) Theo Kiametha ctv (2011), sử dụng vi tảo T weissflogii ương ấu trùng tôm sú (Penaeus monodon) cho thấy thời gian biến thái ngắn, khả sinh trưởng tốt tỷ lệ sống cao Vì thế, việc bổ sung lồi tảo vào phần ăn ương nuôi ấu trùng tôm thẻ ấu trùng nhuyễn thể cần thiết nhằm nâng cao chất lượng giống Trong sản xuất giống thủy sản, lồi vi tảo ln ni thể tích lớn sản phẩm tảo cần lưu trữ thời gian dài để đáp ứng kịp thời nhu cầu thức ăn cho giống Vì vậy, ngồi cơng nghệ ni sinh khối cần có phương pháp thu hoạch thích hợp để đạt hiệu thu hoạch với tỷ lệ tế bào sống cao; mà không làm thay đổi đặc tính sinh học, hàm lượng dinh dưỡng vi tảo; tạo điều kiện thuận lợi cho việc lưu trữ bảo quản sản phẩm tảo thu hoạch tốt Việc thu sinh khối có ý nghĩa thiết thực tạo Viện Nghiện cứu Nuôi trồng Thủy sản II * Email: nhungho1625@gmail.com 34 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ 18 - THÁNG 12/2020 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II sản phẩm tảo cô đặc thay cho vi tảo tươi, hạn chế việc đưa trực tiếp hóa chất (mơi trường dinh dưỡng cịn sót lại dịch tảo tươi) vi khuẩn vào bể nuôi gây ảnh hưởng không tốt đến ấu trùng (Griffith ctv., 1973) Có nhiều phương pháp sử dụng để thu hoạch sinh khối vi tảo như: phương pháp làm đặc sử dụng biện pháp keo tụ hóa học, sinh học (sử dụng vi sinh vật) Vandamme ctv (2013); phương pháp vật lý (lắng, tuyển nổi) Milledge Heaven (2013) phương pháp loại nước lọc, ly tâm và nhiều phương pháp khác (Barros ctv., 2015, Heasman ctv., 2000) Các lồi vi tảo có kích thước nhỏ ứng dụng làm thức ăn nuôi trồng thủy sản thường thu hoạch phương pháp hóa học hay phương pháp kết bơng (sử dụng hóa chất hữu cơ) phương pháp ly tâm (1) Phương pháp kết bông: Khi sử dụng chất kết chitosan, Morales ctv (1985) thử nghiệm kết bơng lồi tảo khác như: Skeletonema costatum, Dunaliella tertiolecta, Thalassiosira nordenskoldii, Chlorella sp Thalassionema sp Tác giả kết luận không điều chỉnh pH, hiệu kết đạt 100% sử dụng nồng độ Chitosan >40 mg/L; pH dịch tảo điều chỉnh 7,0 =85% (2) Phương pháp ly tâm: Nhiều loại máy ly tâm sử dụng dựa chi phí đầu tư, mức tiêu tốn lượng, quy mô sản xuất giá trị sản phẩm máy ly tâm dạng đĩa chồng, dạng bình… Heasman ctv (2000) thử nghiệm siêu ly tâm với loài vi tảo khác cho kết hiệu suất thu hoạch đạt 95% (với loài C calcitrans, S costatum, P tricornutum, C muelleri, N oculata) đạt 100% (với loài P lutheri, Isochrysis sp., T chuii) tốc độ, thấp (1300 rpm), cao (6000 rpm) cao (13000 rpm) Tác giả kết luận phương pháp xem phù hợp với lồi tảo có cấu trúc ngồi rắn T suecica, S costatum Chaetoceros sp Nhìn chung, việc lựa chọn phương pháp thu hoạch dựa vào đặc điểm sinh học loài vi tảo, hiệu kinh tế mục đích sử dụng Mặc dù có nhiều phương pháp thu hoạch nghiên cứu, nhiên giới hạn số loài tảo định chưa có nhiều thử