Khảo sát đặc điểm men giống sử dụng trong sản xuất bánh men thuốc bắc tại phong điền, cần thơ 55

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG BỘ MÔN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM NGUYỄN THỊ THANH HỒNG KHẢO SÁT ĐẶC ĐIỂM MEN GIỐNG SỬ DỤNG TRONG SẢN XUẤT BÁNH MEN THUỐC BẮC TẠI PHONG ĐIỀN, CẦN THƠ LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP KỸ SƯ Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM Mã ngành: 08 Người hướng dẫn NGUYỄN CÔNG HÀ NGUYỄN BẢO LỘC LÂM THỊ VIỆT HÀ Cần Thơ - 2008 Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Trường Đại Học Cần Thơ Luận văn tốt nghiệp đính kèm tên đề tài “Khảo sát dặc điểm men giống sử dụng sản xuất bánh men thuốc bắc Phong Điền, Cần Thơ” sinh viên NGUYỄN THỊ THANH HỒNG thực thông qua hội đồng báo cáo luận văn Giáo viên hướng dẫn NGUYỄN CÔNG HÀ NGUYỄN BẢO LỘC Hội đồng phản biện Chuyên ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp Sinh Học Ứng Dụng LÂM THỊ VIỆT HÀ Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Trường Đại Học Cần Thơ LỜI CẢM TẠ Em xin chân thành cảm tạ: Quý thầy cô Trường Đại Học Cần Thơ đặc biệt Quý thầy cô Bộ Môn Công Nghệ Thực Phẩm nói riêng tận tâm giảng dạy, truyền đạt kiến thức kinh nghiệm quý báo cho em suốt năm học qua Đặc biệt em xin chân thành cảm ơn thầy Nguyễn Công Hà, thầy Nguyễn Bảo Lộc cô Lâm Thị Việt Hà - người tận tình hướng dẫn truyền đạt kinh nghiệm kiến thức để giúp em hoàn thành tốt luận văn tốt nghiệp ngành Công Nghệ Thực Phẩm Tập thể cán phịng thí nghiệm Bộ Mơn Cơng Nghệ Thực Phẩm, tập thể lớp Công Nghệ Thực Phẩm K29 giúp đỡ trao đổi kiến thức suốt thời gian học tập thực luận văn tốt nghiệp Cần Thơ, ngày 20 tháng 05 năm 2008 Sinh viên thực Nguyễn Thị Thanh Hồng Ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp Sinh Học Ứng Dụng i Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Trường Đại Học Cần Thơ TÓM LƯỢC Để cải tiến mặt chất lượng rượu đế Phong Điền, đề tài hướng tới mục tiêu: Đánh giá chất lượng men giống sử dụng sản xuất bánh men thuốc bắc Đề tài nhằm đề phương pháp cải tiến phù hợp nhất, thể nét đặc trưng bánh men thuốc bắc cho tổ hợp tác Phong Điền, Cần Thơ Phạm vi đề tài bao gồm thí nghiệm: - Khảo sát qui trình chế biến bánh men thuốc bắc Phong Điền, Cần Thơ - Phân lập, định danh loại nấm mốc có bánh men giống sử dụng sản xuất bánh men thuốc bắc Phong Điền, Cần Thơ - So sánh khả đường hóa lên men men giống sử dụng sản xuất bánh men thuốc bắc với loại bánh men thuốc bắc khác thị trường Qua trình thực hiện, tổng hợp kết thu nhận rút số kết luận sau: - Quá trình sản xuất bánh men cịn thủ cơng, chưa đảm bảo mặt chất lượng bánh men thành phẩm Sản xuất chủ yếu dựa vào kinh nghiệm khơng có thơng số tỉ lệ gạo: thuốc bắc: men giống bổ sung cụ thể nên áp dụng cho việc sản xuất qui mô lớn - Sau trình phân lập, đinh danh loại nấm mốc có men giống ta thu loài: Mucor racemosus Aspergillus restrictus - Khả đường hóa lên men men giống so với loại men sử dụng tổ hợp tác đạt hiệu suất trung bình Ngành cơng nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp Sinh Học Ứng Dụng ii Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Trường Đại Học Cần Thơ MỤC LỤC Y Z LỜI CẢM TẠ i TÓM LƯỢC .ii MỤC LỤC iii DANH MỤC BẢNG vi DANH MỤC HÌNH vii DANH MỤC HÌNH vii CHƯƠNG I GIỚI THIỆU 1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1.2 MỤC TIÊU THÍ NGHIỆM CHƯƠNG II LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 GIỚI THIỆU VỀ RƯỢU 2.1.1 Nguyên liệu sản xuất 2.1.2 Giới thiệu qui trình sản xuất rượu gạo truyền thống 2.1.3 Quá trình lên men rượu 2.1.3.1 Khái quát 2.1.3.2 Cơ chế trình lên men rượu 2.1.3.3 Động học trình lên men 2.1.3.