Bài giảng Sinh học phân tử: Chương 10 - Bùi Hồng Quân

Bài giảng Sinh học phân tử: Chương 10 Các phương pháp phân tích DNA, cung cấp cho người học những kiến thức như: Chiết tách DNA; Các phương pháp định tính và định lượng sơ bộ acid nucleic; Kỹ thuật cắt, nối, lai DNA và ứng dụng; Các phương pháp xác định trình tự DNA; Kỹ thuật PCR. Mời các bạn cùng tham khảo!

Chương 10 CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH DNA http://buihongquan.com Các phương pháp phân tích DNA • Chiết tách DNA • Các phương pháp định tính định lượng sơ bợ acid nucleic • Kỹ tḥt cắt, nới, lai DNA ứng dụng • Các phương pháp xác định trình tự DNA • Kỹ thuật PCR http://buihongquan.com Chiết tách vật liệu di truyền • Nguyên tắc chung: bước – – – • Các trường hợp cụ thể: – – – – – – – • Phá vỡ tế bào: vật lý, hóa học Chiết tách acid nucleic: Phenol-Chloroform Kết tủa acid nucleic: cồn tuyệt đối Plasmid: mục tiêu loại NST khác cấu dạng - kích thước ADN thực khuẩn: tủa phage PEG, loại bỏ capsid Tế bào Thực vật: phá tế bào cách nghiền Tế bào Động vật: phá tế bào enzym - chất tẩy ARN: bất hoạt RNase, tủa LiCl 8M, loại ADN DNase Tủa lượng ADN nhỏ: độn tARN Tủa isopropanol, tert-butanol,… Các kỹ thuật khác – Loại carbohydrat, lipid CTAB – Thu hồi ADN sắc ký hấp phụ http://buihongquan.com • Tinh chế acid nucleic Siêu ly tâm, ly tâm phân đoạn – – • Sắc ký – – – – • Gradient liên tục / không liên tục cesium chloride (CsCl) Gradient saccharose Sắc ký lực: sử dụng pha tĩnh U-Sepharose hay oligodTcellulose để tinh chế mARN Sắc ký lọc gel để tách nucleotid tự sau tạo mẫu dò đánh dấu Sắc ký trao đổi ion vi cột, áp dụng để thu hồi lượng ADN nhỏ Sắc ký lỏng hiệu cao: dùng để tinh chế oligonucletid tổng hợp (độ phân giải nucleotid), plasmid, phân tách đoạn ADN Điện di: – – Agarose PAGE (PolyAcrylamide Gel Electrophoresis) http://buihongquan.com Định tính - định lượng acid nucleic • Quang phổ kế: OD260nm – – – – 50 μg/ml dung dịch ADN (hoặc ARN) sợi đôi 40 μg/ml dung dịch ARN (hoặc ADN) sợi đơn 30 μg/ml oligonucleotid (tới 70 base) Kiểm tra độ tinh khiết tỷ lệ OD260/230 OD260/280, OD320nm • Điện di gel: phân tách acid nucleic dòng điện gel – Định tính theo kích thước – Định lượng so sánh với chuẩn http://buihongquan.com Điện di http://buihongquan.com Các enzym biến đổi acid nucleic • Enzym cắt hạn chế / methylase – Cắt ADN tại vị trí xác định – Tạo đầu dính đầu tù – Lưu ý tính tương thích cắt nới • Polymerase – – – – ADN polymerase phụ thuộc ADN Polymerase phụ thuộc ARN (hoặc ADN) ADN Polymerase không phụ thuộc khn mẫu ARN polymerase phụ tḥc ADN • Ligase – Nối hai đoạn ADN C-A-T-G-A-T A-T-G-A-T-G G-T-A-G-T-A T-A-G-T-A-C Nối được http://buihongquan.com C-A-T-G-A