Đánh giá tình hình lưu hành vi rút cúm gia cầm tại khu vực lân cận thành phố hồ chí minh và khả năng bảo hộ của vắc xin navet fluvac 2 đối với vi rút cúm gia cầm clade 2 3 2 1 TT

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH HUỲNH TẤN PHÁT ĐÁNH GIÁ TÌNH HÌNH LƯU HÀNH VI-RÚT CÚM GIA CẦM TẠI KHU VỰC LÂN CẬN THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH VÀ KHẢ NĂNG BẢO HỘ CỦA VẮC-XIN NAVET-FLUVAC ĐỐI VỚI VI-RÚT CÚM GIA CẦM CLADE 2.3.2.1 Chuyên ngành: Bệnh lý học Chữa bệnh vật ni Mã số: 9.64.01.02 TĨM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP TP HCM - Năm 2021 MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Bệnh Cúm gia cầm vi-rút H5N1 thể độc lực cao bệnh nguy hiểm gây thiệt hại nghiêm trọng cho ngành chăn nuôi gia cầm đe dọa tới sức khỏe cộng đồng Sự đa dạng lưu hành vi-rút Cúm gia cầm giai đoạn 2013 - 2015 làm cho dịch tễ bệnh Cúm gia cầm trở nên phức tạp, ảnh hưởng đến chiến lược sử dụng vắc-xin phòng bệnh Cúm gia cầm Việt Nam, có Thành phố Hồ Chí Minh tỉnh lân cận Tuy nhiên loại vắc-xin Re-1 Re-5 sử dụng trước bảo vệ phần vịt tiêm vắc-xin chống lại vi-rút chủng H5N1 độc lực cao clade 2.3.2.1a 2.3.2.1b (Nguyễn Văn Cảm, 2011) Vắc-xin Navet-Vifluvac với chủng NIBRG-14 Công ty Navetco bảo hộ gia cầm chống lại clade 2.3.2.1a 2.3.2.1c, khơng có hiệu vi-rút Cúm gia cầm thuộc phân nhóm 2.3.2.1b (Trần Xuân Hạnh, 2013) Để xây dựng biện pháp phòng, chống kiểm soát tốt, hiệu bệnh Cúm gia cầm địi hỏi phải có thơng tin cập nhật chủng vi-rút Cúm gia cầm lưu hành đánh giá hiệu bảo hộ vắc-xin chủng vi-rút Cúm gia cầm lưu hành thực địa Vắc-xin đa giá, phối hợp chủng vi-rút khác nhau, giải pháp gia tăng hiệu bảo hộ vắc-xin Cúm gia cầm biến chủng khác nhau, đối phó tình hình lưu hành phức tạp biến chủng vi-rút Cúm gia cầm Việt Nam, bao gồm nhánh 1.1, 2.3.2.1a, 2.3.2.1b, 2.3.2.1c vi-rút Cúm A/H5N6 Xuất phát từ yêu cầu trên, triển khai thực nghiên cứu: Đánh giá tình hình lưu hành vi-rút Cúm gia cầm khu vực lân cận Thành phố Hồ Chí Minh khả bảo hộ vắc-xin Navet-Fluvac vi-rút Cúm gia cầm clade 2.3.2.1 Mục tiêu luận án - Đánh giá tình hình lưu hành vi-rút Cúm gia cầm A/H5N1 Thành phố Hồ Chí Minh tỉnh lân cận, phục vụ cho công tác quản lý, kiểm soát lây truyền vi-rút Cúm gia cầm A/H5N1 khu vực khảo sát; - Xác định số đặc điểm lâm sàng, bệnh tích điển hình bệnh Cúm gia cầm type A H5N1 góp phần định hướng chẩn đoán lâm sàng phi lâm sàng bệnh Cúm gia cầm A/H5N1, giúp nâng cao hiệu công tác phòng chống bệnh Cúm gia cầm A/ H5N1; - Xác định phả hệ chủng vi-rút Cúm gia cầm lưu hành tương đồng di truyền với chủng vi-rút sử dụng thành phần vắc-xin Navet-Fluvac 2, góp phần làm rõ tiến hoá vi-rút Cúm gia cầm A/H5N1, cung cấp sở liệu cho nghiên cứu dịch tễ vắc-xin phòng bệnh vi-rút Cúm gia cầm A/H5N1, khu vực khảo sát, Việt Nam giới; - Đánh giá khả bảo hộ đàn gia cầm sau tiêm phòng vắc-xin Navet-Fluvac vi-rút Cúm gia cầm type A/H5N1, clade 2.3.2.1 phục vụ cho chiến lược tiêm phịng kiểm sốt bệnh Cúm gia cầm A/H5N1 đàn gia cầm khu vực khảo sát Những đóng góp khoa học Đây cơng trình nghiên cứu khoa học tình hình lưu hành chủng vi-rút Cúm gia cầm type A/H5N1 Thành phố Hồ Chí Minh tỉnh lân cận giai đoạn 2013 - 2015; xác định tính tương đồng di truyền chủng vi-rút Cúm gia cầm lưu hành với chủng vi-rút Cúm gia cầm sử dụng để làm vắc-xin Navet-Fluvac Đánh giá hiệu vắc-xin Navet-Fluvac vi-rút Cúm gia cầm type A/H5N1, clade 2.3.2.1 gà, vịt vịt trời Kết nghiên cứu Luận án góp phần khẳng định hiệu vắc-xin Navet-Fluvac thực tiễn Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn cho phép lưu hành, sử dụng rộng rãi nước Bố cục luận án Luận án dài 128 trang, gồm