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến trình lên men 2.1.3.5 Các sản phẩm phụ sản phẩm trung gian trình lên men rượu 10 2.2 BÁNH MEN THUỐC BẮC DÙNG TRONG SẢN XUẤT RƯỢU 12 2.2.1 Bánh men thuốc bắc dùng sản xuất rượu 12 2.2.1.1 Giới thiệu 12 2.2.1.2 Các thành phần chủ yếu bánh men thuốc bắc 12 2.2.1.3 Hệ vi sinh vật bánh men thuốc 13 2.2.2 Sản xuất bánh men rượu Việt Nam 16 2.3 SƠ LƯỢC VỀ HỆ THỐNG PHÂN LOẠI NẤM MỐC VÀ PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH DANH 19 2.3.1 Sơ lược hệ thống phân loại nấm mốc 19 Ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp Sinh Học Ứng Dụng iii Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Trường Đại Học Cần Thơ 2.3.2 Phân loại nấm 19 2.3.3 Một số nấm mốc thường gặp 20 2.3.3.1 Mucor 20 2.3.3.2 Rhizopus 21 2.3.3.3 Aspergillus 21 2.3.3.4 Penicillium 22 2.3.4 Phương pháp định danh 23 2.3.4.1 Các qui tắc 23 2.3.4.2 Qui trình định loại chủng nấm mốc (đối với nhiều chi nấm mốc) 23 CHƯƠNG III PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 3.1 PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU 26 3.1.1 Thời gian – địa điểm 26 3.1.2 Nguyên liệu – hóa chất – thiết bị 26 3.2 PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 27 3.2.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát qui trình chế biến bánh men thuốc bắc tổ hợp tác sản xuất rượu Phong Điền - Cần Thơ 27 3.2.2 Thí nghiệm 2: Phân lập, định danh loại nấm mốc có men giống sử dụng sản xuất bánh men thuốc bắc Phong Điền, Cần Thơ 28 3.2.3 Thí nghiệm 3: So sánh khả đường hóa lên men bánh men giống với loại men thuốc bắc khác thị trường 29 CHƯƠNG IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30 4.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát qui trình sản xuất bánh men thuốc bắc tổ hợp tác sản xuất rượu Phong Điền – Cần Thơ 30 4.2 Thí nghiệm 2: Phân lập, định danh loại nấm mốc có men giống sử dụng sản xuất bánh men thuốc bắc Phong Điền, Cần Thơ 35 4.2.1 Mucor racemosus 36 4.2.2 Aspergillus restrictus 39 4.3 Thí nghiệm 3: So sánh khả đường hóa lên men bánh men giống với loại men thuốc bắc khác thị trường 43 CHƯƠNG V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 46 5.1 Kết luận 46 5.2 Đề nghị 46 Ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp Sinh Học Ứng Dụng iv Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Trường Đại Học Cần Thơ TÀI LIỆU THAM KHẢO 47 PHỤ LỤC 48 PHỤ LỤC A MỘT SỐ HÌNH ẢNH DÙNG THAM KHẢO 48 PHỤ LỤC B CÁC PHƯƠNG PHÁP GIEO CẤY, PHÂN LẬP VSV 50 Kỹ thuật gieo cấy vi sinh vật 50 1.1 Cấy truyền từ ống nghiệm qua ống nghiệm khác 50 1.2 Gieo cấy thạch nghiêng 51 1.3 Cấy thạch hộp (đĩa Petri) 51 1.3.1 Dùng que cấy vòng cấy theo vết cạn dần 51 1.3.2 Dùng pipet 52 Phân lập giống vi sinh vật khiết 53 2.1 Phân lập canh trường vi sinh vật tập trung 53 2.2 Phân lập canh trường khiết 54 Thực tiêu quan sát nấm mốc kính hiển vi 55 3.1 Tiêu nhuộm sống 55 3.2 Tiêu thạch 55 PHỤ LỤC C CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 56 Phương pháp xác định nồng độ rượu theo phương pháp chưng cất 56 Xác định tổng hàm lượng tinh bột đường theo phương pháp thuỷ phân axit 56 Xác định hiệu suất thu hồi rượu 57 PHỤ LỤC D PHÂN TÍCH THỐNG KÊ 58 Ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp Sinh Học Ứng Dụng v Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Trường Đại Học Cần Thơ DANH MỤC BẢNG Bảng Thành phần gạo 100g Bảng Giới hạn hàm lượng ion nước Bảng Thành phần hóa học nấm men 14 Bảng Thời gian loại đặc điểm phân loại quan sát Môi trường Czapek, cao lúa mạch khoai tây Nhiệt độ: 25 ± 1oC 23 Bảng Kết so sánh tốc độ lên men loại men men giống 43 Bảng Kết so sánh hiệu suất lên men loại men sử dụng 45 Bảng Kết số liệu phân tích khả đường khử lên men loại men 58 Ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp Sinh Học Ứng Dụng vi Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Trường Đại Học Cần Thơ DANH