nghiệm để thu hoạch sinh khối vi tảo Thalassiosira weissflogii sử dụng làm thức ăn nuôi trồng thủy sản Mục tiêu nghiên cứu xác định nồng độ chất kết bơng hữu tốc độ ly tâm thích hợp để thu hoạch sinh khối loài T weissflogii Hiệu phương pháp thu hoạch đánh giá thơng qua tiêu chí: hiệu suất thu hoạch, khả phân tách tế bào, tỷ lệ sống tế bào Kết nghiên cứu sở để lựa chọn phương pháp thu hoạch thích hợp ứng dụng vào thực tiễn sản xuất tạo sản phẩm tảo cô đặc II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu Tảo sinh khối T weissflogii ni quy mơ pilot (thể tích m3) đến thời điểm thu hoạch đạt mật độ 40 – 50 x104 tb/mL (sau 4-5 ngày ni cấy) Hóa chất: Chitosan (Aldrich Chemicals), Magnafloc LT25, NaOH, HCl, acid hữu bao gồm acid citric (Merck), acid Acetic TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 18 - THÁNG 12/2020 35 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II (Ajax UN), thuốc nhuộm Evan’s Blue (Sigma Chemical P/L, Cat No E-2129) Dụng cụ thiết bị: Kính hiển vi, máy đo pH để bàn hiệu HANNA-HI 8424, máy ly tâm liên tục dạng bình hiệu SHARPLES (Model AE-12V), tốc độ bơm 200 L/giờ Thí nghiệm tiến hành Trung tâm Quốc gia Giống Hải sản Nam Bộ, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thuỷ sản II 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Bố trí thí nghiệm 2.2.1.1 Thu sinh khối phương pháp kết bơng Thí nghiệm sử dụng chất kết chitosan (1) Kết bông: Chitosan hòa tan với hai loại acid khác (Acetic acid Citric acid) kết hợp kết 03 mức nồng độ 10, 20 50 mg/L; Thí nghiệm gồm 06 nghiệm thức bố trí Bảng Mỗi nghiệm thức lặp lại lần Bảng Bố trí thí nghiệm kết bơng Chitosan, với nghiệm thức kết hợp acid dùng để hòa tan Chitosan mức nồng độ Nghiệm thức Acid hòa tan Chitosan Acetic acid Citric acid Acetic acid Citric acid Acetic acid Citric acid Nồng độ Chitosan (mg/L) 50 50 20 20 10 10 (2) Tách khối kết bông: từ kết hiệu tan chitosan trước đó, thay HCl suất thu hoạch kết bông, chọn nồng độ chitosan để hiệu chỉnh pH 6,5; Thí nghiệm gồm 04 thích hợp để tiến hành tách khối kết nghiệm thức bố trí Bảng Mỗi Thí nghiệm sử dụng acid loại hòa nghiệm thức lặp lại lần Bảng Bố trí thí nghiệm tách khối kết bơng sử dụng loại acid hồ tan Chitosan acid làm giảm pH khác nhau, mức nồng độ Chitosan thích hợp (từ kết kết bơng) Nghiệm thức Acid hịa tan Chitosan Acetic acid Acetic acid Citric acid Citric acid Thí nghiệm sử dụng chất kết bơng Magnafloc LT25: (1) Kết bông: thử nghiệm với 02 nghiệm thức nồng độ 0,05% 0,10% Mỗi nghiệm thức bố trí ngẫu nhiên lặp lại lần (2) Tách khối kết bông: sử dụng acid HCl 0,1 M để điều chỉnh pH 7,5-8,0 Mỗi nghiệm thức lặp lại lần 2.2.1.2 Thu sinh khối phương pháp 36 Acid làm giảm PH Acetic acid HCl Citric acid HCl ly tâm Thí nghiệm gồm 03 nghiệm thức tương ứng với tốc độ ly tâm 1500, 2000, 3000 rpm Mỗi nghiệm