Tìm hiểu hoạt tính enzim amilaza ở vi khuẩn bacillus subtilis

Lời cảm ơn Trong trình thực đề tài này, nhận giúp đỡ quý báu, bảo tận tình thầy giáo, gia đình, bạn bè Đầu tiên tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy giáo Nguyễn Dương Tuệ, người thầy ln tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tơi suốt q trình nghiên cứu hồn thành đề tài Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo tổ môn Di truyền - Vi sinh - Phương pháp giảng dạy, giáo viên phụ trách, kĩ thuật viên phịng thí nghiệm tạo điều kiện sở vật chất hướng dẫn, giúp dỡ đóng góp ý kiến cho tơi suốt q trình thực đề tài Xin cảm ơn gia đình bạn bè hỗ trợ thiết thực cho tinh thần, vật chất cơng sức để tơi hồn thành tốt đề tài Trong q trình thực đề tài, thời gian kinh nghiệm hạn chế nên đề tài khơng tránh khỏi thiếu sót nội dung hình thức, mong nhận góp ý thầy, giáo, bạn bè để đề tài hoàn thiện Vinh, tháng năm 2011 Sinh viên Mai Thị Phương MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Amylaza enzim xúc tác thuỷ phân tinh bột polyose tƣơng tự nhƣ dextrin, glicogen (Windish Mhatre, 1965) Nhóm enzim ngày đƣợc ứng dụng rộng rãi công nghiệp bánh mì, thực phẩm, dệt giấy (Pandey cộng sự, 2000) chiếm khoảng 25% nguồn enzim thị trƣờng, enzim amylaza gần nhƣ thay cho công nghiệp thuỷ phân tinh bột phƣơng pháp hoá học (Pandey cộng sự, 2000) Trong hệ enzim này, ỏ - amylaza enzim xúc tác thuỷ phân liên kết ỏ - 1,4 - glucozit nội mạch, sản phẩm thuỷ phân tinh bột chủ yếu dextrin phân tử thấp không cho phản ứng màu với iôt maltose Đây nhóm enzim tƣơng đối bền vững với tác dụng nhiệt, đặc biệt ỏ - amylaza vi khuẩn có tính bền nhiệt cao, chúng giữ đƣợc hoạt tính 70 - 90oC [12] Nhờ đặc tính mà ỏ - amylaza vi khuẩn đƣợc dùng dịch hoá tinh bột, làm giảm độ nhớt dịch hồ, đƣợc dùng sản xuất đƣờng mật ngô sôcôla, sản xuất bia, sản xuất dextrin với dịch đƣờng để sản xuất thức ăn giành cho ngƣời già trẻ nhỏ, dùng để sản xuất nƣớc đƣợc sử dụng rộng rãi y học Trong cơng nghệ đƣờng hóa tinh bột thay malt để sản xuất rƣợu, bia, mạch nha, bánh kẹo… Qua nhiều cơng trình nghiên cứu, nhiều chủng vi khuẩn có khả sinh tổng hợp amylaza có ý nghĩa công nghiệp đƣợc tuyển chọn nhƣ Bacillus subtilis, Bacillus licheni formis, Bacillus amyloliquefaciens, Aspergillus oryzae [12] Theo mô tả khoá phân loại Bergey, vi khuẩn Bacillus subtilis loài thuộc chi Bacillus thuộc họ Bacillacaea Bacillus subtilis trực khuẩn gram dƣơng có kích thƣớc (2 - 3) * (0,7 - 0,8) micromet, nội bào tử trung tâm có kích thƣớc 1,5 - 1,8 * 0,8 micromet, điều kiện 100oC bào tử Bacillus subtilis chịu đƣợc 180 phút, có tính ổn định cao với nhiệt độ thấp khô cạn, tác động hoá chất tia xạ Bacillus gồm nhiều chủng nhƣ: subtilis I - 168, DB 110,…trong chủng Bacillus subtilis đƣợc sử dụng nhiều đƣợc nghiên cứu tƣơng đối đầy đủ đặc tính sinh lý, sinh hố di truyền với toàn genome đƣợc xác