Đang tải... (xem toàn văn)
Trong lĩnh vực công nghệ sinh học thì công nghệ sản xuất enzyme là một ngành khá quan trọng. Enzyme là chất xúc tác sinh học không những xúc tác cho các phản ứng xảy ra trong cơ thể sống, mà sau khi tách khỏi hệ thống sống, ở những điều kiện nhất định chúng vẫn giữ đƣợc những hoạt tính xúc tác (Phạm Thị Trân Châu và cs, 2007). Vì vậy, việc nghiên cứu và ứng dụng các sản phẩm của enzyme đã đƣợc rất nhiều quốc gia triển khai, đặc biệt là các nƣớc phát triển nhƣ Mỹ, Đức, Nga, Trung Quốc... đã đem lại lợi nhuận rất lớn. Ở Việt Nam, công nghệ enzyme đã đƣợc nghiên cứu và ứng dụng trong nhiều lĩnh vức nhƣng chƣa thực sự phát triển. Các sản phẩm thƣơng mại có nguồn gốc enzyme vẫn chủ yếu theo con đƣờng nhập nội vào VN với giá thành rất cao. Enzyme amylase, cellulose và protease là nhóm enzyme đƣợc ứng dụng rộng rãi trong rất nhiều lĩnh vực nhƣ công nghệ sản xuất rƣợu bia, công nghệ thực phẩm, y học, sản xuất thức ăn chăn nuôi… Vai trò chủ yếu của enzyme amylase, cellulase, protease chính là thủy phân tinh bột, cellulose và thủy phân liên kết peptide trong protein. Những enzyme này đƣợc trích ly từ các nguồn động vật, thực vật, vi sinh vật, vừa mang nguồn gốc tự nhiên vừa không độc với con ngƣời nên rất đƣợc ƣa chuộng và sử dụng rộng rãi. Trong ba nguồn kể trên sản xuất enzyme từ vi sinh vật là tối ƣu hơn cả, nguồn gốc dễ kiếm, dễ phân lập, số lƣợng tăng nhanh trong một thời gian ngắn, môi trƣờng tăng sinh sản xuất enzyme dễ kiếm, rẻ tiền (Nguyễn Đức Lƣơng, 2008). Do đó tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu một số đặc tính sinh học và tối ưu điều kiện nuôi cấy kích thích chủng Bacillus Licheniformis sinh tổng hợp đa enzyme (amylase, cellulase, protease) cao” nhằm tạo nguồn sản phẩm enzyme dồi dào, có chất lƣợng tốt phục vụ cho chăn nuôi
LỜI CẢM ƠN! Trong suốt trình thực đề tài em nhận đƣợc giúp đỡ nhiệt tình từ thầy giáo viên hƣớng dẫn, chị, bạn gia đình Để có đƣợc kết nhƣ ngày hơm nay, em xin tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Vũ Văn Hạnh – ngƣời trực tiếp bảo, hƣớng dẫn tạo điều kiện thuận lợi suốt trình thực đề tài Bên cạnh em xin gửi lời cảm ơn đến TS Vũ Kim Dung tạo điều kiện cho em đƣợc thực tập Viện Công nghệ sinh học – Viện Hàn Lâm Khoa Học Công nghệ Việt Nam Cơ tận tình giải đáp thắc mắc, khó khăn suốt q trình em thực đề tài Cũng xin gửi lời cám ơn đến chị, bạn cán công nhân viên chức thuộc phòng chất chức sinh học – Viện Công nghệ sinh học – Viện Hàn Lâm Khoa Học Công nghệ Việt Nam giúp đỡ, tận tình bảo tạo điều kiện thuận lợi cho em hồn thành khóa luận tốt nghiệp Em xin cám ơn gia đình, bạn bè động viên, giúp đỡ, chỗ dựa vức cho em an tâm thực đề tài Do thời gian có hạn, lực cịn nhiều hạn chế nên khó tránh khỏi thiếu sót Vì vậy, em kính mong nhận đƣợc bảo ý kiến góp ý quý thầy cô, bạn bè bạn đọc để báo cáo đƣợc hoàn thiện Một lần