mở đầu (4 trang), tổng quan (37 trang), nội dung phương pháp nghiên cứu (19 trang), kết thảo luận (66 trang), kết luận đề nghị (2 trang), có 33 bảng, 35 hình biểu đồ, 150 tài liệu tham khảo phụ lục Trong tóm tắt Luận án này, chúng tơi trình bày từ Chương trở phần nội dung Chương NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Thời gian địa điểm Được thực từ năm 2014 đến 2019, Trạm Chẩn đoán Xét nghiệm Điều trị - Chi cục Chăn nuôi Thú y Thành phố Hồ Chí Minh, Trung tâm Nghiên cứu Thú y - Cơng ty cở phần Thuốc Thú y Trung ương Navetco, Xí nghiệp chăn nuôi gà, xã An Phú, huyện Củ Chi, Trại vịt Nghĩa, xã Tân An Hội, huyện Củ Chi, Trại vịt trời anh Du, xã An Phú, huyện Củ Chi 2.2 Nội dung nghiên cứu (1) Đánh giá tình hình lưu hành vi-rút Cúm gia cầm H5N1 Thành phố Hồ Chí Minh tỉnh lân cận (2) Nghiên cứu phả hệ chủng vi-rút Cúm gia cầm H5N1 phân lập với chủng vi-rút sử dụng thành phần vắc-xin Navet-Fluvac (3) Đánh giá hiệu bảo hộ vắc-xin Navet-Fluvac vi-rút Cúm gia cầm type A/H5N1, clade 2.3.2.1 2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Đánh giá tình hình lưu hành vi-rút Cúm gia cầm H5N1 - Phương pháp thu thập mẫu xét nghiệm trường hợp nghi ngờ mắc bệnh Cúm gia cầm H5N1: Trong thời gian thực nghiên cứu (năm 2013 - 2015), chúng tơi tiến hành phân tích mẫu 63 trường hợp gia cầm, thủy cầm, chim trĩ có triệu chứng nghi ngờ mắc bệnh Cúm gia cầm ủ rũ, bỏ ăn, mào, tích thâm tím, sệ cánh, liệt chân, chân xuất huyết, có triệu chứng thần kinh, 11 trường hợp hộ chăn ni địa bàn Thành phố Hồ Chí Minh 52 trường hợp từ tỉnh lân cận gởi mẫu chẩn đoán xác định nguyên nhân gia cầm bệnh, chết - Phương pháp đánh giá lưu hành vi-rút Cúm gia cầm type A Thành phố Hồ Chí Minh tỉnh lân cận: Khảo sát sở giết mở gia cầm Thành phố Hồ Chí Minh: Đàn gà từ tỉnh nhập sở giết mở gia cầm An Nhơn Thành phố Hồ Chí Minh xác định nguồn gốc vào Giấy chứng nhận kiểm dịch xuất tỉnh Chi cục Chăn nuôi Thú y tỉnh cấp, thực lấy mẫu theo Thông tư số 07/2016/TT-BNNPTNT: Thực đợt lấy mẫu/mỗi đợt lấy mẫu chọn ngẫu nhiên 60 nguồn gà (60 trại khác nhau, nguồn gốc ghi chứng nhận kiểm dịch xuất tỉnh) tỉnh Nghiên cứu tiến hành năm (2013, 2014 2015), năm lấy mẫu khảo sát đợt, đợt lấy 60 mẫu/nguồn gà nhập từ tỉnh Khảo sát hộ chăn nuôi nhỏ lẻ địa bàn Thành phố Hồ Chí Minh: Đàn gà, vịt hộ chăn nuôi nhỏ lẻ địa bàn huyện: Củ Chi, Hóc Mơn, Bình Chánh, Nhà Bè Cần Giờ, Thành phố Hồ Chí Minh: Thực đợt lấy mẫu để khảo sát lưu hành vi-rút Cúm gia cầm Nghiên cứu tiến hành năm (2013, 2014 2015), năm lấy mẫu khảo sát đợt, đợt lấy 30 mẫu gà 30 mẫu vịt/các huyện khảo sát 2.3.2 Phương pháp nghiên cứu phả hệ, biến đổi vi-rút Cúm gia cầm 2.3.2.1 Phương pháp giải trình tự phân tích gen HA Trong giai đoạn 2013 - 2015, nghiên cứu ghi nhận tất trường hợp gia cầm dương tính Cúm A/H5N1 hộ chăn ni địa bàn Thành phố trường hợp mẫu xét nghiệm dương tính với Cúm A/H5N1 người chăn ni tỉnh khảo sát gởi Trạm Chẩn đoán Xét nghiệm Điều Trị, Chi cục Chăn nuôi Thú y Thành phố Hồ Chí Minh Chọn ngẫu nhiên mẫu vi-rút Cúm gia cầm A/H5N1 theo nguyên tắc tỉnh, thành có mẫu, lồi gia cầm có mẫu để phân tích trình tự gien HA xây dựng sinh dịng với chủng tham khảo Các bước thực quy trình giải trình tự gien Các primer quy trình nhân gien HA Cúm gia cầm H5N1 để giải trình tự thực theo quy trình nội (không công bố) CSIRO Livestock Industries Australian Animal Health Laboratory, 2010 Gien HA khuếch đại theo đoạn HA 10 , HA 20, HA 30 HA 40 có kích thước tương ứng 358bp, 747bp, 741bp 741bp, sau giải trình tự nối lại thành gien HA hồn chỉnh có kích thước 1778 bp Kiểm tra kích thước sản phẩm khuếch đại phương pháp điện di thạch 1%, chọn mẫu có sản