định So với E.coli, Bacillus subtilis vi khuẩn gram dƣơng sinh bào tử không gây bệnh không chứa độc tố Tuy nhiên chúng có nhƣợc điểm là: Plasmit tái tổ hợp chứa ADN ngoại lai thiếu bền vững nên việc biểu Bacillus subtilis thƣờng yêu cầu tái tổ hợp vào NST Do đó, để khảo sát đặc tính enzim ngƣời ta thƣờng lựa chọn biểu E.coli trƣớc sau sản xuất prơtêin lƣợng lớn chuyển sang hệ thống biểu Bacillus subtilis Sử dụng amylaza Bacillus subtilis cần thiết vì: - Vi khuẩn sinh trƣởng, phân bào nhanh (20 - 60 phút/thế hệ) chứng tỏ khả tổng hợp enzim lớn - Có thể ni cấy thu nhận enzim thời điểm - Enzim có hoạt tính mạnh enzim động vật, thực vật - Thay malt (phải nhập nội từ vào) tốn - Có thể điều khiển tối ƣu hóa cơng nghệ đƣờng hóa Đặc biệt vi khuẩn đƣợc sử dụng nhiều thị trƣờng Mỹ, Pháp, Đức thành phố Hồ Chí Minh - Việt Nam có hãng liên doanh với Mỹ sản xuất sinh khối vi khuẩn phục vụ công nghệ lên men, xử lý mơi trƣờng Vì chúng tơi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Tìm hiểu hoạt tính enzim amilaza vi khuẩnBacillus subtilis” để hiểu rõ nhƣ ứng dụng đời sống Mục tiêu đề tài Do thấy đƣợc vai trò quan trọng enzim amilaza Bacillus subtilis nên tiến hành nghiên cứu đề tài nhằm: - Nghiên cứu đặc điểm sinh học vi khuẩn - Nghiên cứu yếu tố ảnh hƣởng đến sinh trƣởng vi khuẩn - Thử nghiệm khả biến đổi enzim lên chất - Tìm điều kiện tối thích cho hoạt động enzim từ sản xuất sinh khối ứng dụng vào thực tiễn - Rèn luyện cho thân số kỹ làm thí nghiệm đồng thời làm quen với phƣơng pháp nghiên cứu khoa học Nhiệm vụ đề tài Để đạt đƣợc mục tiêu trên, nhiệm vụ đề tài gồm: - Thu thập xử lý bảo quản mẫu - Pha chế môi trƣờng nuôi cấy phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis khiết -Làm thí nghiệm ảnh hƣởng số yếu tố mơi trƣờng đến hoạt tính enzim từ tìm điều kiện tối ƣu để sử dụng có hiệu -Khả dĩ ứng dụng enzim thực tiễn đời sống CHƢƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung enzim 1.1.1 Định nghĩa Enzim hợp chất tự nhiên có khả xúc tác phản ứng sinh hóa Enzim có hoạt tính xúc tác sinh học Các enzim xúc tác cho 400 phản ứng hoá học khác nhau, đảm bảo cho q trình chuyển hố chất thể sống tiến hành với tốc độ cao nhịp nhàng, cân đối theo chiều hƣớng xác định Nhờ enzim mà đảm bảo cho trao đổi thƣờng xuyên thể sống tạo nhiều sản phẩm cơng nghệ Enzim có chất protein ARN từ năm 2000, Cech T năm 2005 Lilley D cho thấy số phân tử ARN có khả xúc tác Đó enzim Ribozyme xúc tác chuyển pro ARN thành mARN Enzim vi sinh vật Ngƣời ta thu nhận enzim từ nguồn khác nhƣ từ động vật, thực vật, vi sinh vật Tuy nhiên so với enzim động vật, thực vật enzim vi sinh vật nguồn enzim phong phú nhất, có hầu hết lồi vi sinh vật nhƣ nấm mốc, vi khuẩn số lồi nấm men Có thể nói vi sinh vật nguồn nguyên liệu thích hợp để sản xuất enzim quy mô lớn dùng công nghệ đời sống Dùng nguồn vi sinh vật có lợi ích nhƣ sau: - Chủ động