MỤC HÌNH Hình Nấm men Saccharomyces cerevisiae 15 Hình Một số nấm mốc Mucor 20 Hình Nấm mốc Rhizopus 21 Hình Nấm mốc Aspergillus 22 Hình Nấm mốc Penicillium 22 Hình Sơ đồ thí nghiệm khảo sát khả lên men loại bánh men thuốc bắc 29 Hình Qui trình sản xuất bánh men thuốc bắc tổ hợp tác sản xuất rượu Phong Điền, Cần Thơ 30 Hình Mucor racemosus có sợi bơng màu xanh nhạt môi trường CDA 37 Hình Nang bào tử kín Mucor racemosus chụp vật kính 40X 37 Hình10 Trụ nang có phần phụ bao quanh gốc vỏ nang vỡ cịn sót lại 37 Hình 11 Nang bào tử kín cịn non 38 Hình 12 Bào tử áo có nhiều sợi nấm 38 Hình 13 Bào tử áo có hình cầu, hình trứng, cuống nang phân nhánh khơng 38 Hình 14 Bào tử kín phần lớn có hình elip 38 Hình 15 Aspergillus restrictus mơi trường CDA có màu xanh lục 40 Hình 16 Bọng đỉnh giá mang thể bình, đỉnh bọng hình cột 40 Hình 17 Cấu tạo bơng lớn với thể bình tầng nhuộm xanh metylen 40 Hình 18 Cấu tạo bơng Aspergillus restrictus trưởng thành vật kính 40X 41 Hình 19 Cấu tạo bơng Aspergillus restrictus cịn non 41 môi trường thạch sống vật kính 40X 41 Hình 20 Bào tử trần 41 Hình 21 Cấu tạo bọng hình cầu 41 Hình 22 Đồ thị thể hàm lượng đường tạo thành loại bánh men 43 Hình 23 Đồ thị thể hàm lượng tinh bột lại loại bánh men 44 Hình 24 Đồ thị thể thể tích rượu tạo thành loại men 45 Hình 25 Mucor racemosus f.racemosus Fres: 48 Hình 26 Bào tử trần máy mang bào tử trần lòai Aspergillus flavus Link ex Fries (loại máy mang bào tử trần có cuống thể bình): 49 Ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp Sinh Học Ứng Dụng vii Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Trường Đại Học Cần Thơ CHƯƠNG I GIỚI THIỆU 1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ Rượu đế thức uống có cồn phổ biến từ lâu đời gần trở thành sản phẩm cổ truyền đặc trưng dân tộc Cùng với phát triển khoa học, loại rượu truyền thống nghiên cứu cải tiến công nghệ sản xuất chất lượng ngày nâng cao Tuy nhiên, loại rượu mang nét đặc trưng vùng làm nên thương hiệu riêng cho sản phẩm Sản phẩm rượu đế Phong Điền mang nét đặc trưng riêng biệt, tạo nên thương hiệu nhiều người biết đến Tuy nhiên tình hình sản xuất rượu tổ hợp tác Phong Điền cần cải tiến để có sản phẩm rượu đạt tiêu chuẩn Việt Nam mặt chất lượng Nhìn chung trình sản xuất nét đặc trưng riêng qui định bới giống men sử dụng, nguồn nguyên liệu sản xuất (gạo), cách thức lên men Trong bánh men thuốc bắc góp phần quan trọng yếu tố cần quan tâm hàng đầu sản xuất rượu Hệ vi sinh vật (nấm mốc, nấm men, vi khuẩn) có bánh men thuốc bắc đóng vai trị quan trọng định thành cơng q trình lên men rượu Bánh men thuốc bắc sử dụng phổ biến lò sản xuất bánh men thuốc bắc diện gần hầu hết địa phương Mỗi loại bánh men có cách thức sản xuất khác nên hệ vi sinh vật có loại men khơng giống hoàn toàn số lượng chất lượng phụ thuộc vào kinh nghiệm người sản xuất Từ tầm quan trọng trình bày việc “khảo sát đặc điểm men giống sử dụng sản xuất bánh men thuốc bắc Phong Điền, Cần Thơ” góp phần hồn thiện qui trình sản xuất bánh men thuốc bắc đạt hiệu lên men tốt cho tổ hợp tác Phong Điền Góp phần nâng cao chất lượng rượu, tăng thu nhập cho người dân đa dạng hóa sản phẩm rượu đáp ứng nhu cầu người tiêu dùng 1.2 MỤC TIÊU THÍ NGHIỆM Xác định đặc điểm vi sinh men giống sử dụng sản xuất bánh men thuốc bắc tổ hợp tác Phong Điền, Cần Thơ Trên sở đề biện pháp nâng cao chất lượng mặt vi sinh cho men giống bổ sung góp phần hồn thiện qui trình sản xuất bánh men thuốc bắc, sử dụng trình sản xuất rượu địa phương Ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp Sinh Học Ứng Dụng Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Trường Đại Học Cần Thơ CHƯƠNG V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Qua q trình thực thí nghiệm, tổng hợp kết thu nhận chúng có số kết luận sau: Sản phẩm