thức lặp lại 03 lần tương ứng với 03 mẻ tảo sinh khối T weissflogii 2.2.2 Phương pháp thực 2.2.2.1 Thu sinh khối phương pháp kết bơng TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ 18 - THÁNG 12/2020 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II Hình (a): Sơ đồ khối kết Chitosan; (b): Sơ đồ khối kết Magnafloc LT25 Kết bơng Chitosan Quy trình kết bơng: Mẫu tảo cho vào cốc thủy tinh L đặt máy khuấy từ phút Xác định pH dịch nuôi tảo máy đo pH để bàn HANNA HI 8424 (Rumani), hiệu chỉnh pH 6,5 (Heasman ctv., 2000) Sau đó, bổ sung dung dịch Chitosan 0,5% (w/v) pha với loại acid hữu acetic acid 1% citric acid 0,5 M (Lubián, 1989) vào dung dịch nuôi tảo, nồng độ Chitosan thử nghiệm theo mức nồng độ 10, 20 50 mg/L Ở mức thí nghiệm nồng độ Chitosan, dịch nuôi tảo dịch Chitosan trộn phút hiệu chỉnh pH = 8,0 cách thêm dung dịch NaOH 1N Đưa cốc thủy tinh khỏi máy khuấy từ, để yên dịch tảo nuôi khoảng 15-30 phút hình thành khối kết bơng đáy cốc Dịch nước lỏng bên loại bỏ cách xi - phơng, khối kết bơng cịn lại loại bỏ nước hoàn toàn cách lọc qua lưới 75 μm lưu giữ nhiệt độ 2±0,5oC tuần, tiến hành phân tách tảo kết chùm Phân tách tảo kết chùm: Trước tiên, 10 mL khối tảo kết chùm thêm vào 100 mL nước muối có nồng độ 70 g/L, cho vào cốc thủy tinh đặt máy khuấy từ 10-15 phút, hiệu chỉnh dung dịch pH 5,0 cách bổ sung dung dịch acid hữu (acetic acid citric acid sử dụng để hòa tan Chitosan) dung dịch HCl 0,1 M Chất hịa tan Chitosan có ảnh hưởng đến tính tan khối kết bơng, sử dụng loại acid hữu thử nghiệm nồng độ sau: Citric acid 0,5 M, Acetic acid 1,0% w/v (Hayes ctv., 1978) Giảm pH dịch tảo kết chùm hai loại acid sử dụng để hòa tan Chitosan (citric acid acetic acid) HCl 0,1 M Kết bơng magnafloc LT25 Quy trình kết bông: Sử dụng phương pháp Knuckey ctv (2006) theo tiến trình sau: Lấy dung dịch NaOH 1M cho từ từ vào dung dịch tảo (trong vòng 15 phút), khuấy mạnh để điều chỉnh pH dịch ni 10,2-10,3 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ 18 - THÁNG 12/2020 37 VIỆN NGHIÊN CỨU NI TRỒNG THỦY SẢN II Tại giá trị pH xuất lượng nhỏ chất lắng tụ màu trắng hợp chất cacbonate hay hydroxide, thêm dung dịch LT25 (0,05% 0,1%) nồng độ ml/L, khuấy trộn nhẹ phút Sau 15-20 phút, tảo lắng xuống Dịch nước lỏng bên loại bỏ cách xi-phơng, tảo kết bơng cịn lại loại bỏ nước hoàn toàn cách lọc qua lưới 75 µm Phân tách tảo kết chùm: Dịch tảo cô đặc điều chỉnh pH 7,5-8,0 (bằng cách thêm từ từ 0,1M HCl vòng phút khuấy đũa thủy tinh) để tách rời tế bào trở lại ban đầu Dung dịch tảo cô đặc hầu hết chuyển thành màu đậm chất kết tủa gốc carbonate hydroxide tan vào nước Dung dịch để qua đêm nhiệt độ 40C 2.2.2.2 Thu sinh khối phương pháp ly tâm Sử dụng máy ly tâm liên tục dạng bình, hiệu SHARPLES - Model AE 12 V, cơng suất động 1,5 Kw/3P/380 VAC, điều tốc bằng biến tầng ABB, tốc