ngun liệu ni cấy vi sinh vật giống vi sinh vật - Chu kỳ sinh trƣởng vi sinh vật ngắn - 100 nên thu hoạch nhiều lần năm đặc biệt vi khuẩn thời gian hệ ngắn nên khả tổng hợp enzim lớn - Có thể điều khiển sinh tổng hợp enzim dễ dàng theo hƣớng có lợi (định hƣớng sử dụng tăng hiệu suất tổng thu hồi) - Giá thành tƣơng đối thấp mơi trƣờng ni cấy tƣơng đối rẻ, đơn giản, dễ tổ chức sản xuất Tuy nhiên số trƣờng hợp cần lƣu ý khả sinh độc tố nên phải phân lập chủng thích hợp Để sản xuất chế phẩm enzim, ngƣời ta phân lập giống vi sinh vật có tự nhiên giống đột biến có lựa chọn theo hƣớng có lợi , tổng hợp ƣu loại enzim định cần thiết Vai trị enzim vi sinh vật Enzim có động vật, thực vật, vi sinh vật nhƣng vi sinh vật ƣu Nó sinh sản, phân bào nhanh, đặc biệt vi khuẩn E.coli 20 – 60 phút hệ Đáng ý vi khuẩn có enzim nội bào ngoại bào nên đƣợc ứng dụng nhiều công nghệ - Enzim ngoại bào: Là chất hoạt động bên tế bào Hầu hết chất có khối lƣợng phân tử lớn xuyên qua màng tế bào thực phẩm, khống chất thơ sơ nhƣ polisaccharic, lipid protein cần làm thối hóa thành phân tử có trọng lƣợng phân tử thấp trƣớc chúng chuyển vào tế bào Vì phản ứng liên quan với nhau, enzim ngoại bào chủ yếu enzim thủy phân khử khống chất có khối lƣợng phân tử cao vào khối xây dựng chúng cách tạo khối phân tử ngậm nƣớc Điều giúp phóng thích phân tử nhỏ hơn, đƣợc vận chuyển vào tế bào tiêu hóa - Enzim nội bào: bên trrong tế bào chịu trách nhiệm tổng hợp điều kiện tất yếu chất nguyên sinh tạo lƣợng tế bào từ tiêu hóa khống chất Khả chất dinh dƣỡng thấm qua màng tế bào có mặt nhiều nội tế bào có khả biến đổi chất hóa học thành khống chất Sự biến đổi cần thiết cho tồn lâu dài chức tế bào tảng cho chuyển hóa tế bào Nhƣ kết q trình chuyển hóa, sản phẩm q trình chuyển hóa đƣợc hình thành đào thải khỏi tế bào vào môi trƣờng Sự phân tích sản phẩm cuối khơng giúp cho xác định hệ thống enzim lồi mà cịn định danh, phân tách phân loại vi khuẩn Chọn vi khuẩn Bacillus subtilis loại đƣợc ý đặc biệt để sản xuất enzim 1.1.2 Đặc tính xúc tác enzim: Enzim có đặc tính chung nhƣ sau: + Enzim đƣợc tạo tế bào vi sinh vật: trình tổng hợp enzim phức tạp đƣợc kiểm soát chặt chẽ + Enzim tham gia phản ứng tế bào sống tách khỏi thể sống + Enzim tham gia phản ứng điều kiện nhiệt độ ôn hồ Vì q trình sống tế bào, enzim đƣợc tổng hợp hoạt động điều kiện nhiệt độ tế bào nhiệt độ thể Nhiệt độ tế bào nhiệt độ thể thƣờng thấp (khoảng 30-400C) + Enzim tham gia xúc tác phản ứng thể từ giai đoạn đầu đến giai đoạn giải phóng hồn tồn lƣợng dự trữ hợp chất hoá học Quá trình đƣợc thực theo chuỗi phản ứng đƣợc xúc tác loại enzim, cuối tạo thành CO2, H2O, số chất khác giải phóng lƣợng Trong chuỗi phản ứng, sản phẩm phản ứng trƣớc chất cho phản ứng sau + Enzim thực phản ứng Các phản ứng xảy tế bào + Phản ứng enzim phản ứng tiêu hao lƣợng Trong phản ứng hố học đƣợc xúc tác chất xúc tác hoá học đòi