bánh men chưa đảm bảo điều kiện an toàn vệ sinh thực phẩm, chưa có điều kiện tối ưu nên dễ nhiễm tạp khuẩn trình sản xuất làm giảm chất lượng bánh men Quá trình sản xuất bánh men thuốc bắc người dân hợp tác xã có số tiêu khác với Nguyễn Văn Hiệu, 1992 như: độ ẩm khối bột nhào, nhiệt độ ủ, thời gian ủ Sản xuất thủ công nên tốn nhiều thời gian công sức, trang thiết bị đơn giản theo truyền thống nên dẫn đến hiệu sản xuất chưa cao Thí nghiệm phân lập lồi nấm mốc Aspergillus restrictus Mucor racemosus men giống Khả lên men rượu men giống (MG) so với loại men sử dụng tổ hợp tác (CT AT) mức độ trung bình khả đường hóa men giống thấp thể hàm lượng tinh bột lại sau ngày ủ mốc cao khảo sát với loại men CT AT 5.2 Đề nghị Cần cải tiến lại qui trình sản xuất bánh men Cần cung cấp thêm trang thiết bị máy nghiền búa, máy phối trộn, tủ ủ, tủ sấy máy đóng gói Có thể mở rộng sản xuất bánh men thuốc bắc qui mô xưởng thực nghiệm Xác định bổ sung lồi nấm mốc có men giống phương pháp hóa lý (máy quét định danh) để có kết xác Có thể sử dụng thêm số giống vi sinh vật có hiệu suất đường hóa lên men tốt viện nghiên cứu công nghệ sinh học nghiên cứu tìm thấy nhân giống Ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp Sinh Học Ứng Dụng 46 Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Trường Đại Học Cần Thơ TÀI LIỆU THAM KHẢO Bùi Xuân Đồng (2004), Nguyên lý phòng chống nấm mốc mycotoxin, NXB Khoa Học & Kỹ Thuật Bùi Thị Huỳnh Hoa (2004), Công nghệ sản xuất rượu bia nước giải khát, trường Đại Học Cần Thơ Lê Trần Công Huyến (1991), Sản xuất men thuốc bắc, trường Đại Học Cần Thơ Lê Thanh Mai (2006), Các phương pháp phân tích nghành cơng nghệ lên men, NXB Khoa Học Kỹ Thuật Ngô Thị Phương Dung (2007), Nghiên cứu tính ổn định hạt men giống khả ứng dụng sản xuất rượu nếp than, trường Đại Học Cần Thơ Nguyễn Lân Dũng (2001), Vi sinh vật học, NXB Giáo Dục Nguyễn Văn Kim (2000), Vi sinh học đại cương, trường Đại Học Cần Thơ Nguyễn Đức Lượng (2004), Công nghệ vi sinh vật – tập 1, 2, 3, trường Đại Học Kỹ Thuật TP Hồ Chí Minh Nguyễn Đức Lượng, Thực tập vi sinh vật học thực phẩm, trường Đại Học Bách Khoa Tp Hồ Chí Minh 10 Nguyễn Thị Pha Liên (2007), So sánh khả loại bánh men thuốc bắc thị trường thành phố Cần Thơ, trường Đại Học Cần Thơ 11 Nguyễn Thu Mai (2007), Phân lập định danh số loài Aspergillus hạt đậu phộng chợ Xuân Khánh, trường Đại Học Cần Thơ 12 Vũ Thị Minh Đức (2001), Thực tập vi sịnh vật học, NXB Đại Học Quốc Gia Hà Nội Ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp Sinh Học Ứng Dụng 47 Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Trường Đại Học Cần Thơ PHỤ LỤC PHỤ LỤC A MỘT SỐ HÌNH ẢNH DÙNG THAM KHẢO Hình 25 Mucor racemosus f.racemosus Fres: (= M racemosus Fres.) a – nang bào tử kín; b – trụ nang; c – bào tử kín; d – bào tử áo (Nguồn: Bùi Xuân Đồng, 2004) Ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp Sinh Học Ứng Dụng 48 Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Trường Đại Học Cần Thơ Hình 26 Bào tử trần máy mang bào tử trần loài Aspergillus flavus Link ex Fries (loại máy mang bào tử trần có cuống thể bình): A – Các thành phần máy mang bào tử trần sợi nấm; tế bào chân; giá bào tử trần; bọng đỉnh giá; cuống thể bình; thể bình; bào tử trần B – Bào tử trần C – Bộ máy mang bào tử trần trưởng thành khối bào tử trần hình tia tỏa trịn (Hình vẽ Nguyễn Huy Văn, 2000) (Nguồn: Bùi Xuân Đồng, 2004) Ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp Sinh Học Ứng Dụng 49 Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Trường Đại Học Cần Thơ PHỤ LỤC B CÁC PHƯƠNG PHÁP GIEO CẤY, PHÂN LẬP VSV Kỹ thuật gieo cấy vi sinh vật Gieo cấy trình đưa vật liệu nghiên cứu canh trường vi sinh vật vào môi trường thức ăn Gieo cấy thường nhằm mục đích sau: - Phát có mặt vi sinh vật vật liệu