phẩm khuếch đại gien HA có kích thước phù hợp gởi đến Cơng ty Macrogen, Hàn Quốc giải trình tự gien 2.3.2.2 Phương pháp phân tích mức độ tương đồng với chủng tham chiếu Kết giải trình tự xử lý phân tích phần mềm Sequencher 5.4.6 (Genecodes) Trình tự nucleotide axít amin mẫu phân tích, so sánh với trình tự tham khảo công bố Ngân hàng gien phần mềm BioEdit 7.2.6 (Hall, 1999) Tiến hành phân tích trình tự axít amin vị trí cắt protein HA so sánh khác biệt chủng vi-rút Cúm gia cầm phân lập với chủng vi-rút Cúm gia cầm tham khảo 2.3.2.3 Phương pháp xây dựng phả hệ Trong số 51 mẫu cho kết dương tính với vi-rút Cúm A/H5N1, 26 mẫu chọn ngẫu nhiên giai đoạn 2013 - 2015 lưu hành Thành phố Hồ Chí Minh tỉnh vùng Đơng, Tây Nam Bộ giai đoạn 2013 - 2015, để phân tích trình tự gien HA xây dựng sinh dòng với chủng tham khảo Bảng 2.1 Danh sách chủng vi-rút Cúm A/H5N1 tham khảo STT Tên chủng 24 25 A/chicken/DL/NAVET 0292 (14)/2013 A/duck/Vietnam/BacNinh/NCVD17A261/2017 A/reassortant/USCDC_RG30 A/reassortant/NIBRG-14 A/duck/Vietnam/NCVD-1206/2012 A/duck/Vietnam/NCVD-1210/2012 A/duck/Vietnam/NCVD129-7/2011 A/duck/Vietnam/NCVD-672/2011 A/duck/Vietnam/NCVD-1544/2012 A/duck/Vietnam/NCVD-1584/2012 A/Vietnam/HN31432M/2008 A/duck/Vietnam/HU12-1542/2019 A/duck/Vietnam/HU12-1572/2019 A/chicken/Vietnam/NCVD-20/2007 A/Vietnam/UT31412II/2008 A/chicken/Vietnam/NCVD-016/2008 A/chicken/Vietnam/NCVD-03/2008 A/chicken/Vietnam/NCVD-093/2008 A/Vietnam/1194/2004 A/Viet_Nam/HN30408/2005 A/duck/Vietnam/OIE-0062/2012 A/Cambodia/S1211394/2008 A/muscovy_duck/Vietnam/OIE0043/2012 A/chicken/Lao/LH2/2010 A/Cambodia/V0219301/2011 26 A/duck/Hunan/8/2008 27 A/Hubei/1/2010 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 Loài mắc Năm phân lập Nơi phân lập Số đăng ký ngân hàng gien Gà 2013 Đắk Lắk - Vịt 2017 Bắc Ninh Vắc-xin Vắc-xin Vịt Vịt Vịt Vịt Vịt Vịt Người Vịt Vịt Vịt Người Gà Gà Gà Người Người Vịt Người 2012 2012 2011 2011 2011 2011 2008 2019 2019 2007 2008 2008 2008 2008 2004 2005 2012 2008 Việt Nam Việt Nam Việt Nam Việt Nam Việt Nam Việt Nam Việt Nam Việt Nam Việt Nam Việt Nam Việt Nam Việt Nam Việt Nam Việt Nam Việt Nam Việt Nam Việt Nam Việt Nam EPI424362 EPI425440 EPI425200 KR732414 EPI425931 EPI424984 HM114617 MT200019 MT200027 CY030383 HM114601 FJ842476 KR732465 FJ842480 EF541402 EF456803 AB727935 HQ200596 Ngan 2012 Việt Nam AB728619 Gà Người 2010 2011 CY098304 JN588806 Vịt 2008 GU182166 Người 2010 Lào Campuchia Trung Quốc Trung Quốc Gà 2011 Bangladesh JN795924 Gà 2018 Lào Trung Quốc Trung Quốc Hồng Kông Hồng Kông Trung Quốc MN453573 29 A/chicken/Bangladesh/11rs198430/2011 A/chicken/Laos/NL-1942888/2018 30 A/chicken/Hebei/A-8/2009 Gà 2009 31 A/Goose/Guangdong/1/96 Ngỗng 1996 32 33 A/Hong_Kong/156/97 A/Hong_Kong/6841/2010 Người Người 1997 2010 34 A/Hunan/1/2009 Người 2009 28 - CY098758 HM172081 AF144305 AF036356 HQ636461 CY098723 Tiến hành xây dựng phả hệ dựa trình tự nucleotide gien HA chủng vi-rút Cúm gia cầm H5N1 phân lập, với chủng vi-rút sử dụng làm vắc-xin, chủng vi-rút Cúm gia cầm lưu hành Việt Nam giới Các chủng vi-rút Cúm gia cầm H5N1 tham khảo phân lập từ nhiều nguồn vật chủ khác (người, gà, vịt, ngỗng,…) Việt Nam, Trung Quốc, Lào, Hồng Kông, Campuchia,… cơng bố Ngân hàng gien Trong có chủng vi-rút Cúm gia cầm H5N1 Việt Nam nhất, thuộc clade 2.3.2.1c, công bố Ngân hàng gien vào năm 2019: chủng A/duck/Vietnam/HU12-1542/2019 (MT200019) A/duck/Vietnam/HU12-1572/2019 (MT200027) Phân tích trình tự nucleotide gien HA xây dựng di truyền theo phương pháp Neighbor - Joining, phần mềm MEGA 6.06 Chỉ số bootstrap tính toán dựa 1000 lần lặp lại 2.3.3 Đánh giá hiệu bảo hộ vắc-xin Navet-Fluvac (clade 2.3.2.1) 2.3.3.1 Bố trí thí nghiệm đánh giá tính an tồn vắc-xin Navet-Fluvac * Trên gà Gà giống Lương Phượng, 250 con, tuần tuổi, khỏe mạnh, chưa tiêm phịng vắcxin Cúm gia cầm Gà ni Trung tâm Thú y, xã Nhuận Đức, huyện Củ Chi, Thành phố Hồ Chí Minh Gà tiêm vắc-xin lúc tuần tuổi chia làm lô sau: Bảng 2.2 Bố trí thí nghiệm đánh giá an tồn vắc-xin Navet-Fluvac gà Diễn giải Số lượng gà (con) Liều vắc-xin /con Số lần tiêm Vị trí, đường tiêm Lô ( Tiêm liều) 100 Lô (Tiêm liều) 1ml/con 1/3 phía sau cở, tiêm da Lô ( Đối chứng) 100 50 0,5ml/con (cách tuần) 1/3 phía sau cở, tiêm da - * Trên vịt - Vịt siêu thịt, 285 con, tuần t̉i, khỏe mạnh, chưa tiêm phịng vắc-xin Cúm gia cầm Vịt nuôi trại vịt Nghĩa, ấp mũi lớn 1, xã Tân An Hội, huyện Củ Chi, Thành phố Hồ Chí Minh Vịt chia làm lơ sau: Bảng 2.3 Bố trí thí nghiệm đánh giá an tồn vắc-xin Navet-Fluvac vịt Diễn giải Số lượng vịt (con) Liều vắc-xin/con Số lần tiêm Vị trí, đường tiêm Lơ ( Tiêm liều) Lô (Tiêm liều) Lô ( Đối chứng) 50 185 50 1ml/con 0,3ml/con - 1 - 1/3 phía sau cở, tiêm da 1/3 phía sau cở, tiêm da - * Trên vịt trời - Vịt trời, 100 con, tuần tuổi, khỏe mạnh, chưa tiêm vắc-xin Cúm gia cầm, nuôi Trại vịt trời Ơng Du, ấp Phú bình, xã An phú, huyện Củ Chi, Thành phố Hồ Chí Minh Vịt trời chia làm lô sau: Bảng 2.4 Bố trí thí nghiệm đánh giá an tồn vắc-xin Navet-Fluvac vịt trời Lô Lô Lô Diễn giải ( Tiêm liều) (Tiêm liều) ( Đối chứng) Số lượng vịt trời (con) Liều vắc-xin 20 60 20 1ml/con 0,3ml/con - Số lần tiêm 1 - 1/3 phía sau cở, 1/3 phía sau cổ, tiêm da tiêm da Các lô gà, vịt, vịt trời thí nghiệm đối chứng nuôi nhốt nhau, điều kiện nuôi dưỡng chăm sóc Sau tiêm theo dõi tuần, quan sát tình trạng sức khỏe tồn gia cầm lơ thí nghiệm, lơ đối chứng kiểm tra bệnh lý vị trí tiêm 2.3.3.2 Đánh giá hiệu lực vắc-xin NavetFluvac thực địa * Bố trí thí nghiệm đánh giá hiệu giá kháng thể gà Gà giống Lương phượng, 190 con, tuần tuổi, khỏe mạnh, chưa tiêm phòng vắcxin Cúm gia cầm Gà nuôi Trại gà Củ Chi 1, xã An Phú, huyện Củ Chi, Thành phố Hồ Chí Minh Thí nghiệm bố trí gồm lơ, bố trí sau: Vị trí, đường tiêm Sơ đồ 2.1 Bố trí thí nghiệm đánh giá đáp ứng kháng thể gà sau tiêm phòng vắcxin Navet -Fluvac * Bố trí thí nghiệm đánh giá hiệu giá kháng thể vịt Vịt siêu thịt, 235 con, tuần tuổi, khỏe mạnh, chưa tiêm phịng vắc-xin Cúm gia cầm, ni Trại vịt Nghĩa, xã Tân An Hội, huyện Củ Chi, Thành phố Hồ Chí Minh Thí nghiệm bố trí gồm lơ, bố trí sau: Sơ đồ 2.2 Bố trí thí nghiệm đánh giá đáp ứng kháng thể vịt sau tiêm phòng vắcxin Navet -Fluvac * Bố trí thí nghiệm đánh giá hiệu giá kháng thể vịt trời Vịt siêu thịt, 80 vịt trời, tuần tuổi, khỏe mạnh, chưa tiêm phịng vắc-xin Cúm gia cầm, ni Trại vịt trời Anh Du, xã An Phú, huyện Củ Chi, Thành phố Hồ Chí Minh Thí nghiệm bố trí gồm lơ, trí sau: Sơ đồ 2.3 Bố trí thí nghiệm đánh giá đáp ứng kháng thể vịt trời sau tiêm phòng vắc-xin Navet -Fluvac 2.3.3.3 Đánh giá bảo hộ vắc-xin phương pháp công cường độc Tại thời điểm nghiên cứu, chủng vi-rút Cúm gia cầm A/H5N1 clade 2.3.2.1a, 2.3.2.1b, 2.3.2.1c diện gây bệnh chủ yếu tỉnh khảo sát Vì nghiên cứu công cường độc đánh giá khả bảo hộ vắc-xin Navet-Fluvac thực với chủng vi-rút Cúm gia cầm A/H5N1, clade 2.3.2.1a, 2.3.2.1b, 2.3.2.1c tuỳ theo lồi vật thí nghiệm Địa điểm cơng cường độc thực Trung tâm nghiên cứu, Công ty Navetco, đánh giá an toàn sinh học cấp độ 3, đảm bảo an tồn sinh học tở chức thí nghiệm Cơng cường độc qua đường nhỏ mắt, nhỏ mũi với liều 106 EID50/con gà 107 EID50/con vịt (Đậu Huy Tùng ctv, 2012) * Bố trí thí nghiệm gà: Bảng 2.5 Bố trí thí nghiệm cơng cường độc gà tiêm vắc-xin Navet -Fluvac Thí nghiệm Thí nghiệm Thí nghiệm Thí nghiệm Thí nghiệm Số gà công cường độc Lô TN (gà tiêm mũi vắc-xin) 15 Clade vi-rút công cường độc 2.3.2.1a Lô ĐC (gà không tiêm vắc-xin) 2.3.2.1a Lô TN (gà tiêm mũi vắc-xin) 15 2.3.2.1b Lô ĐC (gà không tiêm vắc-xin) 2.3.2.1b Lô TN (gà tiêm mũi vắc-xin) 15 2.3.2.1c Lô ĐC (gà không tiêm vắc-xin) 2.3.2.1c Lô TN (gà tiêm mũi vắc-xin) 15 2.3.2.1c Lô ĐC (gà khơng tiêm vắc-xin) 2.3.2.1c Lơ thí nghiệm * Bố trí thí nghiệm vịt: Bảng 2.6 Bố trí thí nghiệm cơng cường độc vịt tiêm vắc-xin Nave Fluvac Thí nghiệm Thí nghiệm Thí nghiệm Thí nghiệm Lơ thí nghiệm Số vịt công cường độc Clade vi-rút công cường độc Lô TN (vịt tiêm mũi vắc-xin) 15 2.3.2.1a Lô ĐC (vịt không tiêm vắc-xin) 2.3.2.1a Lô TN (vịt tiêm mũi vắc-xin) 15 2.3.2.1b Lô ĐC (vịt không tiêm vắc-xin) 2.3.2.1b Lô TN (vịt tiêm mũi vắc-xin) 15 2.3.2.1c Lô ĐC (vịt không tiêm vắc-xin) 2.3.2.1c * Bố trí thí nghiệm vịt trời: Bảng 2.7 Bố trí thí nghiệm cơng cường độc vịt trời tiêm vắc-xin Navet Fluvac Số vịt trời Clade vi-rút Thí nghiệm Lơ thí nghiệm cơng cơng cường cường độc độc Lô TN (vịt trời tiêm mũi vắc-xin) 15 2.3.2.1c Thí nghiệm Lơ ĐC (vịt trời khơng tiêm vắc-xin) 2.3.2.1c 2.3.3.4 Bố trí thí nghiệm đánh giá độ dài miễn dịch Bảng 2.8 Bố trí thí nghiệm đánh giá độ dài miễn dịch Loài gia cầm Gà Vịt Lơ thí nghiệm Lơ TN1 Lơ TN2 Lơ ĐC Lơ TN Lơ ĐC Tiêm phịng mũi 15 15 15 - Tiêm Thời điểm lấy mẫu xét nghiệm phòng hiệu giá kháng thể mũi 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15 5 5 5 15 15 15 15 15 15 15 5 5 5 Công cường độc Không thực Thực cơng cường độc Đàn gà, vịt lơ thí nghiệm đối chứng nuôi điều kiện chăm sóc, ni dưỡng, lấy mẫu kiểm tra hiệu giá kháng thể sau tiêm phòng thời điểm tháng, tháng, tháng, tháng, tháng, tháng 2.4 Xử lý thống kê Các số liệu xử lý phân tích thống kê sinh học phần mềm MS Excel phần mềm thống kê Minitab phiên 16.2 (https://www.minitab.com/) Trắc nghiệm T dùng thí nghiệm đánh giá tính an tồn vắc-xin Navet-Fluvac gà, vịt vịt trời, so sánh hiệu giá kháng thể trước sau tiêm phòng vắc-xin Navet-Fluvac 13 năm 2013 nằm nhóm rõ ràng AIV thực tế có tiến hố hình thành biến chủng theo thời gian Trong số 26 chủng phát hiện, có chủng thuộc clade 1.1.2, clade xuất Việt Nam năm trở lại đây, tỉnh Đồng sông Cửu Long từ năm 2003 đến năm 2013 (Cục Thú y, 2014) Dựa phân tích phả hệ theo gien HA, chúng tơi ghi nhận chủng thuộc clade 1.1.2 phát nghiên cứu giai đoạn 2013 - 2015 gà: chủng A/Ga/TienGiang/2013, A/Ga/TayNinh/2014, A/Ga/LongAn/2014 Điều đáng lưu ý chủng nằm nhóm với chủng A/Cambodia/V0219301/2011, thuộc clade 1.1.2, phân lập Campuchia năm 2011, thời điểm phân lập chủng xảy trước thời điểm phát chủng vi-rút Cúm gia cầm đề tài, năm 2013 Như vậy, thấy nguy lây truyền xuyên biên giới chủng vi-rút Cúm gia cầm A/H5N1 thuộc clade 1.1.2 3.2.1.2 Phân tích trình tự axít amin điểm cắt protein HA thành HA1 HA2 Dựa theo kết phân tích trình tự axít amin vị trí cắt protein HA (HA1HA2) chủng vi-rút Cúm gia cầm A/H5N1 trình bày bảng 3.2 thấy khác biệt rõ ràng trình tự axít amin vị trí cắt gien HA chủng virút Cúm gia cầm sử dụng để công cường độc với chủng vi-rút vắc-xin Hai chủng vi-rút cúm sử dụng để cơng cường độc có - axít amin kiềm lặp lại, A/chicken/DL/NAVET 0292 (14)/2013 (PQRERRRKRG) A/duck/Vietnam/BacNinh/NCVD-17A261/2017 (PQRERRRKGG) vị trí cắt HA, vị trí cắt gien HA chủng vi-rút vắc-xin khơng có trình tự axít amin kiềm lặp lại, (PQGETX ) với chủng A/reassortant/USCDC_RG30, (PQRETX ) với chủng A/reassortant/NIBRG-14 Trong nghiên cứu Creanga ctv (2013), điểm phân cắt HA1/HA2 chủng vi-rút Cúm A/H5N1 thuộc clade 2.3.2.1a 2.3.2.1c Việt Nam theo motif QRERRRKR↓G, đa số chủng thuộc clade 2.3.2.1b theo motif