hỏi lƣợng lớn + Enzim chịu điều khiển gen điều kiện phản ứng Gen định tổng hợp loại enzim, enzim định phản ứng sinh hoá Gen định chất sinh học chất hoá học enzim + Enzim hồ tan nƣớc, dung dịch muối lỗng nhƣng khơng tan dung mơi khơng phân cực Dung dịch enzim có tính chất dung dịch keo ƣa nƣớc Khi hồ tan enzim vào nƣớc, phân tử lƣỡng cực nƣớc kết hợp với ion, nhóm ion nhóm phân cực phân tử enzim tạo thành lớp vỏ hidrat Lƣợng nƣớc hidrat lớn có vai trị quan trọng phản ứng sinh hố + Enzim dễ bị kết tủa yếu tố vật lý yếu tố hoá học vốn làm kết tủa protein + Apoenzim định tính đặc hiệu cao enzim làm tăng hoạt tính xúc tác coenzim + Coenzim định kiểu phản ứng mà enzim xúc tác, trực tiếp tham gia phản ứng làm tăng độ bền apoenzim yếu tố gây biến tính Từ ta thấy xúc tác enzim ƣu so với xúc tác hóa học 1.1.3 Các nhân tố ảnh hưởng tới hoạt tính enzim + Nhiệt độ: tốc độ phản ứng enzim chịu ảnh hƣởng nhiệt độ, enzim có nhiệt độ tối ƣu nhiệt độ enzim có hoạt tính cao Ví dụ: đa số enzim tế bào thể ngƣời hoạt động tối ƣu khoảng nhiệt độ nhƣng enzim vi khuẩn suối nƣớc nóng lại hoạt động tốt nhiệt độ cao Khi chƣa đạt đến nhiệt độ tối ƣu enzim gia tăng nhiệt độ làm tăng tốc độ phản ứng enzim,tuy nhiên qua nhiệt độ tối ƣu enzim gia tăng nhiệt độ làm giảm tốc độ phản ứng enzim bị hồn tồn hoạt tính + Độ pH: enzim có pH tối ƣu riêng Đa số enzim có pH tối ƣu từ - 8, có enzim hoạt động tối ƣu mơi trƣờng axit nhƣ pepsin hoạt động tối ƣu pH = + Nồng độ chất: Với lƣợng enzim xác định tăng dần lƣợng chất dung dịch đầu hoạt tính enzim tăng dần nhƣng đến lúc gia tăng nồng độ chất không làm tăng hoạt tính enzim Đó tất trung tâm hoạt động enzim đƣợc bão hoà chất + Nồng độ enzim: với lƣợng chất xác định nồng độ enzim cao tốc độ xẩy phản ứng nhanh Tế bào điều hồ tốc độ chuyển hố vật chất việc tăng giảm nồng độ enzim tế bào + Chất hoạt hóa ức chế: Hoạt tính enzim thay đổi dƣới tác dụng chất hoạt hóa ức chế Và ta sử dụng chất hoạt hóa hay ức chế để điều khiển phản ứng enzim Nguyên nhân tƣợng có dính líu tới trung tâm hoạt động enzim cấu trúc phân tử (nhất cấu trúc bậc 3) protein - enzim 1.1.4 Vai trò enzim q trình chuyển hố vật chất Nhờ enzim mà q trình sinh hố thể sống xảy nhanh với tốc độ lớn điều kiện sinh lý bình thƣờng Khi có enzim xúc tác, tốc độ phản ứng tăng hàng triệu lần Nếu tế bào khơng có enzim hoạt động sống khơng thể trì đƣợc tốc độ phản ứng sinh hố xảy chậm Tế bào tự điều chỉnh q trình chuyển hố vật chất để thích ứng với mơi trƣờng cách điều chỉnh hoạt tính loại enzim Một cách điều chỉnh hoạt tính enzim hiệu nhanh chóng sử dụng chất ức chế hoạt hoá enzim Các chất ức chế đặc hiệu liên kết với enzim làm biến đổi cấu hình enzim làm cho enzim liên kết đƣợc với chất, ngƣợc lại chất hoạt hoá liên kết với enzim làm tăng hoạt tính enzim Ức chế ngƣợc kiểu điều hồ sản phẩm đƣờng chuyển hoá quay lại tác động nhƣ chất ức chế, làm bất hoạt