nữa, em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 14 tháng 05 năm 2018 Giáo viên hƣớng dẫn PGS.TS Vũ Văn Hạnh Sinh viên thực DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT B licheniformis Bacillus licheniformis CS Cộng VN Việt Nam DD Dung dịch MT Môi trƣờng KĐT Khô đậu tƣơng KLTN Khóa luận tốt nhiệp PTN Phịng thí nghiệm DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cơ chế tác động amylase lên tinh bột Hình 1.2 Cơ chế tác động cellulase lên endocellulose Hình 1.3 Vi khuẩn B.licheniformis (A) giai đoạn bào tử (B) 18 Hình 1.4 Khuẩn lạc B licheniformis hình thành mơi trƣờng thạch máu đĩa peptri Hình 1.5 Khuẩn lạc B licheniformis hình thành mơi trƣờng thạch đĩa (nhiệt độ 22oC) 19 Hình 1.6 Khuẩn lạc B licheniformis hình thành môi trƣờng thạch đĩa (nhiệt độ 37oC) 20 Hình 3.1 Khuẩn lạc B licheniformis hình thành mơi trƣờng thạch LB 37 Hình 3.2 Hình dạng tế bào chủng B.licheniformis 37 Hình 3.3 Kết đo giá trị mật độ quang (OD) glucose bƣớc sóng 540nm 38 Hình 3.4 Kết đo giá trị mật độ quang (OD) cellulose bƣớc sóng 540nm 38 Hình 3.5 Kết đo giá trị mật độ quang (OD) tyrosine bƣớc sóng 660nm 39 Hình 3.6 Ảnh hƣởng độ ẩm (%) giống (%) đến hàm lƣợng amylase 41 Hình 3.7 Ảnh hƣởng độ ẩm (%) giống (%) đến hàm lƣợng cellulase 42 Hình 3.8 Ảnh hƣởng độ ẩm (%) giống (%) đến hàm lƣợng protease 42 Hình 3.9 Mẫu thu mơi trƣờng HT sau lên men theo 45 Hình 3.10 Vịng phân giải tinh bột amylase thu MT HT nồng độ pha lỗng 500, 1000, 2000 lần 46 Hình 3.11 Vòng phân giải CMC cellulase thu MT HT nồng độ pha loãng 500, 1000, 2000 lần 46 Hình 4.2 Vịng phân giải casein protease thu MT HT nồng độ pha loãng 500, 1000, 2000, 3000 lần 46 19 DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Các thiết bị sử dụng nghiên cứu 25 Bảng 2.2 Tỉ lệ bổ sung chất dựng đƣờng chuẩn glucose 30 Bảng 2.3 Tỉ lệ bổ sung chất dựng đƣờng chuẩn maltose 31 Bảng 2.4 Tỉ lệ bổ sung chất dựng đƣờng chuẩn tyrosine 31 Bảng 2.5 Tỉ lệ bổ sung chất dung xác định hoạt độ amylase 32 Bảng 2.6 Tỉ lệ bổ sung chất dùng xác định hoạt độ cellulase 32 Bảng 2.7 Ảnh hƣởng tỉ lệ chất đến khả sinh tổng hợp đa enzyme 33 Bảng 2.8 Ảnh hƣởng nguồn muối khoáng đến khả sinh tổng hợp đa enzyme 34 Bảng 2.9 Ảnh hƣởng thời gian nuôi cấy đến khả sinh tổng hợp đa enzyme 35 Bảng 2.10 Ảnh hƣởng sau sấy đến hàm lƣợng enzyme 35 Bảng 3.1 Ảnh hƣởng tỉ lệ chất đến khả sinh tổng hợp đa enzyme 40 Bảng 3.2 Ảnh hƣởng nguồn muối khoáng đến khả sinh tổng hợp đa enzyme 44 Bảng 3.3 Ảnh hƣởng thời gian nuôi cấy đến khả sinh tổng hợp đa enzyme 44 Bảng 3.4 Ảnh hƣởng sau sấy đến hàm lƣợng enzyme 45 Bảng 3.5 Số lƣợng khuẩn lạc thu đƣợc sau nuôi cấy nồng độ 47 tƣơng ứng MỤC LỤC CHƢƠNG I TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Tổng quan enzyme 1.1.1 Giới thiệu enzyme 1.1.1.1 Giới thiệu amylase 1.1.1.2 Giới thiệu cellulase 1.1.1.3 Giới thiệu protease 1.1.2 Tính chất 1.1.2.1 Tính chất amylase 1.1.2.2 Tính chất cellulase 1.1.2.3 