QIERRRRKR↓G Dựa kết phân tích 26 chủng vi-rút nghiên cứu (Bảng 3.8) cho thấy, trừ chủng thuộc clade 1.1.2 (A/Ga/TienGiang/2013, A/Ga/LongAn/2014, A/Ga/TayNinh/2014) có trình tự axít amin kiềm lặp lại vị trí cắt HA RRKKR-, 23 chủng cịn lại, kể chủng A/Vit/TayNinh/2013 thuộc clade 2.3.2.1a có trình tự axít amin kiềm lặp lại vị trí cắt HA RRRKR Kết hoàn toàn trùng khớp với nghiên cứu Nguyễn Tiến Dũng (2008) phân loại OIE (2020), có biến đởi di truyền, thay đởi trình tự nucleotide gien HA axít amin protein HA chủng vi-rút Cúm gia cầm độc lực cao, dường biến đổi liên quan đến đặc tính kháng nguyên, dấu hiệu nhận diện, tương tác miễn dịch HA với hàng rào bảo vệ vật chủ biến đổi liên quan trực tiếp đến độc lực vi-rút Cúm gia cầm độc lực cao Tất 26 chủng virút Cúm gia cầm nghiên cứu chủng độc lực cao Bảng 3.2 Trình tự axít amin vị trí cắt gien HA (HA1-HA2) chủng vi-rút cúm gia cầm A/H5N1 đề tài TT 11 22 33 Chủng H5N1/VN A/chicken/DL/NAVET 0292 (14)/2013 A/duck/Vietnam/BacNinh/NCVD17A261/2017 A/reassortant/USCDC_RG30 Ghi Phân nhánh Công độc Cơng độc Vắc-xin Vị trí cắt (Cleavage site) 2.3.2.1c PQRERRRKRG 2.3.2.1c PQRERRRKGG 2.3.2.1a PQGETRG 14 TT Chủng H5N1/VN 44 55 66 77 88 99 10 111 112 113 A/reassortant/NIBRG-14 A/ChimTri/TienGiang/2013 A/ChimCut/TienGiang/2013 A/Vit/TayNinh/2013 A/Ga/TienGiang/2013 A/Vit/TPHCM-XTT/2013 A/Ga/LongAn/2014 A/ChimCut/TienGiang/2014 A/Vit/TayNinh/2014 A/Ga/TienGiang/2014 A/Ga/TPHCM-LongBinhQuan9/2014 A/Vit/BinhDuong/2014 A/Ga/TayNinh/2014 A/Ga/DongNai/2014 A/Vit/TienGiang/2014 A/Vit/LongAn/2014 A/Ga/BenTre/2014 A/Ga/TPHCM-XTT-HM/2014 A/Ga/BR-VT/2014 A/Vit/TPHCM-LongBinhQuan9/2015 A/Vit/LongAn/2015 A/Ga/TienGiang/2015 A/Ga/HoChiMinh/2015 A/ChimCut/DongNai/2015 A/Ga/LongAn/2015 A/ChimCut/TienGiang/2015 A/Vit/BenTre/2015 114 115 116 117 118 119 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 330 Vắc-xin * * * * * * * * * 2.3.2.1c 2.3.2.1c 2.3.2.1a 1.1.2 2.3.2.1c 1.1.2 2.3.2.1c 2.3.2.1c 2.3.2.1c Vị trí cắt (Cleavage site) PQRETRG PQRERRRKRG PQRERRRKRG PQRERRRKRG PQREERRKKRG PQRERRRKRG PQREERRKKRG PQRERRRKRG PQRERRRKRG PQRERRRKRG * 2.3.2.1c PQRERRRKRG * * * * * * * * 2.3.2.1c 1.1.2 2.3.2.1c 2.3.2.1c 2.3.2.1c 2.3.2.1c 2.3.2.1c 2.3.2.1c PQRERRRKRG PQREERRKKRG PQRERRRKRG PQRERRRKRG PQRERRRKRG PQRERRRKRG PQRERRRKRG PQRERRRKRG * 2.3.2.1c PQRERRRKRG * * * * * * * 2.3.2.1c 2.3.2.1c 2.3.2.1c 2.3.2.1c 2.3.2.1c 2.3.2.1c 2.3.2.1c PQRERRRKRG PQRERRRKRG PQRERRRKRG PQRERRRKRG PQRERRRKRG PQRERRRKRG PQRERRRKRG Ghi Phân nhánh (*): chủng vi-rút Cúm gia cầm A/H5N1 đề tài 3.2.2 Kết phân tích mức độ tương đồng với chủng tham chiếu Phân tích tương đồng di truyền dựa gien HA cho thấy (Bảng 3.2,), 26 chủng vi-rút Cúm gia cầm nghiên cứu có khác biệt di truyền tương đối thấp, khoảng 0,7 - 10,7% Sự khác biệt di truyền lớn (10,3 - 10,7%) chủng vi-rút thuộc clade 1.1.2 với chủng lại nghiên cứu thuộc clade 2.3.2.1c (22 chủng) 2.3.2.1a (1 chủng) Trong đó, khác biệt nucleotide 26 chủng AIV nghiên cứu với chủng tham khảo từ 0,6 - 12,0% Mặt khác, so sánh trình tự nucleotide gien HA 26 chủng AIV nghiên cứu, thu thập từ 2013 2015, với chủng AIV Việt Nam thuộc clade 2.3.2.1c công bố năm 2019, kết ghi nhận khác biệt mức thấp, khoảng 2,7 - 3,9% Điều đáng lưu ý khác là, 22 chủng thuộc clade 2.3.2.1c xếp chung nhóm, có mối quan hệ gần gũi với chủng A/HongKong/6841/2010 - gây bệnh người năm 2010 Hồng Kông, với tỷ lệ sai khác nucleotide từ 2,9% đến 3,4% Tỉ 15 lệ không khác biệt nhiều so với kết nghiên cứu Tiền Ngọc Tiên Lý Thị Liên Khai (2017), có tỉ lệ khác biệt trình tự nucleotide chủng từ tỉnh Đồng sông Cửu Long chủng A/HongKong/6841/2010 thấp 2,4% cao 3,2% Khi so sánh tương