enzim xúc tác cho phản ứng đầu đƣờng chuyển hoá Khi enzim tế bào khơng đƣợc tổng hợp bị bất hoạt khơng sản phẩm khơng đƣợc tạo thành mà chất enzim bị tích luỹ lại gây độc cho tế bào đƣợc chuyển hố theo đƣờng phụ thành chất độc gây nên triệu chứng bệnh lý Các bệnh nhƣ ngƣời đƣợc gọi bệnh rối loạn chuyển hoá 1.1.5 Cơ chế tác dụng enzim Bản chất phản ứng enzim có tham gia xúc tác enzim, chất đƣợc hoạt hoá mạnh, làm thay đổi tính chất hố học chất kết sau phản ứng tạo sản phẩm phản ứng Dƣới tác dụng enzim chất không thay đổi cấu trúc hố học mà cịn thay đổi tính chất hố học Q trình xúc tác enzim xảy theo giai đoạn : + Giai đoạn : Enzim kết hợp với chất liên kết yếu nhờ tạo phức hệ enzim-cơ chất Phức hệ thƣờng không bền Phản ứng xảy nhanh địi hỏi lƣợng 10 Ở đây: d: Đƣờng kính vịng phân giải thời gian t1 = 24h D: Đƣờng kính vịng phân giải thời gian t2 = 72h Qua bảng 3.6 ta thấy RH = 75% đƣờng kính vịng phân giải lớn nhỏ RH = 25% Ta thể bảng qua biểu đồ 3.5 để thấy rõ sai khác duong kinh vong phan30 giai 25 20 RH = 25% 15 RH = 50% 10 RH = 75% RH = 100% d D Thoi gian Biểu đồ 3.5: So sánh hoạt tính enzim amylaza nhiệt độ, thời gian khác Qua biểu đồ ta thấy RH = 75% có chiều cao lớn thấp RH = 25% Trong độ ẩm nhƣng thời gian khác chiều cao khác nhau,cụ thể chiều cao 72h tăng lên nhiều so với 24h tốc độ tăng mạnh RH = 75% 3.4.1.3 Ảnh hưởng pH đến hoạt tính enzim Sau ni điều kiện pH khác xác định hoạt tính enzim thu đƣợc kết nhƣ bảng 3.7 46 Bảng 3.7: Hoạt tính enzim độ pH khác Thời gian pH Đƣờng kính vịng phân giải (h) d (mm) D (mm) 24 - 72 4,82 7,96 24 - 72 5,71 9,02 24 - 72 19,28 33,15 24 - 72 25,61 41,76 24 - 72 15,01 30,05 24 - 72 13,52 28,72 24 - 72 8,75 15,27 Ở đây: d: Đƣờng kính vịng phân giải thời điểm t1 = 24h D: Đƣờng kính vịng phân giải thời điểm t2 = 72h Qua bảng 3.7 ta thấy so với thời điểm t1 = 24h đƣờng kính vòng phân giải thời điểm t2 = 72h tăng lên nhanh đặc biệt độ pH = có tốc độ tăng nhanh nhất, tiếp pH = tăng chậm pH = Ta thể bảng qua biểu đồ 3.6 để thấy rõ sai khác 47 Duong kinh vong phan giai 45 40 35 pH = 30 pH = pH = 25 pH = 20 pH = 15 pH = pH = 10 d D Thoi gian Biểu đồ 3.6: So sánh hoạt tính enzim amylaza độ pH khác Qua biểu đồ ta thấy pH = đồ thị thời điểm sau 24h sau 72h có chiều cao lớn nhất, thấp pH = Trong độ pH nhƣng thời điểm khác đồ thị có chiều cao khác nhau, so với thời điểm 24h chiều cao đồ thị thời điểm 72h tăng lên nhiều 48 Từ chủng vi khuẩn Bacillus subtilis phân lập đƣợc tiến hành nghiên cứu hoạt độ amylaza mật độ khác Chúng tiến hành điều kiện tối thích (pH = 6, nhiệt độ 30oC, lƣợng chất (tinh bột tan 1%) = 5ml, mật độ vi sinh vật đƣợc pha loãng từ dịch ni cấy vi khuẩn có mật độ tƣơng ứng NTU pha loãng 2ml thời gian phản ứng thủy phân 30 phút) Kết thu đƣợc nhƣ sau: Bảng 3.8: Ảnh hưởng mật độ vi khuẩn Độ pha loãng Mật độ quang Hoạt độ (%) 10-2 34 92,65 10-3 22 88,64 10-4 17 85,36 