nghiên cứu - Để tạo canh trường vi sinh vật khiết từ nghiên cứu sâu - Phát triển lượng vi sinh vật khiết cách nhanh chóng (nhân giống vi sinh vật) - Cấy truyền từ canh trường cũ sang canh trường để giữ giống Yêu cầu gieo cấy phải đảm bảo hồn tồn vơ khuẩn để gieo cấy không bị nhiễm vi sinh vật khác Tốt tiến hành phịng vơ khuẩn tủ chun dung để gieo cấy Tuỳ yêu cầu tuỳ loại môi trường mà cách gieo cấy khác Sau cách hay dùng: 1.1 Cấy truyền từ ống nghiệm qua ống nghiệm khác Thường dùng que cấy vịng trình tự sau: - Đốt đền cồn lên - Tay trái cầm ống nghiệm: ống canh trường vi sinh vật ngồi, ống mơi trường trong, giữ ống nghiêng (nhưng không để mơi trường chạm vào nút bơng) ngón tay trỏ tựa lên ngón tay giữa, lịng bàn tay hướng lên - Dùng tay phải xoay lỏng nút - Tay phải cầm que cấy vô khuẩn đèn cồn Kẹp nút bơng ngón tay rút giữ tay lúc đậy lại - Đốt nóng miệng ống nghiệm đèn cồn - Đưa que cấy vào ống canh trường lấy canh trường vi sinh vật cấy vào ống môi trường Chú ý không để đầu que cấy chạm vào thành ống nghiệm - Rút que cấy ra, đốt miệng ống nghiệm nút đậy lại Nếu nút bị cháy đậy vào tự tắt, cịn phần ngồi dùng tay dập tắt - Để ống nghiệm vào giá, đốt que cấy đèn cồn để vào chỗ cũ - Dán nhãn lên ống môi trường gieo cấy, để tên vi sinh vật ngày gieo cấy Ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp Sinh Học Ứng Dụng 50 Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Trường Đại Học Cần Thơ Cách cấy chuyền nói tiến hành từ canh trường đặc (hoặc lỏng) sang môi trường đặc (hoặc lỏng) Nếu gieo cấy vào môi trường lỏng cấy ta cho phần que cấy mang giọt canh trường vi sinh vật mài nhẹ lên thành ống nghiệm gần chỗ có mơi trường, nghiêng ống nghiệm cho môi trường Khi gieo cấy canh trường lỏng, ngồi việc dùng que cấy cịn dùng pipet Pastơ, pipet thường chia độ Các pipet chuẩn bị làm vô khuẩn trước (rửa sạch, sấy khô, bọc giấy, tiệt khuẩn,…) Khi dùng tháo giấy dùng Dùng xong cắm pipet vào dung dịch khử khuẩn 1.2 Gieo cấy thạch nghiêng Thường dùng que cấy vịng, trình tự tiến hành giống (mục 1.1.1) sau lấy giọt canh trường vi sinh vào đầu que cấy rồi, ta tiếp tục sau: - Đưa đầu que cấy vào tận đáy ống mơi trường - Nhẹ nhàng hồ giọt canh trường vi sinh vật vào giọt nước ngưng tụ đáy - Nhẹ nhàng từ từ kéo đầu que cấy lên mặt thạch từ đáy lên theo kiểu sau: + Theo hình chữ chi (thường làm kiểu này) + Theo hình vịng xoắn + Theo vạch ngang song song + Theo đường thẳng + Theo chấm,… 1.3 Cấy thạch hộp (đĩa Petri) Có trường hợp 1.3.1 Dùng que cấy vịng cấy theo vết cạn dần Trình tự tiến hành sau: - Để hộp thạch lên bàn - Dùng que cấy lấy canh trường vi sinh vật theo trình tự u cầu vơ khuẩn trình bày phần - Tay trái mở nắp hộp vừa đủ đầu que cấy vào - Nhẹ nhàng nhanh chóng đưa đầu que cấy (đã có giọt canh trường vi sinh vật) lướt nhẹ mặt thạch theo kiểu sau: + Theo hình chữ chi lớn tồn bề mặt thạch hộp + Theo hình chữ chi nhỏ góc Ngành cơng nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp Sinh Học Ứng Dụng 51 Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Trường Đại Học Cần Thơ + Theo đường song song Trong trình gieo cấy, lượng vi sinh vật bị giảm dần theo đường cấy nên vi sinh vật phát triển, gần cuối đường số khuẩn lạc thưa dần 1.3.2 Dùng pipet Thường áp dụng định lượng phân lập vi sinh vật, cần gieo cấy lượng tương đối nhiều (1 – ml) vật gieo cấy lỏng Có thể tiến hành theo cách sau: * Cách 1: Trộn vật gieo cấy lỏng vào thạch trước đổ hộp Trình tự tiến hành sau: - Dùng đĩa Petri vô khuẩn, chưa có thạch - Đun chảy ống thạch, để nguội đến 50 – 55oC - Dùng pipet vô khuẩn hút lượng định vật gieo cấy cho vào ống thạch, đậy nút lại - Khẻ lắc ống thạch lăn bàn tay để trộn vật gieo cấy với thạch - Hé mở nắp đĩa, nhanh tay đổ thạch vào đĩa, đậy nắp lại xoay nhẹ thạch dàn đáy đĩa - Để yên cho