độ tối đa: 15.000 rpm Bơm cấp nước liên tục, công suất 1/2HP-1P/220VAC/50Hz, tốc độ bơm 200 L/giờ, đường ống cấp dịch tảo φ21 inox Thân máy thép đúc gắn liền với chân máy tạo độ vững chống rung, lõi ly tâm làm inox 304, tủ điều khiển có hình hiển thị tốc độ, tần số, điện áp Bồn chứa composite, thể tích 500 L, có hệ thống sục khí đảm bảo đảo trộn sinh khối tảo suốt thời gian ly tâm Sinh khối tảo từ hệ thống nuôi ống dẫn thu hoạch cách chảy tự động vào bồn chứa 500 L, bơm vào máy ly tâm Trước vận hành máy, mật độ tảo trước ly tâm xác định Vận hành máy 03 tốc độ ly tâm khác nhau, tốc độ tiến hành thu mẫu tảo ống thu hoạch mẫu nước sau ly tâm ống xả Rửa ống thu hoạch trước thay đổi tốc độ ly tâm 2.3 Phương pháp thu thập xử lý số liệu 38 Xác định mật độ tảo: mật độ tảo trước sau thu hoạch kết bông, trước sau ly tâm xác định buồng đếm Neubauer (Superior Co., Berlin, Germany) kính hiển vi độ phóng đại 100x - 400x Hiệu suất thu hồi sau kết bông: [(OC-SC)/ OC] * 100 (Ponis ctv., 2003) với OC mật độ tảo trước kết bông; SC mật độ tảo sau kết dịch bên khối kết Hiệu suất thu hồi sau ly tâm: [(Cb - Ca)/ Cb] * 100 (Ponis ctv., 2003) Trong đó: Cb mật độ tảo trước ly tâm; Ca mật độ tảo dịch sau ly tâm Phương pháp xác định tỷ lệ tế bào sống: sử dụng phương pháp nhuộm màu với dung dịch Evan’s Blue (Molina Grima ctv., 1994) Hịa sản phẩm tảo đặc nước biển hấp tiệt trùng (tỷ lệ 0,1 mL/100 mL nước) Sau đó, tiến hành lọc qua lưới 10 µm Sử dụng thuốc nhuộm Evan’s blue 1% (w/v) theo tỷ lệ 20 mL mẫu: mL thuốc nhuộm, để nhiệt độ phòng vòng 30 phút kiểm tra mẫu Mẫu nhuộm kiểm tra đếm buồng đếm Neubauer, KHV độ phóng đại 250x Xác định tỷ lệ tế bào sống cách phân biệt màu sắc: tế bào chết bắt màu thuốc nhuộm tế bào sống không bị nhuộm thành tế bào nguyên vẹn Tỷ lệ sống tế bào (%) = (tế bào sống/ tổng số tế bào) x 100 Xử lý số liệu Sử dụng phân tích phương sai ANOVA hai yếu tố phép thử Duncan (SPSS version 19.0) để so sánh hiệu suất kết bơng thí nghiệm kết bơng chitosan, gồm hai biến acid hòa tan chitosan nồng độ Số liệu phần trăm chuyển sang arcsine trước xử lý Sử dụng phân tích One-way ANOVA phép thử Duncan (SPSS version 19.0) để so sánh hiệu suất kết Magnafloc LT25, tỷ lệ tế bào phân tách, tỷ lệ sống sau kết chitosan magnafloc LT25; so sánh TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ 18 - THÁNG 12/2020 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II hiệu suất thu hoạch tỷ lệ sống tế bào sau khác biệt, kết nồng độ ly tâm Số liệu phần trăm chuyển sang cao khác biệt so có ý nghĩa với nồng độ 10 mg/L (p0,05) 3.1.1 Kết chitosan Vậy, nồng độ Chitosan tối thiểu để thu Điều chỉnh pH dịch nuôi: sản phẩm tảo ban đầu có pH 8,4±0,1, hiệu suất kết bơng hoạch sinh khối loài Thalassiosira weisflogii 20 mg/L, giá trị pH điều chỉnh giảm xuống cải thiện nhờ việc hiệu chỉnh