10-5 12 79,17 10-6 75,22 10-7 50,28 10-8 37,51 Đối chứng 2,5 Kết cho thấy: - Khi mật độ vi khuẩn Bacillus subtilis giảm, hoạt tính enzim giảm dần - Với mật độ 10-7 (1 phần / 10 triệu) có hoạt tính cao (trên 50%) - Ở mật độ 10-2 (1/100) có hoạt tính cao - Các mật độ từ 10-6 -> 10-3 (1 phần / triệu -> phần / ngàn) hoạt tính 75% 49 Chứng tỏ hoạt tính enzim amylaza vi khuẩn Bacillus subtilis mạnh, điều thuận lợi sử dụng thực tiễn Càng nhiều vi khuẩn sản sinh nhiều enzim Biểu đồ sau thể rõ đƣợc điều ta vừa nhận xét hoat 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 10^-2 10^-3 10^-4 10^-5 10^-6 10^-7 10^-8 DC Do pha loang Biểu đồ 3.6: Hoạt độ enzim amylaza với mật độ vi khuẩn Ở đồ thị ta thấy: - Khi mật độ vi khuẩn giảm hoạt tính enzim giảm dần (chiều cao cột có tung độ giảm dần enzim hơn) - Do để sử dụng có hiệu khơng nên sử dụng vi khuẩn với mật độ thấp 50 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận (1) Vi khuẩn Bacillus subtilis nguồn thu nhận amylaza quan trọng Vi khuẩn phong phú, gam đất có tới 217 triệu vi khuẩn Vi khuẩn sinh tổng hợp, phát triển nhanh, thích ứng nhiệt độ, độ ẩm, pH rộng vô hại nên nguồn tài nguyên sinh vật quý cần khai thác + Nhiệt độ tối thích để vi khuẩn sinh trƣởng, phát triển 30oC + Độ ẩm tối thích để vi khuẩn sinh trƣởng, phát triển 75% + pH tối thích để vi khuẩn sinh trƣởng, phát triển pH=6 Đó sở để tối ƣu hố cơng nghệ ni cấy vi khuẩn có hiệu (2) Enzim amylaza Bacillus subtilis có hoạt tính mạnh Khi sử dụng vi khuẩn mật độ thấp (10-7) tức phần mƣời triệu có hoạt tính cao đối chứng (khơng có enzim) có hoạt tính cực đại (trên 92%) mật độ 10 -2 (1 phầm trăm) Nhƣ cho thấy có nhiều vi khuẩn có nhiều enzim đƣợc sản sinh thực tiễn ngƣời ta tính tốn mật độ phù hợp cho có hoạt tính tối đa để khơng dƣ vi khuẩn hay enzim gây lãng phí thƣơng phẩm (3) Hoạt tính enzim có thay đổi yếu tố môi trƣờng nhƣ nhiệt độ, pH, độ ẩm thay đổi Enzim có hoạt tính tối đa nhiệt độ 30oC, pH = 6, độ ẩm 75% Đây điều kiện để từ tới tối ƣu hóa cơng nghệ đƣa vào 51 thực tiễn (đƣờng hóa tinh bột cho cơng nghệ chế biến hay cơng nghiệp lên men, cho phân giải phế thải có tinh bột làm môi trƣờng…) Kiến nghị: (1).Do thời gian hạn chế trình thực đề tài nên chƣa thử nghiệm đƣợc hết yếu tố môi trƣờng ảnh hƣởng lên sinh trƣởng chung vi khuẩn Bacillus subtilis nhƣ: Cƣờng độ ánh sáng, nhân tố sinh trƣởng, chất khoáng (2) Enzim amylaza từ vi khuẩn Bacillus subtilis enzim đƣợc sử dụng nhiều lĩnh vực nên có điều kiện, thời gian, kinh phí cần sản xuất sinh khối vi khuẩn để cần thiết sử dụng vào thực tiễn sản xuất, đời sống xử lý môi trƣờng 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt: Nguyễn Liêu Ba cộng sự-2003 Đặc điểm sinh học số chủng Bacillus Lactobacillus có khả ứng dụng để xử lý môi trường nuôi tôm cá-Hội cơng nghệ sinh học tồn quốc NXB khoa học kĩ thuật Nguyễn Thị Trân Châu, Trần Thị Áng, 2000, Hoá