thạch hoàn toàn đặc lại, lật ngược đĩa lại cho vào tủ ấm để nuôi * Cách 2: Trộn vật gieo cấy vào đĩa thạch Trình tự tiến hành sau: - Dùng đĩa Petri vơ khuẩn, chưa có thạch - Đun chảy ống thạch, để nguội đến 50 – 55oC - Dùng pipet vô khuẩn hút lượng định vật gieo cấy lỏng, mở đĩa, cho vào đĩa, nghiêng qua nghiêng lại xoay nhẹ đĩa để chúng dàn đáy đĩa - Hé mở nắp đĩa, nhanh tay đổ thạch vào, đậy nắp xoay nhẹ vài vòng bàn cho thạch vật gieo cấy trộn đồng thời dàn thành lớp đáy hộp - Để thạch đặc lại, lật ngược đĩa, cho vào tủ ấm * Cách 3: Dàn vật gieo cấy mặt thạch Trình tự tiến hành sau: - Dùng đĩa thạch vơ khuẩn - Dùng pipet lấy vật gieo cấy lỏng - Hé mở đĩa cho vật gieo cấy lên mặt thạch Ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp Sinh Học Ứng Dụng 52 Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Trường Đại Học Cần Thơ - Dùng que trang (bằng thủy tinh) dàn vật gieo cấy mặt thạch (que trang phải chuẩn bị trước: sạch, khô, bọc giấy, vô khuẩn) - Đậy nắp hộp, để yên lúc cho mặt thạch nước, quay ngược đĩa cho vào tủ ấm Phân lập giống vi sinh vật khiết Trong thiên nhiên vật phẩm dùng để nghiên cứu thường chứa hỗn hợp nhiều loài vi sinh vật khác nhau, ta nghiên cứu nhu cầu dinh dưỡng, trao đổi chất, di truyền học đặc tính khác ta có vi sinh vật khiết Vi sinh vật khiết giống vi sinh vật phát triển từ tế bào ban đầu riêng biệt Giống vi sinh vật khiết thường nhật từ canh trường vi sinh vật tập trung, canh trường thường có nhờ việc tạo điều kiện chọn lọc Vì muốn có giống khiết ta phải tiến hành làm hai bước: - Phân lập canh trường vi sinh vật tập trung - Sau phân lập vi sinh vật khiết 2.1 Phân lập canh trường vi sinh vật tập trung Canh trường vi sinh vật tập trung canh trường lồi (hoặc có vào loài) vi sinh vật xác định chiếm tỷ lệ cao hẳn loài khác số lượng Phương pháp chủ yếu để nhận canh trường vi sinh vật tập trung dùng môi trường chọn lọc hay điều kiện chọn lọc Tức mơi trường hay điều kiện ni cấy thuận lợi cho phát triển vi sinh vật mà không thuận lợi cho phát triển vi sinh vật Để có mơi trường chọn lọc ta thay đổi thành phần môi trường, pH môi trường vài loại nguồn dinh dưỡng nguồn cacbon nguồn nitơ Ví dụ: - Để tách vi sinh vật celluloza ta dùng mơi trường có nguồn cacbon celluloza - Để tách nấm mốc nấm men ta dùng mơi trường có hàm lượng đường cao pH thấp - Để tách vi sinh vật gây bệnh ta tiêm truyền qua súc vật thí nghiệm Nói chung, tuỳ đặc tính lồi vi sinh vật mà ta có nhiều mơi trường điều kiện chọn lọc khác Muốn phân lập loại cần tìm hiểu kỹ nhãng đặc tính sinh lý lồi trước Ngành cơng nghệ thực phẩm – Khoa Nơng Nghiệp Sinh Học Ứng Dụng 53 Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Trường Đại Học Cần Thơ 2.2 Phân lập canh trường khiết Canh trường khiết canh trường mà tất vi sinh vật sinh từ tế bào ban đầu Việc phân lập canh trường khiết bước vơ quan trọng q tình nghiên cứu vi sinh vật Có thể phân lập canh trường khiết từ vật phẩm nghiên cứu, tốt từ canh trường tập trung Phương pháp cấy môi trường đặc Nguyên tắc phương pháp tách khuẩn lạc riêng biệt môi trường đặc Trình tự tiến hành sau: - Đem vật phẩm (định để nghiên cứu) nghiền nhỏ: hoà lẫn pha loãng dần đến mức độ định ống nghiệm chứa nước cất nước muối sinh lý (0.85%) vô khuẩn Tuỳ trường hợp mà pha lỗng nhiều hay khơng pha lỗng Nói chung nên pha loãng trước để đảm bảo tế bào tách ròi gieo cấy khuẩn lạc dễ mọc tách biệt - Gieo cấy môi trường đặc đĩa Petri chuẩn bị trước (thạch đĩa vô khuẩn) theo cách sau: + Dùng que cấy vòng cấy theo vết cạn dần Chú ý cấy thưa đưa nhanh + Dùng que trang, dàn vật gieo cấy mặt đĩa thạch - Trộn vật gieo cấy vào ống thạch trước đổ vào đĩa (cách làm cụ thể trình bày phần gieo cấy Trong cách nêu cách sau hay dùng thường cho khuẩn lạc riêng biệt - Gieo cấy xong, nuôi điều kiện thích