pH 6,5 Kết từ Bảng cho thấy, hiệu suất thu 6,1 3,4 với chất hòa tan Chitosan hoạch đạt cao nồng độ 20 50 acetic acid citric acid mg/L, từ (98,6 ±1,2) – (99,6±0,7)% khơng có Bảng Kết kết bơng vi tảo T weissflogii nồng độ Chitosan loại acid hòa tan Chitosan khác Acid hòa tan Chitosan Liều Chitosan (mg/L) pH dịch nuôi pH sau thêm Chitosan Acetic acid Citric acid Acetic acid Citric acid Acetic acid Citric acid 50 50 20 20 10 10 8,4±0,1 8,4±0,1 8,4±0,1 8,4±0,1 8,4±0,1 8,4±0,1 6,1±0,1 3,3±0,1 6,1±0,1 3,4±0,1 6,1±0,1 3,5±0,1 Mật độ tảo Mật độ tảo trước kết dịch (x104 tb/mL) sau kết (x104 tb/mL) 51,6 0,3 51,7 0,3 51,3 0,8 51,8 0,6 52,0 8,0 54,3 8,6 Hiệu suất kết (%) 99,6±0,7b 99,5±0,3b 98,8±0,6b 98,6±1,2b 85,4±1,0a 84,2±1,9a Số liệu bảng giá trị TB±SD (n=3) Giá trị có ký hiệu chữ khác cột thể khác biệt có ý nghĩa thống kê (p0,05) Vì tế bào tảo không tách rời, lượng Chitosan khối kết dày bắt màu thuốc nhuộm nên nhóm nghiên cứu khơng xác định xác tỷ lệ sống tế bào Nhìn chung, mật độ tế bào sống cao Theo Harun ctv (2010), liều lượng tối ưu Chitosan để kết bơng lồi Thalassiosira pseudonana Isochrysis sp 40 mg/L Theo Morales ctv (1985), sử dụng Chitosan kết bơng 05 lồi tảo, lồi Thalassiosira nordenskoldii nồng độ Chitosan 40 mg/L cho hiệu suất kết lên đến 100% Ở nồng độ Chitosan 40 mg/L, Heasman ctv (2000) thử nghiệm kết Thalassiosira pseudonana với hiệu suất đạt 90%, pH = 8,0 Cũng với loài T pseudonana, Trang Sĩ Trung ctv (2016) sử dụng Chitosan chiết xuất từ vỏ tơm thẻ chân trắng có độ deacetyl 85, với liều mg/L pH = cho hiệu suất thu hoạch đạt đến 100% Tuy nhiên, nghiên cứu khơng trình bày 40 kết tỷ lệ tế bào tách kết Phương pháp sử dụng Chitosan để thu sinh khối vi tảo phương pháp đơn giản, chi phí thấp, hiệu suất thu hoạch cao nên khuyến cáo sử dụng để thu sinh khối vi tảo làm thức ăn cho loài sống đáy (Heasman ctv., 2000) Hiệu thu sinh khối vi tảo Chitosan bị ảnh hưởng nhiều yếu tố môi trường pH, nhiệt độ, mật độ sinh khối, đặc điểm sinh khối vi tảo, tính chất Chitosan (độ deacetyl, khối lượng phân tử, kích thước phân tử, độ tinh sạch), thời gian thu nồng độ Chitosan sử dụng (Chen ctv., 2014) 3.1.2 Kết Magnafloc LT25 Ở pH 9-10, khối keo tụ hình thành lớn hơn, nhanh việc lắng khối tảo kết dễ dàng Kết sử dụng LT25 để thu sinh khối vi tảo T weissflogii cho hiệu suất kết 81 ±1,13% 99 ±0,32% nồng độ 0,05% 0,10% (Bảng 5) TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ 18 - THÁNG 12/2020 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II Bảng Hiệu suất tỷ lệ tách kết tế bào vi tảo T weissflogii nồng độ Magnafloc LT25 Nồng độ LT 25 0,05% 81±1,13a 64±3,02b 97±2,52b Hiệu suất kết (%) Tỷ lệ tách kết (%) Tỷ lệ sống tế bào (%) 0,10% 99±0,32b 26±3,04a 83±2,73a Số liệu bảng giá trị TB±SD (n=3) Giá trị có ký hiệu chữ khác hàng thể khác có ý nghĩa thống kê (p