đồng di truyền 26 chủng vi-rút nghiên cứu với chủng vi-rút dùng công cường độc A/chicken/DL/NAVET 0292 (14)/2013 A/duck/Vietnam/BacNinh/NCVD-17A261/2017, thuộc clade 2.3.2.1c (Hình 3.1), dựa gien HA, nghiên cứu ghi nhận tương đồng cao, mức 89,3% đến 98,9% Sự khác biệt lớn trình tự nucleotide chủ yếu liên quan đến chủng vi-rút cúm A/H5N1 thuộc clade 1.1.2 (10,3 - 10,7%) Với 22 chủng thuộc clade 2.3.2.1c, tỷ lệ tương đồng nucleotide chủng vi-rút công cường độc A/chicken/DL/NAVET 0292 (14)/2013 A/duck/Vietnam/BacNinh/NCVD-17A261/2017 thực địa mức cao, khoảng 96,1 - 99,1% Tuy nhiên, phân tích di truyền xây dựng sinh dòng cho thấy chủng vi-rút dùng sản xuất vắc-xin Navet-Fluvac không nằm clade với chủng vi-rút Cúm A/H5N1 nghiên cứu Chủng AIV vắc-xin A/reassortant/USCDC_RG30 thuộc clade 2.3.2.1a, chủng AIV vắc-xin A/reassortant/NIBRG-14 thuộc clade Các chủng thuộc clade 1.1.2 tương đồng di truyền mức 89,7 - 89,8% với chủng AIV vắc-xin A/reassortant/USCDC_RG30, tương đồng cao với chủng AIV vắc-xin A/reassortant/NIBRG-14 mức 93,3 - 93,4% Điều dễ hiểu chủng AIV vắc-xin A/reassortant/USCDC_RG30 thuộc clade 2.3.2.1a, cịn chủng AIV vắc-xin A/reassortant/NIBRG-14 thuộc clade Nhìn chung, dựa gien HA, chủng AIV vắc-xin A/reassortant/USCDC_RG30 tương đồng di truyền cao, từ 95,0 - 96,0%, với phần lớn (22/26) chủng thực địa nghiên cứu thuộc clade 2.3.2.1c Trong tỷ lệ dao động khoảng 91,3 92,2% chủng AIV vắc-xin A/reassortant/NIBRG-14 chủng thực địa nghiên cứu (22/26) thuộc clade 2.3.2.1c Mặt khác so sánh tương đồng trình tự axít amin protein HA chủng vi-rút dùng sản xuất vắc-xin Navet-Fluvac với chủng vi-rút nghiên cứu (Bảng 3.8), đề tài ghi nhận tỷ lệ tương đồng cao chủng vắc-xin A/reassortant/USCDC_RG30 với chủng thực địa thuộc clade 2.3.2.1c (22 chủng) 2.3.2.1a (01 chủng), mức 91,9 - 97,5% Trong đó, tỷ lệ tương đồng đạt thấp chút chủng vắc-xin A/reassortant/NIBRG-14, dao động khoảng 92,1 - 96,6% Sự khác biệt tỷ lệ tương đồng nucleotide axít amin chủng vắc-xin chủng vi-rút cúm thực địa, ảnh hưởng đến hiệu việc tiêm phòng vắc-xin phòng bệnh Cúm gia cầm thực tế, tuỳ theo loại vắc-xin sử dụng đối tượng tiêm vắc-xin Khả bảo hộ vắc-xin Cúm gia cầm có khác biệt chủng vi-rút Cúm gia cầm với đặc điểm di truyền khác Hiệu bảo hộ cao chủng vi-rút vắc-xin tương đồng di truyền cao với chủng vi-rút công cường độc thực địa Criado ctv (2020) ghi nhận tỷ lệ sống sót thấp (0 đến 40%) gà sau tiêm vắc-xin Cúm gia cầm, bị cơng cường độc chủng vi-rút Cúm có độ tương đồng di truyền không cao, 87,2% đến 96,3% Tuy nhiên tác giả cho rằng, khơng có mối liên quan rõ ràng khác biệt di truyền miễn dịch bảo hộ, cịn tùy vào vị trí khác biệt khác biệt axít amin protein HA Nhiều tác giả cho rằng, việc phân tích 16 di truyền dựa nucleotide chưa đủ sở chắn để dự đoán hiệu miễn dịch bảo hộ Cúm gia cầm gà (Abbas ctv., 2011; Spackman ctv., 2014; Wang ctv., 2016) vịt (Van der Goot, 2008) Vắc-xin Cúm gia cầm có kháng nguyên tương đồng cao với chủng vi-rút công cường độc tạo đáp ứng miễn dịch tốt với hiệu giá kháng thể HI mức 7,2 log2 8,5log2 hiệu bảo hộ cao rõ (100 % gà sống sau công độc), so với chủng virút cơng cường độc có độ tương đồng thấp với hiệu giá kháng thể HI mức 2,3log2 3,4log2 62,5 - 80% gà sống sau công cường độc (Kang ctv., 2020) Nghiên cứu Criado ctv (2020) cho thấy, tương đồng trình tự axít amin chủng vi-rút vắc-xin vi-rút công cường độc khơng thể làm sở dự đốn cho hiệu bảo hộ vắc-xin Sự khác biệt hiệu miễn dịch vắc-xin Cúm gia cầm chủng công cường độc vi-rút Cúm gia cầm độc lực cao chủ yếu liên quan đến biến đởi trình diện kháng ngun vùng kháng nguyên A, B, C, D E protein HA vi-rút Cúm gia