Tính chất protease 1.1.3 Ứng dụng .9 1.1.3.1 Ứng dụng amylase 1.1.3.2 Ứng dụng cellulase .9 1.1.3.3 Ứng dụng protease 10 1.1.4 Nguồn thu nhận enzyme 10 1.1.4.1 Nguồn thu nhận amylase 11 1.1.4.2 Nguồn thu nhận cellulase 11 1.1.4.3 Nguồn thu nhận protease 12 1.1.5 Một số mơi trƣờng ni cấy kích thích vi sinh vật sinh enzyme (amylase, cellulase, protease) 13 1.1.6 Một số nghiên cứu enzyme (amylase, cellulase, protease) giới nƣớc 15 1.1.6.1 Nghiên cứu enzyme amylase 15 1.1.6.2 Nghiên cứu enzyme cellulase .16 1.1.6.3 Nghiên cứu enzyme protease 16 1.2 Tổng quan vi khuẩn Bacillus licheniformis .17 1.2.1 Lịch sử nghiên cứu loài 17 1.2.2 Đặc điểm phân loại phân bố 17 1.2.3 Đặc điểm hình thái 17 1.2.4 Bào tử khả tạo bào tử .18 1.2.4.1 Bào tử 18 1.2.4.2 Khả tạo bào tử 18 1.2.5 Đặc điểm sinh hóa 19 1.2.6 Bộ gen 21 1.2.7 Bệnh học 21 1.2.8 Ứng dụng .22 CHƢƠNG II MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 2.1 Mục tiêu nghiên cứu .24 2.2 Nội dung nghiên cứu 24 2.3 Vật liệu nghiên cứu 24 2.3.1 Vi sinh vật 24 2.3.3 Hóa chất 24 2.3.4 Thiết bị dụng cụ 25 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu .25 2.4.1 25 2.4.1.1 Phƣơng pháp hoạt hóa B licheniformis .26 2.4.1.2 Phƣơng pháp giữ giống bảo quản 26 2.4.1.3 Phƣơng pháp nhuộm Gram 26 2.4.2 Phƣơng pháp xác định mật độ tế bào phƣơng pháp đếm khuẩn lạc 28 2.4.3 Nghiên cứu sinh tổng hợp đa enzyme từ chủng B licheniformis 29 2.4.4 Phƣơng pháp thu nhận, chiết tách xác định hoạt tính enzyme 29 2.4.5 Phƣơng pháp nghiên cứu ảnh hƣởng yếu tố lí hóa, dinh dƣỡng đến khả sinh tổng hợp enzyme chủng Bacillus licheniformis .33 2.4.6 Phƣơng pháp thu thập xử lý số liệu 35 CHƢƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 37 3.1 Một số đặc điểm sinh học Bacilus licheniformis 37 3.2 Ảnh hƣởng yếu tố tới trình sinh tổng hợp enzyme 38 3.2.1 Dựng đƣờng chuẩn 38 3.2.1.1 Dựng đƣờng chuẩn glucose .38 3.2.1.2 Dựng đƣờng chuẩn maltose .38 3.2.1.3 Dựng đƣờng chuẩn tyrosine 39 3.2.2 Ảnh hƣởng yếu tố đến sinh tổng hợp enzyme 39 3.3 Xác định mật độ tế bào phƣơng pháp đếm khuẩn lạc 47 CHƢƠNG IV KẾT LUẬN - KIẾN NGHỊ 48 4.1 Kết luận 48 4.2 Kiến nghị 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO LỜI MỞ ĐẦU Trong lĩnh vực công nghệ sinh học cơng nghệ sản xuất enzyme ngành quan trọng Enzyme chất xúc tác sinh học xúc tác cho phản ứng xảy thể sống, mà sau tách khỏi hệ thống sống, điều kiện định chúng giữ đƣợc hoạt tính xúc tác (Phạm Thị Trân Châu cs, 2007) Vì vậy, việc nghiên cứu ứng dụng sản phẩm enzyme đƣợc nhiều quốc gia triển khai, đặc biệt nƣớc phát triển nhƣ Mỹ, Đức, Nga, Trung Quốc đem lại lợi nhuận lớn Ở Việt Nam, công nghệ enzyme đƣợc nghiên cứu ứng dụng nhiều lĩnh vức nhƣng chƣa thực phát triển Các sản phẩm thƣơng mại có nguồn gốc enzyme chủ yếu theo đƣờng nhập nội vào VN với giá thành cao Enzyme amylase, cellulose protease nhóm enzyme đƣợc ứng dụng rộng rãi nhiều lĩnh vực nhƣ công nghệ sản xuất rƣợu bia, công nghệ thực phẩm, y học, sản xuất thức ăn chăn ni… Vai trị chủ yếu enzyme amylase, cellulase, protease thủy phân tinh bột, cellulose thủy phân liên kết peptide protein Những enzyme đƣợc trích ly từ nguồn động vật, thực vật, vi sinh vật, vừa mang nguồn gốc tự nhiên vừa không độc với ngƣời nên đƣợc ƣa chuộng sử dụng rộng rãi Trong ba nguồn kể sản xuất enzyme từ vi sinh vật tối ƣu cả, nguồn gốc dễ kiếm, dễ phân lập, số lƣợng tăng nhanh thời gian ngắn, môi trƣờng tăng sinh sản xuất enzyme dễ kiếm, rẻ tiền (Nguyễn Đức Lƣơng, 2008) Do tơi thực đề tài “Nghiên cứu số đặc tính sinh học tối ưu điều kiện ni cấy kích thích chủng Bacillus Licheniformis sinh tổng hợp đa enzyme (amylase, cellulase, protease) cao” nhằm tạo nguồn sản phẩm enzyme dồi dào, có chất lƣợng tốt phục vụ cho chăn nuôi CHƢƠNG I TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Tổng quan enzyme 1.1.1 Giới thiệu enzyme Enzyme (hay gọi men) chất xúc tác sinh học có thành phần protein Trong trình sống sinh vật xảy nhiều phản ứng hóa học, với hiệu suất cao, điều kiện bình thƣờng nhiệt độ, áp suất, pH Sở dĩ nhƣ có diện chất xúc tác sinh học đƣợc gọi chung enzyme Nhƣ vậy, enzyme protein xúc tác phản ứng hóa học Trong phản ứng này, phân tử lúc bắt đầu trình đƣợc gọi chất, enzyme biến đổi chúng thành phân tử khác Tất trình tế bào cần enzyme Enzyme có tính chọn lọc cao chất Hầu hết phản ứng đƣợc xúc tác enzyme có tốc độ cao nhiều so với khơng đƣợc xúc tác Có 4000 phản ứng sinh hóa đƣợc xúc tác enzyme Hoạt tính enzyme chịu tác động nhiều yếu tố Chất ức chế phân tử làm giảm hoạt tính enzyme, yếu tố hoạt hóa phân tử làm tăng hoạt tính enzyme 1.1.1.1 Giới thiệu amylase Amylase hệ Enzyme phố biển giới sinh vật Các enzyme thuộc nhóm enzyme thủy phân, xúc tác phân giải liên kết nội phân tử nhóm polysaccharide với tham gia nƣớc (Trần Bích Lam cs, 2009) Hình 1.1 Cơ chế tác động amylase lên tinh bột Amylase thủy phân tinh bột, glycogen dextrin thành glucose, maltose dextrin Các enzyme amylase có nƣớc bọt (cịn đƣợc gọi ptyalin), dịch tiêu hóa ngƣời động vật, hạt nảy mầm, nấm sợi, xạ khuẩn, nấm men vi khuẩn Trong nƣớc bọt ngƣời có ptyalin nhƣng số loại động vật có vú khơng có nhƣ ngựa, chó, mèo Ptyalin bắt đầu thủy phân tinh bột từ miệng q trình hồn tất ruột non nhờ amylase tuyến tụy (còn đƣợc gọi amylopsin) Amylase malt thủy phân tinh bột lúa mạch thành disaccharide làm chất cho trình lên men nấm men Amylase loại enzyme đƣợc ứng dụng rộng rãi công nghiệp, y tế, nhiều lĩnh vực kinh tế khác, đặc biệt ngành cơng nghiệp thực phẩm (Trần Bích Lam cs, 2009) 1.1.1.2 Giới thiệu cellulase Cellulose thành phần tế bào thực vật Vì vậy, có mặt loại rau quả, nguyên liệu, phế liệu ngành trồng trọt, lâm nghiệp Tuy nhiên ngƣời động vật khơng có khả phân hủy cellulose Nó có giá trị làm tăng tiêu hóa, nhƣng với lƣợng lớn trở nên vơ ích hay cản trở tiêu hóa Cellulase phức hệ enzyme