hợp cho lồi vi sinh vật định phân lập - Sau đến ngày đem quan sát chọn khuẩn lạc đứng tách biệt, dùng que cấy lấy vi sinh vật khuẩn lạc riêng biệt cấy chuyển lên ống thạch, khuẩn lạc cấy lên ống sau ni điều kiện thích hợp ta canh trường khiết Chú ý: + Nếu sau ngày, vi sinh vật chưa phát triển để lâu + Phải chọn khuẩn lạc thật riêng biệt Phương pháp phân lập môi trường đặc phương pháp thông dụng, dễ làm kết tương đối đảm bảo Nhưng gặp số nhược điểm sau: Ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp Sinh Học Ứng Dụng 54 Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Trường Đại Học Cần Thơ + Khuẩn lạc khơng phải phát sinh từ tể bào mà từ nhiều tế bào dính với + Các khuẩn lạc lúc mọc riêng biệt, qua thời gian ngắn lại dính liền với Để khắc phục nhược điểm đảm bảo canh trường hồn tồn khiết ta tiếp tục phân lập vài lần, đồng thời làm tiêu quan sát để kiểm tra đồng khuẩn lạc tách Thực tiêu quan sát nấm mốc kính hiển vi 3.1 Tiêu nhuộm sống Cho giọt cotton blue lên lame Sử dụng kim mũi giáo que cấy móc lấy một mảnh nhỏ thạch có khuẩn ty nấm Rửa bớt bào tử nấm cách đặt tơ nấm dung dịch nước xà phòng pha loãng, khuấy nhẹ Đặt sinh khối khuẩn ty rửa vào giọt cotton blue lame< dùng hai que cấy móc que cấy móc với kim mũi giáo tách rời sợi khuẩn ty dung dịch nhuộm Đậy lại lamellae Đặt tiêu lên bàn mang vật kính hiển vi tiến hành quan sát vật kính 10X 40X 3.2 Tiêu thạch Cắt mảnh thạch hình chữ nhật có kích thước ¼ kích thước lame, đặt lên lame Dùng que cấy nhọn chạm nhẹ lên phần đầu sợi nấm để lấy bào tử, sau cấy nấm cạnh hình chữ nhật, đậy phần thạch lại lamellae sạch, đặt lame vào đĩa Petri ủ nhiệt độ phòng Sau khoảng thời gian – ngày, lấy lame tiến hành quan sát đặc điểm vi học sợi nấm vật kính 10X Ngành cơng nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp Sinh Học Ứng Dụng 55 Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Trường Đại Học Cần Thơ PHỤ LỤC C CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH Phương pháp xác định nồng độ rượu theo phương pháp chưng cất Chuẩn bị bình tam giác 500 ml, lấy dịch lọc lên men 300 ml cho vào bình tam giác, đưa vào hệ thống chưng cất Bình tam giác đặt bếp điện Đầu cịn lại ống sinh hàn cơc thủy tinh dung để lấy rượu Ta tiến hành chưng cất đến rượu 100 ml ngừng Trong trình chưng cất ta điều chỉnh nhiệt độ bếp điện không cao ổn định nhiệt độ để trình chưng cất đạt hiệu Rượu sau chưng cất đem làm lạnh đến 20oC, đo độ rượu cồn kế ghi nhận kết Xác định tổng hàm lượng tinh bột đường theo phương pháp thuỷ phân axit Lấy 50 ml giấm chín cho vào bình tam giác 250 ml, thêm vào 50 ml nước cất ml HCl đậm đặc (hoặc 10 ml 25%), nối bình với ống sinh hàn khí dài 50 ml Mặt khác lấy 50 ml dịch lọc giấm chín cho vào bình khác, thêm nước axit mẫu giấm chưa lọc Sau nối ống sinh hàn khí, đặt hai bình tam giác vào nồi cách thủy đun sơi Tiếp làm nguội tới nhiệt độ phịng trung hồ NaOH 10% tới màu giấy quì chuyển sang màu xanh lơ Chuyển tồn dịch vào hai bình định mức 250 ml thêm nước tới ngấn bình, đem lọc qua giấy vào hai bình khơ khác Dịch lọc hai bình dung để xác định đường theo phường pháp khác Giả sử định phân 20 ml dung dịch K3Fe(CN)6 1% (20 ml dung dịch tương đương 25 mg glucoza) tốn hết a a0 ml dịch đường Hàm lượng đường cộng tinh bột sót giấm chín là: 0,025 × 250 12,5 ×100 = a × 50 a (g/100 ml) Ví dụ: a = 10 tổng tinh bột đường sót (chất khử) là: 12,5 = 1,25 g/100 ml 10 Tương tự giấm chín lọc định phân 20 ml ferixyanua kali 1% tiêu tốn a0 ml = 12,5 Như lượng chất khử sót 100 ml giấm chín lọc tính theo glucoza là: 12,5 g/100 ml = g/100ml 12,5 Hàm lượng tinh bột sót: (1,25 – 1,0) x 0.9 = 0,225 g/100ml Ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp Sinh Học Ứng Dụng 56 Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Trường Đại Học