sinh học Nguyễn Lân Dũng Phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học Nguyễn Lân Dũng cộng sự, 1978, Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh học NXB khoa học kĩ thuật Hà Nội Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đăng Đức-1975 Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học-tập NXB khoa hoch kĩ thuật Hà Nội Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty-2000 vi sinh vật học NXB giáo dục Nguyễn Thành Đạt Hướng dẫn thực hành vi sinh vật học NXB giáo dục Hà Nội Nguyễn Thành Đạt, Mai Thị Hằng-2001 Sinh học vi sinh vật NXB Giáo dục Trần Đình Mấn, Th Scheweder - 1999, Khả sinh tổng hợp đặc điểm ỏ - amylaza chịu nhiệt chủng vi khuẩn 3BT2, kỷ yếu hội nghị CNSH toàn quốc, Hà Nội 53 10 Nguyễn Thị Xuân Hiền Nghiên cứu khả chịu nhiệt bào tử enzim proteaza Bacillus subtilis 11 Nguyễn Văn Mùi-2002 Xác định hoạt độ enzim NXB khoa học kĩ thuật Hà Nội 12 Lƣơng Đức Phẩm, 1998, Vi sinh vật an toàn vi sinh thực phẩm 13 Lê Xuân Phƣơng Vi sinh vật học công nghiệp NXB Xây Dựng Hà Nội 14 Nguyễn Dƣơng Tuệ-2003 Thực tập lớn vi sinh vật học Đại học Vinh 15 Trần Cẩm Vân, 2001, giáo trình vi sinh học mơi trƣờng, ĐHQGHN 16 Bộ nơng nghiệp, 1979 Giáo trình vi sinh trồng trọt NXB nơng nghiệp Tài liệu tiếng nƣớc 17 Prof David B Frankhauer, Spectrophotometer University of Cincinati, 2003 18 Prof David B Frankhauer, Single colonyisolation, University of Cincinati, 2007 19 D R Kashyap, S Chandra, A Kaul, R Tewari Production, purification and characterization ofpectinase from a Bacillussp DT 20 KonsoulaZ., Kyriakides M.L ỏ-amylaza production in a aqueous two-phase sustenis by Bacillus subtilis 21 Zhi Ƣ., Song J., Bi J., and owyang F.,Partial purification of ỏamylaza from culture supernatant of Bacillus subtilis inaqueóu two-phase systems Các trang web 22 http://vi.wikibooks.org/wiki/Enzim 54 23 http://google.com.vn 24 http://choluanvan.com.vn 25 http://thuvienluanvan.com.vn PHỤ LỤC ẢNH 1- CỎC KHUẨN LẠC VI KHUẨN ẢNH 2-KHUẨN LẠC B.SUBTILIS 55 ẢNH 3- TIỜU BẢN B.SUBTILIS 56 MỤC LỤC Trang Mở đầu 1 Lý chọn đề tài 2 Mục tiêu đề tài Nhiệm vụ đề tài Chƣơng I Tổng quan tài liệu 1.1 Giới thiệu chung enzim 1.1.1 Định nghĩa 1.1.2 Đặc tính xúc tác enzim: 1.1.3 Các nhân tố ảnh hƣởng tới hoạt tính enzim 1.1.4 Vai trò enzim q trình chuyển hố vật chất 1.1.5 Cơ chế tác dụng enzim 10 1.1.6 Tính đặc hiệu enzim: 11 1.2 Enzim amylaza 13 1.2.1 Đặc điểm phân loại hệ enzim amylaza 13 1.2.2 Đặc điểm cấu tạo, chế tác dụng ỏ - amylaza 15 1.3 Tinh bột 16 1.3.1 Khái quát tinh bột 16 1.3.2 Cấu trúc tinh bột 17 1.3.3 Cơ chế trình phân giải tinh bột nhờ vi sinh vật: 19 1.4 Tình hình nghiên cứu giới 20 1.4.1 Vi khuẩn Bacillus subtilis 20 1.4.2 Enzim amilaza 22 1.5 Tình hình nghiên cứu Việt Nam 23 Chƣơng II Đối tƣợng, thời gian,và phƣơng pháp nghiên cứu 24 2.1 Đối tƣợng,địa điểm, thời gian nghiên cứu 24 2.1.1 Đối tƣợng