có tác dụng thủy phân cellulose thơng qua việc thủy phân liên kết β 1-4 -glucoside cellulose thành đƣờng (Barkalow cs, 2014) Cellulase enzyme đƣợc sản xuất chủ yếu nấm, vi khuẩn protozoa xúc tác cho tan tế bào, phân hủy cellulose số polysaccharide liên quan (Worthington Biochemical Corporation, 2014) Chế phẩm cellulase thƣờng dùng để tăng chất lƣợng thực phẩm, trộn thức ăn gia súc tăng hiệu suất trích ly chất từ nguyên liệu thực vật 1.1.1.3 Giới thiệu protease Protease (còn đƣợc gọi proteinase hay peptidase) (EC.3.4) nhóm Enzyme thủy phân có khả cắt mối liên kết peptide (-CO~NH-) phân tử polypeptide, protein số chất khác tƣơng tự thành amino acid tự peptide phân tử thấp Trong phản ứng, protease khác có hƣớng xúc tác khác 1.1.2 Tính chất 1.1.2.1 Tính chất amylase Amylase nƣớc bọt (ptyalin): Chức phân giải tinh bột thành maltose dextrin Nó phân giải phân tử tinh bột lớn khơng hịa tan thành tinh bột hịa tan (amylodextrin, erythrodextrin, achrodextrin), tạo đoạn tinh bột nhỏ cuối maltose Ptyalin hoạt động mối liên kết α (1,4) glycosidic thẳng Amylase nƣớc bọt bị bất hoạt dày acid dày Trong dịch vị có pH 3,3, ptyalin bị bất hoạt hồn tồn vịng 20 phút 37°C Ptyalin cho vào pH 3.0 bất hoạt hoàn toàn 120 phút, nhiên, bổ sung tinh bột mức 0,1% có 10% enzym cịn hoạt động, bổ sung tƣơng tự tinh bột đến nồng độ 1,0% có khoảng 40% enzym hoạt động lại 120 phút (Trần Định Toại, Nguyễn Thị Văn Hân, 2005) Amylase tuyến tụy: amylase tụy phân cắt ngẫu nhiên liên kết α (1-4) glycosidic amylose tạo dextrin, maltose, maltotriose Nó thơng qua chế chuyển đổi với việc giữ cấu hình anomeric (Nguyễn Hữu Chấn, 1983) 1.1.2.2 Tính chất cellulase Cellulase thủy phân cellulose tự nhiên dẫn xuất nhƣ carboxylmethyl cellulose (CMC) hydroxyethyl cellulose (HEB) Cellulase cắt liên kết β -1,4 - glucosid cellulose, lichenin β - D - glucan ngũ cốc Bởi phân tử cellulose liên kết chặt chẽ với nhau, việc tách cellulose tƣơng đối khó khăn so với phân hủy polysaccharides khác nhƣ tinh bột (Barkalow cs) Độ bền nhiệt tính đặc hiệu chất khác Cellulase hoạt động pH từ 3-7, nhƣng pH tối thích khoảng 4-5 Nhiệt độ tối ƣu từ 40-50oC Hoạt tính cellulase bị phá hủy hoàn toàn 80oC 10-15 phút Cellulase bị ức chế sản phẩm phản ứng nhƣ glucose, cellobiose bị ức chế hồn tồn Hg Ngồi ra, cellulase cịn bị ức chế ... tăng sinh sản xuất enzyme dễ kiếm, rẻ tiền (Nguyễn Đức Lƣơng, 2008) Do tơi thực đề tài ? ?Nghiên cứu số đặc tính sinh học tối ưu điều kiện ni cấy kích thích chủng Bacillus Licheniformis sinh tổng hợp. .. ni cấy kích thích vi sinh vật sinh enzyme (amylase, cellulase, protease) 13 1.1.6 Một số nghiên cứu enzyme (amylase, cellulase, protease) giới nƣớc 15 1.1.6.1 Nghiên cứu enzyme amylase... lệ chất đến khả sinh tổng hợp đa enzyme 33 Bảng 2.8 Ảnh hƣởng nguồn muối khoáng đến khả sinh tổng hợp đa enzyme 34 Bảng 2.9 Ảnh hƣởng thời gian nuôi cấy đến khả sinh tổng hợp đa enzyme 35 Bảng