T-G-T-G-A-T-G G-T-A-G-T-A-C A-C-T-A-C Nối được C-A-T-G-A G-T-G-A-T-G G-T-A-G-T-A-C A-C-T-A-C Khơng được Kỹ tḥt lai acid nucleic • Là bắt cặp bổ sung đặc hiệu hai phân tử acid nucleic mạch đơn G-T-A-G-T-C-C + T-C-A-G-G-T G-T-A-G-T-C-C T-C-A-G-G-T  Các yếu tố ảnh hưởng – – – – Nồng độ ADN và thời gian phản ứng Nhiệt độ Độ dài các trình tự Lực ion http://buihongquan.com Kỹ thuật lai acid nucleic • • • • • Southern Blot: lai ADN Northern Blot: lai ARN Lai tại chỗ (in situ) Mẫu dò (probe) Hệ thống phát hiện – – – Phóng xạ Enzym Huỳnh quang Chiết tách ADN vi khuẩn Gắn ADN vào màng ADN đích Màng Lai với đ B B o Đ o n d d ấ ò đánh u b i o t i d n ấ u b ằ n g b n i ò đánh d o t i B B B B AP AP n Streptavidin AP B Alkaline phosphatase biotinyl hóa B AP B B AP B B Cơ p c h h o ấ s t A p h l a k t a a l s i n B e e Phát quang AP AP B AP http://buihongquan.com B AP AP B B B AP B B B AP AP B B Kỹ thuật PCR • Nguyên lý: chép ADN in vitro – Trong điều kiện có sẵn nucleotid – Enzym polymerase kéo dài mạch ADN theo nguyên tắc bổ sung đầu 3’-OH trớng • Kỹ tḥt PCR gồm bước: – biến tính dsADN thành sợi đơn nhờ nhiệt đợ, – ủ đoạn mồi (chuỗi oligonucleotid tổng hợp đặc hiệu) với ssADN, – enzym kéo dài đoạn mồi theo nguyên tắc bổ sung với khuôn mẫu Polymerase 5’-P 3’-OH http://buihongquan.com nucleotid 3’-OH 5’-P PCR http://buihongquan.com PCR - Các yếu tớ kỹ tḥt • Chương trình PCR – Biến tính khởi đầu: 95oC / 5-10 phút – Chu kỳ nhiệt: gồm bước lặp lại 25-40 lần • Biến tính: 94-95oC / 30’-vài phút • Gắn mồi: 40-70oC (< Tm mồi) / 30’-60’ • Kéo dài: 65-74OC / thời gian tùy theo độ dài khuôn – Kéo dài kết thúc: 72-74oC / vài lần thời gian kéo dài • Thành phần phản ứng: 20-100 µl – – – – – Khuôn mẫu Mồi (oligo 15-30 nucleotid, được thiết kế đặc hiệu) Đệm có nồng độ Mg++ thay đổi (cần tối ưu hóa) dNTP: A, T, G và C DNA polymerase chịu nhiệt http://buihongquan.com Ưu nhược điểm và các biến thể • Ưu – Nhanh, Đơn giản, Nhạy, Đặc hiệu • Nhược – Phải biết trình tự đầu để thiết kế mồi – Ngoại nhiễm  tính đặc hiệu • Biến thể – Nested PCR (tổ): dùng bợ mồi  tăng tính đặc hiệu, nhạy khuôn mẫu không tốt – Multiplex PCR: dùng nhiều bộ mồi nhiều khuôn mẫu một phản ứng – RT-PCR: khuôn mẫu ARN – Realtime-PCR: PCR song song với phát hiện sản phẩm – …… http://buihongquan.com Ứng dụng PCR • • • • • • Tạo đoạn ADN mong muốn Giải trình tự Gây đột biến Chẩn đoán, Phát hiện và định danh sinh vật Xác định quan hệ di truyền Nhận dạng tội phạm,… http://buihongquan.com Phương pháp giải trình tự Sanger • Phương pháp enzym/dideoxy: dựa vào ngừng tổng hợp ADN gặp phải dideoxy nucleotid (Frederick Sanger) • Qui trình: – Thực hiện phản ứng PCR riêng biệt với mồi: A: có dNTP + ddATP T: có dNTP + ddTTP G: có dNTP + ddGTP C: có dNTP + ddCTP – Mỗi ống sản phẩm được nạp vào một giếng điện di – Kết quả điện di được đọc  trình tự http://buihongquan.com Đọc kết quả Phương pháp Sanger 5’-GGCCGCGTCTTCGCCGTAG-3’ ddG ddA ddT ddC 3’ 5’ http://buihongquan.com Kỹ thuật tự đợng (Harold Swerdlow) • • • • Các ddNTP được đánh dấu huỳnh quang với các màu khác Thực hiện một phản ứng PCR với hiện diện các dNTP và ddNTP Sử dụng điện di mao quản để tách sản phẩm Đọc kết quả đầu dò laser http://buihongquan.com Phương pháp giải trình tự Maxam Gilbert • • Phương pháp hóa học: dựa vào thủy giải đặc trưng ADN (Allan Maxam và Walter Gilbert) Qui trình: – Tạo ADN sợi đơn từ đoạn ADN cần giải trình tự – Đánh dấu phân tử ADN một đầu – Thực hiện (hoặc 5) ống phản ứng riêng biệt: G: + dimethyl sulphate  Guanine bị methyl hóa AG: + formic acid  Adenin và Guanine bị methyl hóa TC: + Hydrazine  biến đổi Thymin và Cytosin C: + Hydrazine + 1,5 M NaCl  biến đổi Cytosin – Xử lý ống với piperidine 1M/90oC để cắt ADN liên kết phosphat kế nucleotid bị biến đổi A>C: NaOH 1,2N/90oC cắt ADN Adenin > Cytosin – Mỗi ống được nạp vào một giếng điện di – Kết quả điện di được đọc và biện luận  trình tự http://buihongquan.com Phương pháp giải trình tự Maxam Gilbert ADN cần giải trình tự Tạo sợi ADN đơn Đánh dấu bằng P32 Cắt tại các base đặc hiệu Phản ứng tại G http://buihongquan.com Phản ứng tại A/T Phản ứng tại T/C Phản ứng tại C Phương pháp giải trình tự Maxam Gilbert Điện di Tách theo kích thước Phóng xạ ký Kích thước sản phẩm (số nucleotid) 3’ 5’ G 394 http://buihongquan.com A/G T/C C Đọc trình tự Ưu nhược điểm Maxam-Gilbert • Ưu: – Giải trình tự khơng cần mồi • Nhược: – – – – Chậm Đợc hại Năng suất thấp Không tự động hóa được http://buihongquan.com Pyrosequencing • Được phát triển Pål Nyrén Mostafa Ronaghi tại Royal Institute of Technology, Thụy Điển, năm 1996 • Dựa vào phát hiện phóng thích pyrophosphate nucleotide được gắn vào • Thành phần phản ứng: – ADN sợi đơn – Mồi – Các enzym: DNA polymerase, ATP sulfurylase, luciferase apyrase, – Các chất adenosine 5´ phosphosulfate (APS) luciferin http://buihongquan.com ... ADN C-A-T-G-A-T A-T-G-A-T-G G-T-A-G-T-A T-A-G-T-A-C Nối được http://buihongquan.com C-A-T-G-A T-G-T-G-A-T-G G-T-A-G-T-A-C A-C-T-A-C Nối được C-A-T-G-A G-T-G-A-T-G G-T-A-G-T-A-C A-C-T-A-C Khơng... lai acid nucleic • Là bắt cặp bổ sung đặc hiệu hai phân tử acid nucleic mạch đơn G-T-A-G-T-C-C + T-C-A-G-G-T G-T-A-G-T-C-C T-C-A-G-G-T  Các yếu tố ảnh hưởng – – – – Nồng độ ADN và... mẫu Polymerase 5’-P 3’-OH http://buihongquan.com nucleotid 3’-OH 5’-P PCR http://buihongquan.com PCR - Các yếu tớ kỹ tḥt • Chương trình PCR – Biến tính khởi đầu: 95oC / 5 -1 0 phút – Chu kỳ