Cần Thơ Xác định hiệu suất thu hồi rượu Nguồn gluxit Tinh bột Lượng cồn thu từ 100kg Theo lít Theo kg 71,998 56,818 Hiệu suất thu hồi rượu tính theo cơng thức sau: H% = Tongdich × docon × 100 nguyenlieu × %tinhbot × 71,99 Trong đó: Tổng dịch = lượng nước chan + cơm Nguyên liệu = khối lượng gạo đem nấu cơm % tinh bột: lượng tinh bột có cơm, % tinh bột = 76% Cơm = (nguyên liệu + lượng nước dùng để nấu) x hiệu suất nấu Lượng nước dùng nấu = 1,5 x nguyên liệu Hiệu suất nấu = 84% Loại men Nước chan (g) Nguyên liệu (g) Hiệu suất nấu (%) Cơm (g) Tổng dịch (g) Độ cồn (%v/v) % tinh bột H(%) Men giống 1540 2800 7,3 62,27 Men AT 1540 600 84 1260 2800 7,0 76 59,71 Ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp Sinh Học Ứng Dụng Men CT 750 2010 12 73,48 57 Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Trường Đại Học Cần Thơ PHỤ LỤC D PHÂN TÍCH THỐNG KÊ Bảng Kết số liệu phân tích khả đường khử lên men loại men Bánh men Lặp lại Men giống Men AT Men CT (MG) (AT) (CT) Lượng đường tạo thành (g/100ml) 14,.3 8,7 4,8 Tinh bột sót (g/100ml) 10,2 3,2 Độ rượu (%v/v) 7,2 6,9 11,7 Lượng đường tạo thành (g/100ml) 16,9 12,1 5,6 Tinh bột sót (g/100ml) 9,0 1,8 7,2 Độ rượu (%v/v) 7,4 7,1 12,3 Chỉ tiêu phân tích Lần Lần Kết so sánh lượng đường tạo thành loại men ANOVA Table for duong tao by loai men Analysis of Variance Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 108.16 54.08 17.11 0.0229 Within groups 9.48 3.16 Total (Corr.) 117.64 Multiple Range Tests for duong tao by loai men -Method: 95.0 percent LSD loai men Count Mean Homogeneous Groups -CT 5.2 X AT 10.4 XX MG 15.6 X -Contrast Difference +/- Limits -AT - CT 5.2 5.65725 AT - MG -5.2 5.65725 CT - MG *-10.4 5.65725 -* denotes a statistically significant difference Ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp Sinh Học Ứng Dụng 58 Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Trường Đại Học Cần Thơ Kết so sánh lượng tinh bột sót loại men ANOVA Table for tinh bot sot by loai men Analysis of Variance Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 56.0133 28.0067 25.31 0.0132 Within groups 3.32 1.10667 Total (Corr.) 59.3333 Multiple Range Tests for tinh bot sot by loai men -Method: 95.0 percent LSD loai men Count Mean Homogeneous Groups -AT 2.5 X CT 8.1 X MG 9.6 X -Contrast Difference +/- Limits -AT - CT *-5.6 3.34788 AT - MG *-7.1 3.34788 CT - MG -1.5 3.34788 -* denotes a statistically significant difference Ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp Sinh Học Ứng Dụng 59 Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Trường Đại Học Cần Thơ Kết so sánh độ rượu tạo thành loại men ANOVA Table for ruou by loai men Analysis of Variance Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 31.4533 15.7267 214.45 0.0006 Within groups 0.22 0.0733333 Total (Corr.) 31.6733 Multiple Range Tests for ruou by loai men -Method: 95.0 percent LSD loai men Count Mean Homogeneous Groups -AT 7.0 X MG 7.3 X CT 12.0 X -Contrast Difference +/- Limits -AT - CT *-5.0 0.861811 AT - MG -0.3 0.861811 CT - MG *4.7 0.861811 -* denotes a statistically significant difference Ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp Sinh Học Ứng Dụng 60 ... nấm mốc có bánh men giống sử dụng sản xuất bánh men thuốc bắc Phong Điền, Cần Thơ - So sánh khả đường hóa lên men men giống sử dụng sản xuất bánh men thuốc bắc với loại bánh men thuốc bắc khác... mốc có men giống sử dụng sản xuất bánh men thuốc bắc Phong Điền, Cần Thơ Sau trình tiến hành phân lập định danh loại nấm mốc có men giống sử dụng sản xuất bánh men thuốc bắc Phong Điền, Cần Thơ. .. người sản xuất Từ tầm quan trọng trình bày việc ? ?khảo sát đặc điểm men giống sử dụng sản xuất bánh men thuốc bắc Phong Điền, Cần Thơ? ?? góp phần hồn thiện qui trình sản xuất bánh men thuốc bắc đạt