nghiên cứu 24 2.1.2 Địa điểm nghiên cứu 24 2.1.3 Thời gian nghiên cứu 24 57 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 24 2.2.1 Phƣơng pháp thu mẫu, xử lý bảo quản mẫu 24 2.2.2 Phƣơng pháp nuôi cấy phân lập vi khuẩn 25 2.2.3 Phƣơng pháp xác định số lƣợng vi khuẩn Baccillus subtilis (phƣơng pháp CFU phƣơng pháp đo độ đục) 25 2.2.4 Phƣơng pháp xác định tốc độ sinh trƣởng theo Blackman (1981) 26 2.2.5 Phƣơng pháp quan sát tế bào vi khuẩn Bacillus subtilis 30 2.2.6 Phƣơng pháp nghiên cứu ảnh hƣởng nhiệt độ đến sinh trƣởng, phát triển vi khuẩn Bacillus subtilis .30 2.2.7 Phƣơng pháp nghiên cứu ảnh hƣởng pH đến sinh trƣởng, phát triển vi khuẩn Bacillus subtilis .30 2.2.8 Phƣơng pháp nghiên cứu ảnh hƣởng độ ẩm đến sinh trƣởng, phát triển vi khuẩn Bacillus subtilis .30 2.2.9 Phƣơng pháp thử nghiệm hoạt tính enzim amilaza lên chất 30 Chƣơng III Kết nghiên cứu thảo luận 33 3.1 Đặc điểm vi khuẩn bacillus subtilis 33 3.2 Số lƣợng vi khuẩn Bacillus subtilis 34 3.3 Kết nghiên cứu yếu tó ảnh hƣởng đến sinh trƣởng, phát triển vi khuẩn 36 3.3.1 Ảnh hƣởng nhiệt độ 36 3.3.2 Ảnh hƣởng độ ẩm 38 3.3.3 Ảnh hƣởng pH 40 3.4 Kết xác định hoạt tính enzim amylaza 43 3.4.1 Xác định hoạt tính dựa vào đƣờng kính vòng phân giải 43 Kết luận kiến nghị 50 Tài liệu tham khảo 53 Phụ lục 55 58 MỤC LỤC CÁC BẢNG SỐ LIỆU Trang Bảng 3.1 : Số lƣợng vi khuẩn Bacillus subtilis mơi trƣờng Czapeck độ pha lỗng khác 34 Bảng 3.2 : Ảnh hƣởng nhiệt độ đến sinh trƣởng, phát triển 36 Bảng 3.3: Ảnh hƣởng độ ẩm đến sin htrƣởng, phát triển vi 39 Bảng 3.4: Ảnh hƣởng pH đến sinh trƣởng, phát triển vi 41 Bảng 3.5: Hoạt tính enzim điều kiện nhiệt độ khác nhau: 44 Bảng 3.6 : Hoạt tính enzim điều kiện độ ẩm khác 45 Bảng 3.7: Hoạt tính enzim độ pH khác 47 Bảng 3.8: Ảnh hƣởng mật độ vi khuẩn 49 59 MỤC LỤC CÁC BIỂU ĐỒ Trang Biểu đồ 3.1: So sánh tốc độ sinh trƣởng vi khuẩn Bacillus subtilis38 Biểu đồ 3.2: So sánh sinh trƣởng vi khuẩn Bacillus subtilis 40 Biểu đồ 3.3: So sánh sinh trƣởng vi khuẩn Bacillus subtilis 43 Biểu đồ 3.4: So sánh hoạt tính enzim amylaza điều kiện nhiệt 45 Biểu đồ 3.5: So sánh hoạt tính enzim amylaza nhiệt độ, thời 46 Biểu đồ 3.6: So sánh hoạt tính enzim amylaza độ pH khác 48 Biểu đồ 3.6: Hoạt độ enzim amylaza với mật độ vi khuẩn 50 60 ... Vi? ??t Nam có hãng liên doanh với Mỹ sản xuất sinh khối vi khuẩn phục vụ cơng nghệ lên men, xử lý mơi trƣờng Vì tiến hành nghiên cứu đề tài: ? ?Tìm hiểu hoạt tính enzim amilaza vi khuẩnBacillus subtilis? ??... enzim loài mà định danh, phân tách phân loại vi khuẩn Chọn vi khuẩn Bacillus subtilis loại đƣợc ý đặc biệt để sản xuất enzim 1.1.2 Đặc tính xúc tác enzim: Enzim có đặc tính chung nhƣ sau: + Enzim. .. lƣợng vi khuẩn Bacillus subtilis Xác định số lƣợng vi khuẩn Bacillus subtilis cần thiết : - Cho thấy phong phú vi khuẩn nằm đất - Xác định số lƣợng cần thiết để nghiên cứu enzim nhƣ hoạt động enzim