cầm thực địa Tuy nhiên, vài nghiên cứu khác lại ghi nhận mức tương đồng axít amin HA1 chủng vi-rút vắc-xin Cúm gia cầm chủng công cường độc vi-rút Cúm gia cầm độc lực cao có liên quan đến hiệu làm giảm thải chủng vi-rút công cường độc qua dịch hầu họng (Swayne ctv., 2000), khí quản (Lee ctv., 2004), qua phân (Swayne, 1999), hay ngăn chặn hồn tồn lây truyền chủng vi-rút cơng cường độc gà, vịt (Van der Goot ctv., 2008, Swayne, 1999) 3.2.3 Kết xây dựng phả hệ Đề tài tiến hành giải trình trình tự gien HA (H5) dựa gien phân tích sinh dòng phân lập vi-rút Cúm H5N1 so với chủng vi-rút Cúm A/ H5N1 vắc-xin, chủng vi-rút rút Cúm A/H5N1 sử dụng công cường độc so với chủng vi-rút Cúm A/H5N1 tham khảo giới 17 Hình Cây di truyền dựa trình tự nucleotide gen HA chủng AIV nghiên cứu Trong số 51 chủng vi-rút Cúm A/H5N1, 26 chủng chọn ngẫu nhiên giai đoạn 2013 - 2015 (số thứ tự đến 30, Bảng 3.8), để phân tích trình tự gien HA chủng vi-rút Cúm A/H5N1 lưu hành Thành phố Hồ Chí Minh tỉnh vùng Đơng Tây Nam Bộ giai đoạn 2013 - 2015, xây dựng sinh dòng với chủng tham khảo Các chủng vi-rút Cúm gia cầm H5N1 tham khảo phân lập từ nhiều nguồn vật chủ khác (người, gà, vịt, ngỗng,…) Việt Nam, Trung Quốc, Lào, Hồng Kông, Campuchia,… cơng bố Ngân hàng gien, có chủng vi-rút Cúm gia cầm H5N1 Việt Nam, thuộc clade 2.3.2.1c, công bố Ngân 18 hàng gien vào năm 2019: Chủng A/duck/Vietnam/HU12-1542/2019 (MT200019) A/duck/Vietnam/HU12-1572/2019 (MT200027) 3.3 Đánh giá khả bảo hộ vắc-xin Navet-Fluvac chủng vi-rút Cúm gia cầm clade 2.3.2.1 3.3.1 Đánh giá mức độ an toàn hiệu lực vắc-xin Navet-Fluvac gà 3.3.1.1 Đánh giá mức độ an toàn vắc-xin Navet-Fluvac gà Kết cho thấy đàn gà lô thí nghiệm đối chứng khỏe mạnh, vận động, ăn uống bình thường, với lơ thí nghiệm gà tiêm liều ml/con (gấp đôi liều định), khơng sưng vị trí tiêm Mở khảo sát gà tiêm vắc-xin thời điểm 21 ngày sau tiêm phịng ghi nhận, vị trí tiêm khơng bị tổn thương liều dùng ml 0,5 ml, tở chức xung quanh vị trí tiêm bình thường Kiểm tra tồn lưu vắc-xin vị trí tiêm ghi nhận có lượng nhỏ (vết) với gà tiêm liều ml/con, gà tiêm liều 0,5 ml/con không phát tồn lưu vắc-xin Thí nghiệm cho thấy khơng có khác biệt có ý nghĩa mặt thống kê trọng lượng đàn gà thí nghiệm lô đối chứng với P>0,05 3.2.1.2 Kết kiểm tra hiệu giá kháng thể gà Bảng 3.3 Đánh giá đáp ứng tạo kháng thể sau tiêm phòng gà theo quy trình tiêm mũi mũi vắc-xin Navet-Fluvac Lơ thí nghiệm Lơ TN (Tiêm mũi vắc - xin) Lô TN (Tiêm mũi vắc -xin cách 14 ngày) Đối chứng Số gà thí nghiệm Thời gian lấy mẫu Trước tiêm vắc-xin 100 tuần sau mũi Trước tiêm vắc-xin tuần sau 40 mũi tuần sau mũi Trước 50 sau tuần tiêm vắc-xin Số lượng mẫu 30 30 30 Số mẫu dương tính GMT (log2) - - 27 7,0 ±2,2 90%(+) - 30 18 30 27 10 - 4,8 ± 2,6a 60%(+) 7,2 ± 1,8b 90% (+) - 19 Đối với liệu trình tiêm phịng mũi vắc-xin Navet-Fluvac 2, thời điểm tuần sau tiêm vắc-xin, kết kiểm tra hiệu giá kháng thể HI đặc hiệu với vi-rút Cúm gia cầm A/H5N1 ghi nhận, có 27/30 mẫu phát kháng thể, chiếm tỷ lệ 90%, với GMT 7,0 log2 Đối với liệu trình tiêm phịng lặp lại mũi vắc-xin cách tuần, kết kiểm tra hiệu giá kháng thể HI thời điểm tuần sau tiêm phòng mũi cho thấy, số lượng gà có đáp ứng kháng thể 18/30 mẫu, chiếm tỷ lệ 60%, với GMT trung bình 4,8log2 Ở thời điểm tuần sau tiêm vắc-xin Navet-Fluvac mũi thứ 2, kết kiểm tra hiệu giá kháng thể HI đặc hiệu với vi-rút Cúm gia cầm A/H5N1 ghi nhận, có 27/30 mẫu phát kháng thể, chiếm tỷ lệ 90%, với GMT 7,2 log2 So sánh tỷ lệ gà có đáp ứng kháng thể hiệu giá kháng thể HI gà thí nghiệm thời điểm tuần sau tiêm phòng mũi tuần sau tiêm phòng mũi vắc-xin Navet-Fluvac cho thấy có khác biệt thống kê với P